[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种核酸扩增技术，尤其涉及一种重组酶转录酶介导的等温扩增技术。

[0002] 核酸扩增检测是通过酶的作用将待检核酸序列进行扩增，然后检出的方法。主要包括聚合酶链反应、聚合酶链反应直接测序、原位聚合酶链反应和端粒重复序列扩增法。核
酸的等温扩增是一个简单的过程，可以在恒定温度下快速有效地积累核酸序列。现有已开
发出各种等温扩增技术来替代聚合酶链反应(PCR)。这些等温扩增方法已用于生物传感目
标，例如DNA，RNA，细胞，蛋白质，小分子和离子。这些技术在原位或细胞内生物成像和测序中的应用已得到充分证明。

[0003] 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)在病原体检测、合成生物学等研究中发挥着重要作用，现已广泛应用于临床。但PCR技术依赖价格高昂的核酸扩增仪，难
以用于基层和现场即时检测。恒温扩增技术的出现利于基层和现场即时检测的进一步发
展。目前涉及的恒温扩增技术主要包括链置换扩增、滚环扩增、环介导等温扩增等技术。然
而，这些技术要么所需的温度相对较高(50～60℃)，要么需要起始加热步骤。重组酶聚合酶
扩增(RPA)技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37～42℃条件下实现待
测靶标的快速检测，但RPA的恒温范围有限，检出限限制等问题仍亟待解决。

[0136] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

[0137] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

[0138] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细说明本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0139] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

[0140] 实施例1重组酶转录酶介导的等温扩增技术的原理

[0141] 重组酶转录酶介导的等温扩增(RTMA,Recombinase‑transcription mediated amplification)技术利用含高特异性转录启动子的引物、相应的RNA聚合酶、RNase和逆转
录酶，持续扩增模板，为重组酶聚合酶扩增(RPA)提供持续的模板，提升扩增效率10倍以上。
尤其对低拷贝底物的扩增效果尤为突出。

[0142] 本实施例以SP6启动子‑RNA聚合酶、重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY、单链结合蛋白GP32、DNA聚合酶Bsu、逆转录酶MMLV为例对RTMA技术的技术原理进行简单解释。

[0143] 如图1A所示，当模板为双链DNA时，在UvsX/UvsY/GP32/Bsu作用下，分别以带启动子序列的上游引物(Primer#1)和不带启动子序列的下游引物(Primer#2)进行2轮扩增，得
到可用做SP6 RNA聚合酶转录模板的中间产物1(Intermediate①)，得到众多RNA链的中间
产物2(Intermediate②)。M‑MLV逆转录酶以中间产物2为模板，逆转录合成DNA·RNA杂合链
的中间产物3(Intermediate③)。而重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY可将中间产物3中杂
合的DNA和RNA分开，接着以其中的DNA为模板，沿着上游引物得到中间产物4(Intermediate
④)。中间产物4实际上与UvsX/UvsY/GP32/Bsu作用下的中间产物1一致，再经过一轮扩增后
即可得到中间产物1。

[0144] 在上述循环中，所得DNA·RNA杂合链的中间产物3为UvsX/UvsY/GP32/Bsu扩增提供了额外的模板，实现了中间产物4的积累，从而大大提高了扩增效率。

[0145] 如图1B所示，当模板为RNA时，需要额外的使用M‑MLV逆转录酶进行逆转录过程后才能进行如图1所示的UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增。

[0146] 本专利中以SP6噬菌体的启动子、RNA聚合酶、重组酶UvsX、重组酶辅助蛋白UvsY、单链结合蛋白GP32、DNA聚合酶Bsu、逆转录酶M‑MLV为例探究了该技术的细节，但技术本身
涵盖的范围更广，重组酶转录酶介导的等温扩增体系覆盖范围如表1所示。

[0147] 表1、重组酶转录酶介导的等温扩增体系覆盖范围

[0148]

[0149]

[0150] 实施例2以SP6噬菌体的启动子‑RNA聚合酶，UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增体系

[0151] SP6噬菌体的启动子‑RNA聚合酶，UvsX/UvsY/GP32/Bsu循环扩增体系的体系范围如表2所示。

[0152]

[0153]

[0154] 表2体系总体积为50μL，不足部分用超纯水补充。所用引物、模板序列见表3。

[0155] 表3引物、模板序列信息

[0156]

[0157]

[0158] 实施例3循环扩增体系中各组分对扩增的影响

[0159] 1、实验方法

[0160] 1)琼脂糖凝胶电泳检测反应终点

[0161] 在PCR仪上37℃保温30min后再56℃保温3min。用DEPC水稀释一定倍数，再与6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)按比例混合后上样，2％琼脂糖凝胶，Marker使用DNA 
Marker I(天根，货号MD101，600bp‑100bp)，电压100V，40min后取出在紫外灯下观察。

[0162] 2)SYBR Green I染料对反应过程的监测

[0163] SYBR Green I染料(索莱宝，货号SR4110)终浓度为0.2×‑1×。反应时间30min，在497nm处每30s读取一次荧光，使用博日FQD‑96X荧光定量检测系统监测。

[0164] 2、实验体系及实验结果

[0165] 2.1RNAP对扩增的影响

[0166] 2.1.1不同来源的启动子‑RNAP对DNA扩增的影响

[0167] 分别以VP2‑F、VP2‑F‑T3、VP2‑F‑T7、VP2‑F‑SP6、VP2‑F‑T5、VP2‑F‑K1E为上游引物，按25U/RXN添加相应的RNAP，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶
上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图2所示。

[0168] 使用ImageJ软件测量电泳图各条带辉度，结果显示，几个样品的荧光强度比约为1:2.9:5:5.8:3.1:1.4(None:T3:T7:SP6:K1E:T5)，不同来源的启动子‑RNAP对扩增均有一
定的提升效果，其中SP6来源的启动子‑RNAP对扩增的提升效果最明显，可将扩增量提升5.8
倍；其次则是T7来源的启动子‑RNAP，可将扩增量提升5倍。

[0169] 2.1.2SP6 RNAP对DNA扩增的影响

[0170] 在2.1.1基础上，以VP2‑F‑SP6为上游引物，按0,25,50,100U/RXN添加SP6RNAP，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸
钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、
RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳
后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图3所示。

[0171] 结果显示，随着SP6 RNAP添加量的升高，DNA扩增量有显著的提升。根据实验结果，启动子‑RNAP体系可将扩增效率提高15倍以上。

[0172] 2.1.3SP6 RNAP对RNA扩增的影响

[0173] 在2.1.1与2.1.2基础上，以VP2‑F‑SP6为上游引物，按0,25,50,100U/RXN添加SP6 RNAP，以Canine parvovirus VP2 RNA片段为模板，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)
10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 
300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电
泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图4所示。

[0174] 结果显示，随着SP6 RNAP添加量的升高，RNA扩增量有显著的提升。与DNA扩增相比，低添加量(25U/RXN)的SP6 RNAP使RNA扩增显著增加，但后续的随着RNAP添加量的增加，
其扩增效果的提升量低于DNA扩增。

[0175] 2.2重组酶UvsX对扩增的影响

[0176] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按37.5,75,150,300,600ng/μL的浓度添加UvsX，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾
50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳
后，取出在紫外灯下观察并分析，结果如图5所示。

[0177] 结果显示，UvsX浓度为300ng/μL时，扩增效果最优，此时c(UvsX):c(UvsY)＝3:1，此时两者的摩尔量之比约为1:1。

[0178] 2.3重组酶UvsX与重组酶辅助蛋白UvsY的比例对扩增的影响

[0179] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，UvsX与UvsY的浓度比分别设置为6:1,5:1,4:1,3:1,2:1。具体浓度为c(UvsX):c(UvsY)＝300:50,
300:60:300:75,300:100,300:150，单位为ng/μL。其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)
10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、GP32 
300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 
50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×
Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析，结果如图6所示。

[0180] 结果显示，c(UvsX):c(UvsY)在6:1～2:1范围内，均有明显的扩增，其中，UvsX浓度为300ng/μL时，UvsY浓度为100ng/μL时，扩增效果最优，此时c(UvsX):c(UvsY)＝3:1，此时两者的摩尔量之比约为1:1。

[0181] 2.4单链结合蛋白SSB对扩增的影响

[0182] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按75,150,300,600,1000ng/μL的浓度添加SSB，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾
50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳
后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图7所示。

[0183] 结果显示，GP32浓度为300ng/μL时，扩增效果最优。

[0184] 2.5DNA聚合酶Bsu对扩增的影响

[0185] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按6.25,12.5,25,50,100ng/μL的浓度添加Bsu，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾
50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、ATP 10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 
50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×
Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图8所示。

[0186] 结果显示，Bsu浓度为100ng/μL时，扩增效果较好，随着添加量的提升，扩增量没有明显提升。

[0187] 2.6ATP对扩增的影响

[0188] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按6.25,12.5,25,50,100ng/μL的浓度添加Bsu，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)10mM、醋酸钾
50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K 5％(w/w)、dNTPs200μM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32 300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳
后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图9所示。

[0189] 结果显示，ATP浓度为10mM时，扩增效果最佳，随着添加量的提升，扩增量反而下降。

[0190] 2.7逆转录酶对扩增的影响

[0191] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按62.5,125,250,500,100U/RXN的浓度添加逆转录酶M‑MLV，其余组分添加量为Tris‑HCl(pH8.0)
10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 10mM、UvsX 
300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 50U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM、模板50copies/RXN，用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压100V、40min电泳
后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图10所示。

[0192] 结果显示，逆转录酶浓度为1000U/RXN时，扩增效果较好，随着添加量的提升，扩增量没有明显提升。

[0193] 2.8模板量对扩增的影响

[0194] 该项检测用两种手段观察，一是利用琼脂糖凝胶电泳观察终点扩增效果；二是利用SYBR GREEN I染料观察其扩增过程(荧光强度与双链DNA的量呈正比)。

[0195] 2.8.1琼脂糖凝胶电泳观察终点扩增效果

[0196] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按0,0.1,2 3 4 5 6 7
1,10,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 拷贝/RXN的量添加模板，其余组分添加量为Tris‑HCl
(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 
10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 
50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM。用DEPC水补充至50μL，将配置好的反应液置于PCR管中，于37℃反应30min。反应结束后，反应物用DEPC水稀释5倍，按比例加入6×Loading Buffer(TAKARA，货号9156)，2％琼脂糖凝胶上样，电压
100V、40min电泳后，取出在紫外灯下观察并分析。结果如图11所示。

[0197] 2.8.2SYBR GREEN I染料观察扩增过程

[0198] 以VP2‑F‑SP6为上游引物，以Canine parvovirus VP2 DNA片段为模板，按0,0.1,2 3 4 5 6 7
1,10,10 ,10 ,10 ,10 ,10 ,10 拷贝/RXN的量添加模板，其余组分添加量为Tris‑HCl
(pH8.0)10mM、醋酸钾50mM、醋酸镁10mM、DTT 1mM、PEG35K5％(w/w)、dNTPs 200μM、ATP 
10mM、UvsX 300ng/μL、UvsY 100ng/μL、GP32300ng/μL、Bsu DNA聚合酶100ng/μL、SP6 RNAP 
50U/RXN、M‑MLV逆转录酶250U/RXN、RNasin 50U/RXN、CK 1ng/μL、PC 200mM。此外，反应体系还需加入SYBR Green I染料至染料终浓度为0.2×‑1×，最后用DEPC水补充至50μL，将配置
好的反应液置于PCR管中，于荧光定量检测仪中37℃反应30min。在497nm处每30s读取一次
荧光，使用博日FQD‑96X荧光定量检测系统监测。结果如图12所示。

[0199] 结果显示，本技术的最低检测限低至1copy/RXN，具有较高的灵敏度。

[0200] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进
和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。