技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体是一种恒温扩增核酸的方法。
相关背景技术
[0002] 核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，自1869年被人类首次发现以来，许多研究者在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸提取的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲、盐酸胍等各种各样的化学试剂被纷纷应用到核酸提取实验中。然而，传统的核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本，而且传统提取技术步骤较为繁杂，费时长，收率低，很难实现自动化操作，大部分方法还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂，因此，随着分子生物学以及高分子材料学的快速发展，传统的从液相系统中分离提取核酸的方式逐渐被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。这类新兴的核酸分离提取方法主要包括：旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法等。不管是采用具体的哪种方法来分离和提取核酸，总的来说，这类方法的操作步骤主要可以分为三个部分，第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上，并且这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不能具有亲和力和吸附力。第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。离心柱法提取核酸曾经应用得很普及，市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在离心柱法的基础上发展而来的。该方法采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA，然而这种方法的缺点是样本需求量大，耗费样品较多，对于某些珍稀样本其应用受到很大的局限，同时离心柱法提取核酸需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，特别是在基因诊断、突发疫情的监测和控制等领域，使用离心柱法提取核酸需要大量的操作人员及仪器设备才能满足需求。
[0003] 目前有很多针对病毒的一步法核酸提取方法，如CN107058288A、CN107267667A、CN111607591A等等。这些已经报道的一步法核酸提取方法具有如下缺点：1)只针对病毒这种结构简单容易裂解的样本，或2)需要加热，如95℃10min，或3)加入裂解液后需要离心，取上清进行扩增检测，或4)需要对样品做个前处理，比如稀释，或5)裂解液成分复杂，一是成本高，二是可能会对后续的核酸扩增有抑制作用。
[0004] 目前实现核酸扩增和检测的方法很多，市场上应用较多的是实现DNA扩增和检测的方法—PCR(即聚合酶链式反应)以及实现RNA扩增和检测的方法‑‑NASBA或SAT。
[0005] 其中，PCR是目前核酸扩增方法中最稳定，使用最多的一种核酸扩增方法。但也有一定的缺点：一、PCR检测的灵敏度低，且需要借助成本极高的热循环仪，扩增时间较长；二、在进行对RNA病毒的相关检测时，需要加入除了Taq DNA聚合酶以外的另外一种酶‑‑反转录酶，RNA模板需要在反转录酶的作用下先反转录从cDNA，再合成双链DNA，才能在Taq酶的作用下开启PCR反应。反转录酶目前市面上使用较多的是AMV和M‑MLV，无论是那种反转录酶，其成本都比Taq酶高很多；三、PCR的扩增时间长，使用常规酶的话，完成一次检测反应需要的扩增时间是60分钟左右，使用快速酶并配合升降温速率极高的热循环仪，完成一次核酸检测反应需要的扩增时间一般大于30分钟。所以对于PCR来说，不管是仪器还是扩增所需的酶，成本都相对较高，并且扩增周期长，检测灵敏度相对偏低。
[0006] 由于PCR扩增技术对仪器设备要求较高，通常需要较高的成本，因此一系列核酸恒温扩增技术被开发出来，比如，环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SDA)、环型DNA结合的滚环扩增技术(RCA)、Qβ复制技术、核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术Helicase‑Dependent Amplification(HDA)、多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)，等等。
[0007] 现有技术存在的不足(核酸扩增)：PCR的灵敏度低，且需要借助成本极高的热循环仪，扩增时间较长；LAMP和NASBA可以在恒温条件下对核酸进行扩增和检测，不需要热循环仪。但NASBA需要借助3种酶，其中反转录酶的成本较高，且整个扩增反应的周期较长；而LAMP不太擅长扩增120bp以下的片段；并且NASBA和LAMP扩增两种方法对靶标基因的要求较为苛刻，引物设计难度较大，且极易出现污染和假阳性现象，错误率极高。
[0008] NASBA技术有诸多缺陷：一是需要借助多种酶，AMV、RNase H、T7 RNA聚合酶等；二是AMV不易体外合成，萃取成本较高；三是RNase H和T7的耐热性较低，须在低温下进行，对靶标基因序列要求较高，引物设计难度高，同时特异性不够好极易产生假阳性现象；四是对120‑250bp的片段扩增效率较高，产物太长扩增效率急剧下降等；五是NASBA扩增方法周期极长；六是产物主要为RNA，不易用染料法进行实时检测。
具体实施方式
[0075] 下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0076] 本发明的扩增反应流程如下：
[0077] 一、单酶反应：Bst DNA聚合酶
[0078] Bst DNA聚合酶具有反转录功能、DNA聚合酶功能及链置换功能。如图1所示，首先，该酶具有反转录酶的活性，可以以RNA为模板进行反转录，得到cDNA序列，酶链置换的活性伴随反转录，即在同一条序列上设计多条反转录引物的情况下，多条引物可以同时进行反转录，并且可以进行链置换功能，把已经完成反转录的cDNA序列从RNA模板上置换下来，方便后续的引物结合和反转录。其次，该酶具有5’‑3’DNA聚合酶活性，可以以cDNA为模板合成互补链，形成双链，同样的链置换活性可支持多条引物同时结合模板进行扩增。
[0079] 二、二酶反应：Bst DNA聚合酶及T7 RNA聚合酶
[0080] 如图2所示，引物有2条，与普通PCR引物设计方法一致，只是都在5’端加了T7 promoter序列。首先，其中一条引物与RNA链结合，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸形成cDNA，另一条引物与cDNA结合，形成两端都带有T7 promoter双链的dsDNA，然后T7 RNA聚合酶识别T7 promoter双链，以dsDNA为模板，形成正链或负链RNA序列，进入扩增循环。每循坏一次产物都会放大100‑200倍。
[0081] 三、三酶反应：Bst DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及RNase H酶
[0082] 如图3所示，引物设计：5’和3’端各2条引物，其中两端靠外的引物(引物R1和引物F1)为普通的PCR引物，靠内的引物(引物R2和引物F2)分3段，从5’到3’端依次是特定的随机序列、T7 promoter正向序列、靶标特异性序列，其中两端特定的随机序列为反向互补序列。反应原理二酶的原理类似，通过Bst DNA聚合酶形成dsDNA，再通过T7 RNA聚合酶识别T7 promoter双链进行产物的放大，并形成多个反应循环，与图2不同的是，形成了一个中间产物①。
[0083] 实施例1单酶反应
[0084] 1)靶标：健康人口腔拭子。
[0085] 模板制备方法：取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转3圈，折断拭子头，盖上管盖。取裂解液作为模板，直接进行恒温扩增。
[0086] 2)靶标基因：Actin基因。
[0087] 3)引物：
[0088] Actin基因引物：
[0089] 引物为Actin基因上面，分别与靶标序列一致的连续的4条上游引物‑F1,F2,F3,F4，以及与靶标序列反向互补的连续的4条下游引物‑R1,R2,R3,R4。
[0090] 4)裂解液组合如下：
[0091] 0.5％Triton‑X‑100，其余用DEPC H2O至350ul。
[0092] 5)反应液组合如下：
[0093] Tris‑HCl 40mM，pH＝8.5；KCl 10mM；NaCl 5mM；MgSO4 15mM；dNTP 1mM；NTP 2mM；0.5M甜菜碱；8U Bst DNA聚合酶；0.5×SYBR Green I；引物R1,R2,R3,R4,F1,F2,F3,F4各
0.2uM；其余用DEPC H2O补至20ul。
[0094] 6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，30cycles。
[0095] 3次实验结果如下：
[0096] 表1第1次实验结果
[0097]
[0098] 表2第2次实验结果
[0099]
[0100] 表3第3次实验结果
[0101]
[0102] 第1次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图4所示，第2次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图5所示，第3次实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图6所示。
[0103] 7)对照组：
[0104] 同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。
[0105] 提取试剂：zymo R1051；
[0106] 扩增试剂：全式金AQ322‑01；
[0107] 引物：
[0108] RP‑F：AGATTTGGACCTGCGAGCG；
[0109] RP‑P：5'‑Cy5‑TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG‑BHQ2‑3'；
[0110] RP‑R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT；
[0111] 反应体系：
[0112]
[0113] 反应程序：
[0114]
[0115] 对照组实验结果荧光强度随时间变化的曲线如图7所示。
[0116] CT值分别是：27.297，27.768，27.873，28.173，28.192，28.550，27.785，27.265，27.548，26.449，26.345，27.805。
[0117] 结果分析：
[0118] 本发明的扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。
[0119] 实施例2：
[0120] 1)靶标：
[0121] 健康人口腔拭子与含相应靶基因片段的SARS‑COV‑2假病毒混合；
[0122] 模板制备方法：
[0123] 取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转三圈，折断拭子头，盖上管盖。加入10ul一定浓度SARS‑COV‑2假病毒。取原液及稀释10倍的样品作为模板，直接进行恒温扩增，扩增温度50‑70℃，扩增时间40min。
[0124] 2)靶标基因(SARS‑COV‑2N基因)片段：
[0125] GCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGA
[0126] AATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGC
[0127] TTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAA
[0128] GC％＝103/198＝52.02％；
[0129] 3)引物：
[0130] N‑F1：GCCAAAAGGCTTCTACGCA；
[0131] N‑R1：TTGCTCTCAAGCTGGTTCAA；
[0132] N‑F2：
[0133] GAGCCTTGTTGGATATAGATAATACGACTCACTATAGGGCAATCCTGCTAACAATGCT；
[0134] N‑R2：
[0135] TCTATATCCAACAAGGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAGCAGCAAAGCAAGAGCAG；
[0136] 4)裂解液组合如下：
[0137] 20mM Tris‑HCl；
[0138] 0.5％Tween 20；
[0139] 其余用DEPC H2O至350ul；
[0140] 5)反应液组合如下：
[0141] Tris‑HCl 25mM，pH＝8.5；
[0142] KCl 20mM；
[0143] NaCl 10mM；
[0144] MgSO4 20mM；
[0145] dNTP 2mM；
[0146] NTP 4mM；
[0147] 0.8M甜菜碱；
[0148] 12U Bst DNA聚合酶；
[0149] 30U T7 RNA聚合酶；
[0150] 0.5U RNase H；
[0151] 0.5×SYBR Green I；
[0152] 引物F1和R1各0.8mM；
[0153] 引物F2和R2各1.4mM；
[0154] 其余用DEPC H2O至20ul；
[0155] 6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，40cycles。
[0156] 荧光强度随时间变化的曲线如图8所示。
[0157] 从图8可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：13.633、13.255、14.259；稀释10倍的样品CT值分别是：16.703、16.913、15.986。
[0158] 7)对照组：同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。
[0159] 提取试剂：zymo R1051
[0160] 扩增试剂：全式金AQ322‑01
[0161] 引物：
[0162] N‑F：GCAGTCAAGCCTCTTCTCG；
[0163] N‑P：5'‑Fam‑CATCACGTAGTCGCAACAG‑BHQ2‑3'；
[0164] N‑R：CAAGAGCAGCATCACCGCC；
[0165] 反应体系：
[0166]
[0167]
[0168] 反应程序：
[0169]
[0170] qPCR反应结果如图9所示：
[0171] 从图9可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：19.373、19.479、19.434；稀释10倍的样品CT值分别是：22.765、23.131、23.078。
[0172] 结果分析：实施例1扩增的靶标序列GC含量为52.02％，中等偏上。从结果看，本发明的扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。
[0173] 实施例3：
[0174] 1)靶标：
[0175] 健康人口腔拭子与含SARS‑COV‑2S基因片段的体外转录产物混合；
[0176] 模板制备方法：
[0177] 取装有350ul裂解液的1.5ml离心管，打开盖子，取拭子，于咽喉部反复刮取10次，将拭子投入裂解液中，顺时针转3圈，逆时针转三圈，折断拭子头，盖上管盖。加入10ul一定浓度SARS‑COV‑2S基因体外转录产物。取原液及稀释10倍的样品作为模板，直接进行恒温扩增，扩增温度50‑70℃，扩增时间40min。
[0178] 2)靶标基因(SARS‑COV‑2S基因)片段：
[0179] TATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGA[0180] ACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTT
[0181] ATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAA
[0182] CCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACC
[0183] CTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACT[0184] TTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTT
[0185] TTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATT
[0186] ATTCT
[0187] GC％＝183/489＝37.42％；
[0188] 3)引物：
[0189] N‑F1：TATTCTAAGCACACGCCTA；
[0190] N‑R1：AGAATAATCAGCAACACAG；
[0191] N‑F2：
[0192] GAGCCTTGTTGGATATAGATAATACGACTCACTATAGGGTTAGTGCGTGATCTCCCTC；
[0193] N‑R2：
[0194] TCTATATCCAACAAGGCTCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCTGATTCTCTTCCTGT；
[0195] 4)裂解液组合如下：
[0196] 20mM Tris‑HCl；
[0197] 0.5％Tween 20；
[0198] 用DEPC H2O补至350ul；
[0199] 5)反应液组合如下：
[0200] Tris‑HCl 25mM，pH＝8.5；
[0201] KCl 20mM；
[0202] NaCl 10mM；
[0203] MgSO4 20mM；
[0204] dNTP 2mM；
[0205] NTP 4mM；
[0206] 0.8M甜菜碱；
[0207] 12U Bst酶；
[0208] 30U T7 RNA聚合酶；
[0209] 0.5U RNase H；
[0210] 0.5×SYBR Green I；
[0211] 引物F1和R1各0.8mM；
[0212] 引物F2和R2各1.4mM；
[0213] 其余用DEPC H2O补至20ul。
[0214] 6)设置ABI QuantStudio3荧光定量PCR仪，程序：50℃10s，50℃50s(搜集荧光)，40cycles。
[0215] 荧光强度随时间变化的曲线如图10所示。
[0216] 如图10所示，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：13.934、14.860、14.980；稀释10倍的样品CT值分别是：20.088、19.493、20.520。
[0217] 7)对照组：同时使用qPCR金标准对同一管样品进行检测。
[0218] 模板：与MAP方法一样的模板；
[0219] 扩增试剂：全式金AQ322‑01
[0220] 引物：
[0221] S‑F：GCACTTGACCCTCTCTCAG；
[0222] S‑P：5'‑Fam‑TTTAGAGTCCAACCAACAG‑BHQ2‑3'；
[0223] S‑R：GATGCAAATCTGGTGGCGT；
[0224] 反应体系：
[0225]
[0226]
[0227] 反应程序：
[0228]
[0229] qPCR反应结果如图11所示：
[0230] 从图11可以看出，原液做了3个复孔，稀释10倍的样品做了3个复孔。原液CT值分别是：17.855、19.147、18.498；稀释10倍的样品CT值分别是：20.572、21.058、21.423。
[0231] 结果分析：实施例3扩增的靶标序列GC含量为37.42％，较低。从结果看，本发明扩增方法比qPCR扩增方法灵敏度更高。
[0232] 说明本申请的扩增效率不受靶标GC含量影响。
[0233] 本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
[0234] 本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。
[0235] 最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
