[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体涉及恒温扩增试剂及其应用。

[0002] 实时荧光PCR是基于PCR技术的一种定量检测核酸的扩增方法，可以通过添加荧光物质或使用分子信标来实时监测扩增反应。荧光信号的积累可以反映靶DNA或RNA逆转录产物的扩增。实时荧光PCR需要精密的温度控制，离不开专业的仪器设备，且通常整个扩增过程需要1～2小时，不适合现场快速检测。

[0003] 针对此局限性，恒温扩增技术逐渐备受体外诊断产品研发或科研人员的青睐。恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火，在恒温条件下进行核酸的扩增。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的恒温扩增诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，与其他的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点，且无需反复变温，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。

[0004] 但目前，恒温扩增的扩增效率还有待提高，需要开发具有更高扩增效率的恒温扩增的体系和与其配套的方法。

[0058] 本发明提供了恒温扩增试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0059] 甲型流感病毒H7N9亚型病毒慢病毒质控品中甲型流感病毒H7N9亚型核酸片段：

[0060] gtttcagatggagggccaaacctgtacaatatccggaacctccacattccagaggtctgcttgaaatgggaattgatggatgaagactaccaaggcaggttgtgtaatcctatgaacccgtttgtcagtcataaggaaattgattcagtcaacaatgctgtggtgatgccagctcatggcccagccaaaagcatggagtatgatgccgttgcaaccacacattcatggattcctaagaggaatcgctccattctcaacaccagccaaagggggattcttgaggacgaacagatgtaccagaagtgctgcaacctattcgaaaagttcttccccagcagttcgtacaggaggccagttggaatttccagcatggtggaggccatggtgtctagggcccgaattgatgcacgaattgacttcgaatctggaaggattaagaaagaagagtttgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagctcagacggcaaaaatagtgaatttagcttgtccttcatgatgaatccaaatcagaagattctatgcacttcagccactgctatcataataggcgcaatcgcagtactcattggaatggcaaacctaggattgaacataggactgcatctaaaaccgggctgcaattgctcacactcacaacctgaaacaaccaacacaagccaaacaataataaacaactattataatgaaacaaacatcaccaacatccaaatggaagagagaacaagcaggaatttcaataacttaactaaagggctctgtactataaattcatggcacatatatgggaaagacaatgcagtaagaattggagagagctcggatgttttagtcacaagagaaccctatgtttcatgcgacccagatgaatgcaggttctatgctctcagccaaggaacaacaatcagagggaaacactcaaacggaacaatacacgataggtcccagtatcgcgccctgataagctggccactatcatcaccgcccacagtgtacaacagcagggtggaatgcattgggtggtcaagtactagttgccatgatggcaaatccaggatgtcaatatgtatatcaggaccaaacaacaatgcatctgcagtagtatggtacaacagaaggcctgttgcagaaattaacacatgggcccgaaacatactaagaacacaggaatctgaatgtgtatgccacaacggcgtatgcccagtagtgttcaccgatgggtctgccactggacctgcagacacaagaatatactattttaaagaggggaaaatattgaaatgggagtctctgactggaactgctaagcatattgaagaatgctcatgttacggggaacgaacaggaattacctgcacatgcagggacaattggcagggctcaaatagaccagtgattcagatagacccagtagcaatgacacacactagtcaatatatatgcagtcctgttcttacagacaatccccgaccgaatgacccaaatataggtaagtgtaatgacccttatccaggtaataataacaatggagtcaagggattctcatacctggatggggctaacacttggctagggaggacaataagcacagcctcgaggtctggatacgagatgttaaaagtgccaaatgcattgacagatgatagatcaaagcccattcaaggtcagacaattgtattaaacgctgactggagtggttacagtggatctttcatggactattgggctgaaggggactgctatcgagcgtgtttttatgtggagttgatacgtggaagacccaaggaggataaagtgtggtggaccagcaatagtatagtatcgatgtgttccagtacagaattcctgggacaatggaactggcctgatggggctaaaatagagtacttcctctaa(SEQ ID NO:18)。

[0061] 甲型流感病毒慢病毒质控品中甲型流感病毒(不分型)包装核酸片段：

[0062] tgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcattccatcaggccccctcaaagccgagatcgcacagagacttgaggatgtttttgcagggaagaacgcagatctcgaggctctcatggagtggataaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttagggtttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacggtttgtccaaaacgccctaaatgggaatggagacccaaacaacatggacaaggcggttaaattatacaagaaactgaagagggaaatgacatttcatggagcaaaggaagttgcactcagttactcaactggtgcgcttgccagctgcatgggtctcatatacaacagaatggggactgtgaccgcagaaggggctcttggactagtatgtgccacttgtgagcagattgctgacgcacaacatcggtcccacaggcagatggcgactactactaacccactaattaggcatgagaatagaatggtactagccagcactacggctaaggctatggagcagatggctggatcaagtgaacaggcagcggaagccatggaagttgcaagtcaggctaggcaaatggtgcaggctatgagaacagttgggactcaccctaactccagtacaggtctaaaagatgatcttattgaaaatttgcaggcctaccagaaccggatgggagtgcaactgcagcggttcaagtgagcctctagtcgttgcagctaacattattgggatattgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttttcttcaaatgcatttatcgtcgttttaaatacggtttgaaaagagggccttctacggaaggaatgcctgagtctatgagggaagaatatcggcaggaacagcagaatgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagagctgaagtaaaaa(SEQ ID NO:19)。

[0063] 乙型流感病毒慢病毒质控品中乙型流感病毒慢病毒核酸片段：

[0064] tgctaccttcaactatacaaacgttaaccctatttctcacatcagggggagtattattatcactatatgtgtcagcttcattatcatacttactatattcggatatattgctaaaattctcaccaacagaaataactgcaccaacaatgccattggattgtgcaaacgcatcaaatgttcaggctgtgaaccgttctgcaacaaaaggggtgacacttcttctcccagaaccggagtggacatacccgcgtttatcttgcccgggctcaacctttcagaaagcactcctaattagccctcatagattcggagaaaccaaaggaaactcagctcccttgataataagggaaccttttgttgcttgtggaccaaatgaatgcaaacactttgctttaacccattatgcagcccaaccagggggatactacaatggaacaagaggagacagaaacaagctgaggcatctaatttcagtcaaattgggcaaaatcccaacagtagagaactccattttccacatggcagcatggagcgggtccgcgtgccatgatggtaaggaatggacatatatcggagttgatggccctgacaataatgcattgctcaaagtaaaatatggagaagcatatactgacacataccattcctatgcaaacaacatcctaagaacacaagaaagtgcctgcaattgcatcgggggaaattgttatctaatgataactgatggctcagcttcaggtgttagtgaatgcagatttcttaagattcgagagggccgaataataaaagaaatatttccaacaggaagagtaaaacacactgaggaatgcacatgcggatttgccagcaataaaaccatagaatgtgcctgtagagacaacaggtacacagcaaaaagaccttttgtcaaattaaacgtggagactgatacagcagaaataaggttgatgtgcacagatacttatttggacacccccagaccaaatgatggaagcataacaggcccttgtgaatctgatggggacaaagggagtggaggcatcaagggaggatttgttcatcaaagaatgaaatccaagattggaaggtggtactctcgaacgatgtctaaaactgaaaggatggggatgggactgtatgtcaagtatggtggagacccatgggctgacagtgatgccctagcttttagtggagtaatggtttcaatgaaagaacctggttggtattcctttggcttcgaaataaaagataagaaatgcgatgtcccctgtattgggatagagatggtacatgatggtggaaaagagacttggcactcagcagcaacagccatttactgtttaatgggctcaggacagctgctgtgggacactgtcacaggtgttgacatggctctgtaa(SEQ ID NO:20)。

[0065] 本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

[0066] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0067] 实施例1恒温扩增试剂及其应用

[0068] 一、实验方案

[0069] 1、试剂

[0070] 本发明中的恒温扩增(Isothermal Amplification，以下简称IA)包含逆转录(Reverse Transcription，以下简称RT)与恒温扩增。

[0071] RT‑IA分为2种组份，即Buffer预混液与酶预混液。

[0072] Buffer预混液包含80mM Tris‑HCl(pH 8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μL BSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0～0.1(w/v)％海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0～0.6μM增强引物、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、
0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，特异性引物序列详见表1。

[0073] 表1.引物序列

[0074]

[0075] 酶预混液包含20U/μL逆转录酶、500ng/μL聚合酶、700ng/μL重组酶蛋白、885ng/μL单链结合蛋白、200ng/μL重组酶蛋白辅助蛋白、500ng/μL肌酸激酶、1U/μL RNA酶抑制剂、2U/μL Exonuclease III。

[0076] 2、具体检测流程为

[0077] (1)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有甲型(SEQ ID NO：19)或乙型流感病毒部分核酸片段(SEQ ID NO：20)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至100拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0078] (2)使用移液枪取30μL的Buffer预混液、10μL步骤(1)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净离心管或八连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序如表2：

[0079] 表2.扩增程序

[0080] 温度 时间 循环数 收集荧光37℃ 1min 20 √

[0081] 二、条件探索

[0082] 1、增强引物的影响

[0083] 1.1增强引物浓度的影响

[0084] (1)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有甲型流感病毒H7N9亚型部分核酸片段(SEQ ID NO：18)或乙型流感病毒部分核酸片段(SEQ ID NO：20)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至100拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0085] (2)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH 8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μL BSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0.5μM恒温扩增引物、0～0.6μM甲型流感病毒H7N9亚型核酸恒温扩增增强引物R2(或0～0.6μM乙型流感病毒核酸恒温扩增增强引物)、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，特异性引物序列详见表1，再取10μL步骤(1)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序同表2。

[0086] 表3.增强引物浓度的影响

[0087]

[0088] 结果如表3和图1所示，在恒温扩增体系中添加增强引物，结果显示流感病毒RNA片段的扩增产物信号随增强引物浓度增加而上升，H7N9亚型检测体系的增强引物浓度达到0.3μM时，增强效果最佳，相较于未添加组的信号提升约31％，乙流检测体系为0.2μM，相较于未添加组的信号提升约42％，检测信号均显著提升(P＜0.05)。当浓度高于0.5μM，扩增效率将受到影响，可能是逆转录过程竞争体系中的镁离子，影响了恒温扩增效率。因此针对流感病毒的RNA恒温扩增检测的增强引物，其使用浓度范围为0～0.5μM，最优为0.2～0.3μM。

[0089] 1.2增强引物的有无对乙型流感病毒检测的影响

[0090] (1)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有乙型流感病毒部分核酸片段(SEQ ID NO：20)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至10拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0091] (2)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH 8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μLBSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0.05(w/v)％海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0～0.3μM增强引物、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，再取10μL步骤(1)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序同表2，验证增强引物是否对其他RNA病毒核酸的恒温扩增有同样促进作用。

[0092] 表4.增强引物对乙型流感病毒检测的影响

[0093]慢病毒(拷贝/μL) 无增强引物 0.3μM增强引物
1000 281483 321589
100 165483 195680
10 62159 82014
NTC 20147 23549

[0094] 结果如表4和图2所示，结果表明与不添加增强引物的检测结果相比，添加了0.3μM增强引物的检测信号提升显著(P＜0.05)，低拷贝靶标(10拷贝/μL)的检测信号提升了约32％，表明增强引物有利于低浓度乙型流感病毒核酸的恒温扩增检测信号与灵敏度的提升。

[0095] 1.3增强引物的有无对甲型流感病毒(不分型)核酸检测的影响

[0096] (1)在NCBI上根据不同亚型、宿主、地区等下载甲型流感病毒核酸序列，使用DNAMAN序列查看软件进行序列比对后，根据保守区域序列设计恒温扩增引物，并根据下游引物序列设计增强引物，引物序列详见表1；

[0097] (2)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有不分型甲型流感病毒部分保守区域核酸片段(SEQ ID NO：19)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至10拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0098] (3)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μLBSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0.05(w/v)％海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0～0.3μM增强引物、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，再取10μL步骤(2)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序同表2，验证甲型流感病毒(不分型)核酸扩增的增强引物是否有同样促进作用。

[0099] 表5.增强引物对甲型流感病毒(不分型)核酸检测的影响

[0100] 慢病毒(拷贝/μL) 无增强引物 0.3μM增强引物1000 215248 235602
100 132698 160083
10 39874 46517
NTC 23689 20057

[0101] 结果如表5和图3，甲型流感病毒不分型检测结果显示与不添加增强引物的检测结果相比，添加了0.3μM增强引物的检测信号稍有提升，但统计学分析结果为不显著(P＞0.05)，低拷贝靶标(10拷贝/μL)的检测信号提升了约16％，高拷贝靶标(1000拷贝/μL)的检测信号提升了约9％。甲型流感病毒核酸序列突变位点多，保守区域有限，恒温扩增引物设计与扩增条件较苛刻，因此可能限制了扩增引物与增强引物的设计和筛选，但增强引物可以通过提高逆转录效率来提升RNA病毒核酸恒温扩增的检测信号，因此可以通过设计并添加增强引物的方式来提高低浓度丰度的RNA病毒检测信号或灵敏度。

[0102] 1.4增强引物位置的影响

[0103] 核酸的低温恒温扩增是一个复杂的反应过程，恒温扩增引物较长且设计要求较高，扩增效率提升受限，增强引物的设计与添加可提高扩增效率。增强引物与恒温扩增下游引物的部分序列相同，但序列长度短于扩增引物，且不参与cDNA的扩增，不与恒温扩增引物发生竞争。不同位置的增强引物的效果不同，测试步骤如下所示：

[0104] 1.4.1增强引物位置对甲型流感病毒H7N9亚型和不分型甲型流感病毒恒温扩增的影响

[0105] (1)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有甲型流感病毒H7N9亚型部分核酸片段(SEQ ID NO:18)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至100拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0106] (2)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μL BSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0.05(w/v)％海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0.3μM增强引物(R1～R4引物位置见图4)、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，特异性引物序列详见表格，再取10μL步骤(1)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为
50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序同表2。

[0107] 表6.增强引物的位置设计对恒温扩增的影响

[0108]

[0109] 结果如表6和图5，增强引物的位置设计对恒温扩增效率的提升有一定的影响，结果显示针对H7N9亚型的恒温扩增，其增强引物R2的增益效果最佳，相较于未添加组的信号提升约为21％。针对不分型的甲型流感病毒核酸检测的最优增强引物为R3，相较于未添加组的信号提升约为40％。根据结果趋势可以推断出，增强引物越靠近恒温扩增下游引物的3’端，促进效果越有所下降或可能无促进作用，不宜超出5’端的序列，最优为增强引物的5’端距离恒温扩增下游引物的5’端约0～8个碱基，长度为18～22nt。

[0110] 2、海藻酸钠对恒温扩增的影响

[0111] 2.1甲型流感病毒H7N9亚型的影响

[0112] (1)在NCBI上根据甲型流感病毒H7N9亚型的不同宿主和地区等信息下载核酸序列，使用DNAMAN序列查看软件进行序列比对后，根据保守区域序列设计恒温扩增引物，并根据下游引物序列设计增强引物，引物序列详见表1；

[0113] (2)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有甲型流感病毒H7N9亚型部分核酸片段(SEQ ID NO：18)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至100拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0114] (3)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH 8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ng/μL BSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0～0.1(w/V)％海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0.3μM增强引物R2、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，特异性引物序列详见表格，再取10μL步骤(2)的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序如表2，海藻酸钠对甲型流感病毒H7N9亚型扩增的影响如表7和图6。

[0115] 表7.海藻酸钠对甲型流感病毒H7N9亚型扩增的影响

[0116] 海藻酸钠(％) 荧光值0.00 357102
0.02 330639
0.03 378776
0.05 430694
0.06 418097
0.08 366528
0.09 183833
0.10 66532

[0117] 海藻酸钠的影响测试结果显示，当海藻酸钠的浓度为0.03(w/v)％～0.08(w/v)％时，对恒温扩增有一定的促进作用，可以显著提高检测信号(P＜0.05)，最优为0.05(w/v)％，相较于未添加组的信号提升约20％，当浓度超过0.08(w/v)％将发生严重的抑制作用，降低扩增反应效率，产物产量大幅降低。

[0118] 2.2海藻酸钠对乙流基因检测的影响

[0119] (1)根据乙型流感病毒核酸保守区域序列设计恒温扩增引物，并根据下游引物序列设计增强引物，引物序列详见表1；

[0120] (2)使用样本释放剂(购自圣湘生物，货号为S1014)将包装有乙型流感病毒部分核酸片段(SEQ ID NO：20)的慢病毒质控品以10倍梯度稀释至100拷贝/μL的浓度，以稀释无酶水作为阴性对照，慢病毒质控品由复百澳生物医药科技有限公司合成包装并定量，室温下(24～30℃)放置5分钟释放核酸，获得裂解产物；

[0121] (3)使用移液枪取30μL的Buffer预混液，包含80mM Tris‑HCl(pH 8.0)、110mM乙酸钾、5mM DTT、5mM ATP、130mM磷酸肌酸、1mM dNTP、50ne/μLBSA、8.3(w/v)％PEG8000、300mM甜菜碱、0～0.1％(w/v)海藻酸钠、0.5μM恒温扩增引物、0.3μM增强引物、0.2μM探针、0.1μM随机引物(6nt)、0.1μM随机引物(8nt)、15mM乙酸镁，特异性引物序列详见表格，再取10μL，2的裂解产物以及10μL酶预混液于同一干净8连管中，终体积为50μL，混匀后使用ABI7500收集荧光信号，程序同表2，结果如表8和图7。

[0122] 表8.海藻酸钠对乙流基因扩增的影响

[0123] 海藻酸钠(％) 荧光值0.00 183687
0.02 203698
0.03 215873
0.05 240369
0.06 235871
0.08 201587
0.09 165332
0.10 90024

[0124] 海藻酸钠对乙流基因扩增的影响结果显示，当海藻酸钠的浓度低于0.08(w/v)％时，可以显著提升乙流基因的恒温扩增效率(P＜0.05)，最优为0.05(w/v)％，相较于未添加组的信号提升约30.8％，当浓度超过0.08(w/v)％将发生严重的抑制作用，降低扩增反应效率，产物产量大幅降低。因此针对流感病毒核酸的恒温扩增检测体系中，当恒温扩增体系中海藻酸钠浓度低于0.08(w/v)％时，可以提高扩增效率，有利于提升检测性能，最优为0.05(w/v)％。

[0125] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。