本发明涉及进行核酸扩增反应的方法，控制这些反应的方法以及试 剂盒和试剂，特别是用以进行反应的酶。 扩增反应，如聚合酶链反应(PCR)已是众所周知，并被广泛地应 用在生物技术研究、诊断和检测领域中。 PCR是根据DNA的碱基配对特性和互补DNA链的准确复制，产生大 量特定核酸序列，特别是DNA序列的步骤。典型PCR包括三个基本步 骤的循环过程。 变性：将含有PCR试剂的混合物(包括待复制核酸，可以是DNA 或RNA(模板)；各个核苷酸碱基(A、T、G、C)；合适的引物和聚 合酶)加热至预定温度，以使靶DNA的双链分离。 退火：然后将混合物冷却至另一个预定温度，引物定位于它们在 DNA链上的互补序列，并与其结合。 延伸：再次将混合物加热至另一个预定温度。聚合酶(作为催化剂) 将各个核苷酸碱基加入到引物的末端，以形成与靶DNA的序列互补的 DNA新链，双链彼此结合。 这些反应依赖于以非常精确的次序发生的步骤的顺序，以及操作这 些步骤所需的精确温度。当在不同温度下将试剂混合即使很短时间， 例如在反应开始前，也会产生一个问题。引物可能与核酸模板相互作 用，引起模板引物延伸。这样会导致预期产物的总产量下降及非特异 性产物的产生。 克服该难题的多种不同方法以前已经被提出过。例如，最初尝试采 用蜡屏障使试管中多种不同的PCR试剂彼此分离，以克服该难题(见 例如USP5,565,339)。当反应混合物加热至初始变性温度时，蜡融化， 使得试剂尽可能晚地混合，而使副反应的可能性减到最小。这种反应 被认为是“热启动”反应。 其它实现抑制副反应的化学方法已经被尝试过。例如，美国专利 No.5,677,152描述的方法中，DNA聚合酶被化学修饰，以确保其仅在 高温时具有活性。然而，为实现这一方法，需要在高温温育反应混合 物一段时间，以产生活性酶。这种迟滞，在一些情况中有时不显著， 但在快速要求PCR结果的情况下可能是不利的。对PCR技术的许多应 用而言，在尽可能短的时间内完成循环顺序是理想的。例如，特别是 当人类消耗的空气、液体或食物和动物贮存物被怀疑污染的时候，快 速诊断方法即使不能挽救健康也可以节省可观的金钱，甚至可以挽救 生命。 其它方法中，水生嗜热杆菌(Taq)DNA聚合酶的单克隆抗体，如 Sigma提供的抗Taq DNA聚合酶抗体，被引入反应混合物中。抗体结 合到酶上，以使其在室温失活。然而，在扩增循环期间采用的高温使 抗体变性，并从酶上解离，酶从而具有活性。不过在一些情况中，该 方法似乎不能除去非特异副产物。 在PCR反应期间，模板的引物延伸可以被表示为： DNA模板+dNTP Mg+++DNA聚合酶DNA模板-dNMP+PPi dNTP是脱氧核糖核酸三磷酸，dNMP是相应的脱氧核糖核酸单磷 酸，PPi是无机焦磷酸盐。该反应也可表示为： (DNA)n残基+dNTP_(DNA)n+1残基+PPi 已知PPi水平的增加可使上述反应逆向进行，例如在DNA测序反 应中。这被认为是焦磷酸解作用，并且在70℃采用耐热DNA聚合酶进 行的DNA测序中，该作用是公认的难题。通过将耐热PPase添加到用 于DNA测序中的DNA聚合酶配方中，可克服这一难题。 申请人发现该反应可形成优势扩增反应的基础，在该优势扩增反应 中，非特异产物的产量可被减到最小。 本发明提供了一种进行核酸扩增反应的方法，该方法包括：在足量 焦磷酸盐存在下，形成扩增反应混合物，以避免引物延伸的发生；酶 消化该焦磷酸盐；并使该反应混合物处于可进行扩增反应的条件下。 采用本发明的方法，可进行精确扩增反应，该反应可快速进行，并 且具有良好的特异。因此这是现有“热启动”扩增技术的一个好的可 选方案。 用于发明方法中的初始扩增反应混合物总的来说是常规混合物，如 用于PCR反应中，添加了焦磷酸盐的混合物。因此该混合物通常包括： i)含有或怀疑含有靶核酸序列的样品；ii)至少一个杂交于该靶序列末 端区域的引物；iii)镁离子源；iv)构成靶序列的核苷酸或核苷碱基(即 DNA扩增情况中的A，T，C，G和/或U，或RNA扩增情况中的A，U，C 和G)，及v)在实现扩增反应的温度下耐热的DNA聚合酶。根据实现 反应的需要，如本领域所知，该混合物也可包括缓冲液。 特别的，对DNA扩增而言，(iv)可包括核苷酸A，T，G和C；对 RNA扩增而言，可包括核苷A，U，C和G。 然而，在进行其它基于引物的扩增反应，如逆转录酶PCR(RT-PCR) 时，可以利用其它组合。 另外，试剂可以包括标记的探针或引物，和/或其它标记方式，诸 如Sybr Green、Sybr Gold、溴化乙锭等嵌入染料，或这些染料的组 合，使得应用可被监测，无须随后检测凝胶上的产物。这些标记方式 的性质取决于进行的鉴定类型。一般的嵌入剂方法采用嵌入染料监测 扩增过程中双链DNA中的增加情况。这些仅是准链特异性，所以在要 求检测链特异性时需要其它标记。 链特异性方法利用另外的核酸反应组分监测扩增反应的进展。这些 方法经常以荧光能转移(FET)作为检测的基础。一个或多个核酸探针 由荧光分子标记，其中一个荧光分子可作为能量供体，另一个荧光分 子则是能量受体分子。有时这些分子被认为分别是报道分子和淬灭分 子。供体分子由位于其激发光谱内的特定波长的光激发，并随后在其 荧光发射波长内发光。通过多种距离依赖性能量转移机制，受体分子 接受来自供体分子的能量，从而也在该波长被激发。可发生的荧光能 量转移的特定实例是荧光共振能量转移或“FRET”。通常，当受体分 子与供体分子极为接近(如，位于同一分子，或邻近分子)时，受体 分子接受供体分子的发射能。荧光能量转移检测的基础是监测供体和 受体发射波长的改变。 有两种常用的FET或FRET探针类型，一类利用核酸探针的水解作 用使供体与受体分离，另一类利用杂交作用改变供体与受体分子的空 间关系。 水解探针是商业上可获得的，如TaqManTM探针。这类探针由供体 和受体分子标记的DNA寡聚核苷酸组成。探针被设计为结合到PCR产 物的一条链上的特定区域。 在PCR引物退火到该链上后，Taq酶通过5’到3’的聚合酶活性延 伸DNA。Taq酶也抑制5’到3’的核酸外切酶活性。在3’末端，磷酸化 作用保护TaqManTM探针，使其不能引发Taq延伸。如果TaqManTM探针 被杂交到产物链，延伸的Taq分子也可水解探针，从受体释放出供体 作为检测的基础。该情况中的信号是累积的，游离供体和受体分子的 浓度随着扩增反应的每一个循环而增加。 美国专利No.5,491,063描述了一种荧光标记探针的溶液内猝灭 的方法，该方法依赖于通过DNA结合剂对来自标记的单链寡核苷酸的 信号进行的修饰。聚合酶链反应期间，探针裂解(水解作用)后，由 于探针的链长度减少引起的该信号的差异被认为提供了一种检测靶核 酸是否存在的方法。 杂交探针有许多形式可利用。分子信标是具有互补的5’和3’序列， 并因此形成发夹环的寡聚核苷酸。当发夹环结构形成时，末端荧光标 记是处于极为接近便于发生FRET的位置。分子信标杂交到互补序列 后，荧光标记便被分离了，所以FRET不会发生，并且这形成了检测基 础。 也可采用成对的标记寡聚核苷酸。它们在PCR产物链上极为接近 的位置上杂交，使供体和受体分子结合，以使FRET可以发生。增强的 FRET是检测的基础。这种类型的变体包括采用具有单一邻近探针的标 记扩增引物。 美国专利No.4,868,103概括地描述了检测分析物是否存在的 FRET体系，该体系利用嵌入染料作为供体分子。该方法不包括扩增期。 利用FET或FRET检测的分析的其它实例有，WO 99/28500描述了 利用嵌入染料和单一标记探针的组合作为信号传递体系，WO 99/28501 描述了利用标记引物和酶的组合以产生可检测的荧光信号，WO 99/42611描述了利用嵌入染料与荧光标记的核苷酸的组合作为信号基 础。然而作为补充，例如在WO 99/66071中描述的进一步分析是利用 包括标记和化学阻滞剂的复合引物。 用于本发明方法中的反应混合物可以包括任何进行上述分析进行 所必需的标记试剂。这种反应混合物尤其可以有利地被应用在基因型 分析中，并且更为特别的是应用在SNP评估中。这些情况中，本发明 的方法与双TaqManTM探针联合使用，一个探针特异于基础序列，另一 个探针则特异于突变体。每一个探针优选地含有不同的荧光团，因此 依赖于存在基因的不同形式的数量便产生了不同的信号。单一信号产 生自纯合体，混合的信号产生自杂合体。 本发明范围内可用的合适DNA聚合酶的实例是耐热聚合酶，如水 生栖热菌聚合酶(Taq)、嗜热栖热菌聚合酶(Tth)、栖热菌NH聚合 酶(TspNH)、Thermus brockianus聚合酶(Tbr)(以上均可获得自 例如GeneSys Limited，Farnborough，U.K.)、激烈火球菌聚合酶 (Pfu)(可获得自Stratagene)、9°N7外DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶(可获得自New England Biolabs，为VENTTM DNA聚合酶)。 用于本发明方法中的焦磷酸盐可以是任何可溶性焦磷酸盐，包括可 溶性金属和非金属(如铵盐)。这种化合物通常被认为是“无机焦磷 酸盐”或PPi，本申请采用该术语。特别地，焦磷酸盐可为碱金属焦磷 酸盐，如焦磷酸钠或焦磷酸钾，包括焦磷酸二钠(Na2H2P2O7)、无水焦 磷酸四钠(Na4P2O7)、十水合焦磷酸四钠(Na4P2O7·10H2O)和焦磷酸四 钾(无水)。其它可应用的可溶性焦磷酸盐包括焦磷酸铁，如焦磷酸 铁(Fe4(P2O7)3)，可溶性铵盐如无水焦磷酸三丁铵。其它可溶性焦磷 酸盐可通过商业渠道获得。 优选的无机焦磷酸盐是焦磷酸四钠，分子式为Na4P2O7。 反应混合物应用的焦磷酸盐的浓度应该足以阻止引物延伸的发 生。这在很大程度上取决于扩增序列的特性和浓度，采用的引物和聚 合酶及其浓度，并其在任何特定情况下都可通过常规方法测定。 最初形成的反应混合物合适地含有至少0.5mM浓度的焦磷酸盐， 合适的是至少1mM，例如1-10mM，优选的是1-5mM。 无机焦磷酸盐的酶消化作用是在扩增反应的第一个阶段期间或之 前立即合适地进行。该作用可通过在扩增反应开始之前立即添加焦磷 酸酶(Ppase)(可被认为是无机焦磷酸酶-PPiase)实现。 然而，酶消化作用优选的是采用在高温下，如超过50℃仍具有活 性的耐热焦磷酸酶实现的。优选的酶仅在这些高温下具有有效活性。 这意味着在形成反应混合物时，焦磷酸酶可以被包括其中，但是它在 常温则不能或不能有效地消化抑制性焦磷酸盐。仅当反应混合物在必 要时被加热时，如在PCR反应的起始变性阶段，焦磷酸酶才具有适当 的活性。不过可以在高温下进行短暂的初步温育，如50-100℃，及优 选的是80-95℃。 耐热焦磷酸酶的实例包括可获得自GeneSys Limited， Farnborough UK.的嗜酸热硫化叶菌焦磷酸酶(Sac PPase-Meyer et al.，Achieves of Biochem.and Biophys.(1995)319，1，149- 156)，或可获得自New England Biolabs(目录号#M0296S和#M0296L) 的Thermococcus litoralis焦磷酸酶。优选的耐热焦磷酸酶是可获 得自Genesys Limited，Farnborough UK的Aeropyrum pernix无机 焦磷酸酶。 第一种严格需氧的高度嗜热的古生菌，Aeropyrum pernix K1，是 1993年在Kodaka ra-Jima Island，Japan，从海岸硫化热喷泉中分 离而来(Sako et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.46(1996)： 1070-1077)。保藏于日本微生物保藏中心，JCM 9820。 申请人首次从Aeropyrum pernix中分离出耐热焦磷酸酶，并且这 构成本发明的另一方面。包括该焦磷酸酶的基因组序列，如SEQ ID NO.1 所示，相应的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示(下文图11)。发明 的酶特别具有如SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列，该序列被图11中 黑体显示的SEQ ID NO 1区域编码，也如SEQ ID NO 26所示。 因此，本发明包括含有SEQ ID NO 26的多核苷酸和其变体或片段。 例如，发明提供了SEQ ID NO 1的多核苷酸。 本发明进一步包括含有SEQ ID NO 25的氨基酸序列和其变体或片 段。例如，该氨基酸序列可包含SEQ ID NO 2。 此处所用与多核苷酸序列相关的术语“其片段”指具有与完整多核 苷酸序列相同活性的已知多核苷酸序列的任何部分。片段合适地包含 至少300个，优选地包含至少450个来自基础序列的连续碱基。 与多核苷酸序列相关的术语“其变体”指任何在多核苷酸上发生的 一个或多个核酸的取代、变异、修饰、置换、缺失、或添加，提供了 多核苷酸编码的相应蛋白质序列，该序列显示了与基础序列编码的蛋 白质相同的特性。因此该术语包括等位变体，也包括与本发明多核苷 酸序列基本杂交的多核苷酸。优选的这种杂交作用发生在低和高严格 性条件下或之间。概括地，低严格性条件可定义为3×SSC在约室温到 约55℃，高严格性条件为0.1×SSC在约65℃。SSC是0.15M NaCl， 0.015M柠檬酸三钠缓冲液的名称。3×SSC是SSC的三倍强度等等。 典型的变体具有62％或更多的核苷酸与本发明的多核苷酸序列相 同，更典型的是65％，优选的是70％，甚至更为优选的是80％或85％， 特别优选的是90％，95％，98％或99％或更高的同一性。 为测定同一性程度，比较核酸序列时，可采用诸如BESTFIT和GAP 程序(均来自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)软件包)。 例如BESTFIT比较两种序列，并生成最相似区段的最佳比对。GAP可 使序列沿其全长比对，并通过在任一适当序列中插入间隔，从而找到 最佳比对。合适地，在本发明范围内，当讨论核酸序列同一性时，是 通过沿其全长排列序列进行比较的。 此处所用与氨基酸序列相关的术语“其片段”指具有与完整氨基酸 序列相同活性的已知氨基酸序列的任意部分。片段合适地包含至少100 个，优选地包含至少150个来自基础序列的连续氨基酸。 此处所用与氨基酸序列相关的术语“其变体”指与其来源的基础序 列不同，即基础序列中有一个或多个氨基酸被其它氨基酸所取代而得 到的氨基酸序列。氨基酸取代作用可被认为是“保守的”，即氨基酸 被具有广泛相似特性的不同氨基酸所置换。非保守取代作用是指氨基 酸被不同类型氨基酸所置换。一般地说，不改变多肽的生物学活性的 更少非保守取代是可能的。合适的变体与基础序列有至少60％，优选至 少75％，更为优选至少90％的同一性。 在该情况中的同源性是可以被判定的，例如运用Lipman-Pearson 算法，设置Ktuple：2，空位罚分：4，空位长度罚分：12，标准PAM评分矩 阵(Lipman，D.J.and Pearson，W.R.，Rapid and Sensitive Protein Similarity Searchs，Science，1985，vol.227，1435-1441)。 优选的本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO 26和与其相比具有超过 6 2％同一性的序列。 这些酶可从天然来源获得，或可采用常规方法于重组宿主细胞，如 大肠杆菌细胞中表达。 除去焦磷酸盐，如于＞50℃，通过耐热焦磷酸酶(PPase)作用， 然后如常规进行引物延伸(并因此扩增)。该过程中，1摩尔的焦磷酸 盐转变为2摩尔不干扰扩增反应的无机磷酸盐(Pi)。 所包含焦磷酸酶的量应当足以消化反应混合物中存在的过量焦磷 酸盐。一般而言，这个量应大于常规用于相同循环反应中那些酶的量， 以阻止焦磷酸解作用的发生，例如大约5倍多。准确的量取决于多种 不同因素，包括采用的特定酶，焦磷酸盐的浓度等。扩增反应混合物 中包括的PPase和特定耐热PPase的典型浓度为至少0.04个单位 /50μL PCR反应混合物，优选至少含有0.08个单位/50μL PCR反应混 合物，更为优选的是含有0.2-10个单位/50μL PCR反应混合物。该 情况中，一个单位被定义为1分钟内，75℃和下列反应条件下：1mM K4P2O7，2mM MgCl2，50mM Tris-HCl，pH9.0(25℃)，催化1μmol焦 磷酸盐转化为2μmol正磷酸盐所需要的酶的量。 本发明方法中的酶可迅速除去无机焦磷酸盐，这取决于采用的温 度。通常可在少于5分钟的时间内实现完全除去，更为通常的是在少 于2分钟的时间内，如果需要可少至15秒。 一旦从反应混合物中酶促除去了无机焦磷酸盐，便可进行扩增反 应，例如采用常规热循环程序。 本发明方法借以达到预期结果的机制尚不清楚。可能是过量焦磷酸 盐的存在抑制了引物延伸反应。不过，似乎没有显著降低PCR灵敏度 或产量。 本发明方法可在任何常规设备中进行以进行应用反应。这些设备包 括Perkin-Elmer Corporation提供的常规封闭加热设备如EP-A- 0810030，或Idaho Technologies Inc.提供的快速热空气热循环仪 如RapidCyclerTM和LightCyclerTM，或如WO98/24548中描述的其它 类型的热循环仪。 根据另一方面，本发明提供了一种进行扩增反应的试剂盒。该试剂 盒包含无机焦磷酸盐、无机焦磷酸酶，及扩增反应所需任选的一种或 多种试剂。如上所述，无机焦磷酸盐合适地足量存在，以抑制扩增反 应。试剂盒中存在的无机焦磷酸酶优选的量足以消化所有该无机焦磷 酸盐。 一种或多种试剂包括上文所列(ii)-(v)试剂中的任意一种， 并且也可包括缓冲液。无机焦磷酸酶的特定实例是上述的耐热无机焦 磷酸酶。 特别的，试剂盒可以合适地包含一种任选的附加试剂，一种或多种 进行扩增特定靶DNA序列所需的引物，例如一种诊断特定疾病条件或 样品中特定病原体是否存在的序列。该方法也可被用于检测遗传分析 中的多态性或等位变异。 此外，试剂盒可以包含一个或多个标记试剂，如嵌入染料，或荧光 标记的探针、引物或核苷酸，这些试剂将有助于原位检测或监测扩增 反应。 另一方面中，本发明提供了上述无机焦磷酸盐在进行上述扩增反应 的方法中的用途。优选的无机焦磷酸酶是来自Aeropyrum pernix。 最后，在另一方面中，本发明提供了上述无机焦磷酸酶在进行上述 扩增反应的方法中的用途。 现在，将通过附有简图的实施例特别详细地描述本发明。 图1显示的是在不同量的PP i存在下进行PCR的结果，其中PPi 为焦磷酸三钠； 图2显示的是在3mM PPi缺乏或存在情况下增加MgCl2的效果； 图3显示的是采用本发明方法和常规PCR反应获得的结果； 图4显示的是在分析中采用本发明方法，并与常规PCR比较所获 得的结果； 图5显示的是测试本发明方法所用PCR反应混合物的储存稳定性 的实验结果，并与常规混合物的结果进行比较； 图6显示的是在本发明方法中采用不同PPase所获得的结果； 图7a和7b及图8a和8b显示的是采用本发明方法和多种不同DNA 聚合酶进行PCR实验所获得的结果； 图9显示的是比较本发明方法与常规“热启动”PCR的实验结果； 图10显示的是进行类似试验，但采用可选的常规PCR所获得的结 果； 图11显示的是如SEQ ID NO.1所示的Aeropyrum pernix的基因 组序列(参考GenBank BA000002中的NC 000854)、相应的氨基酸序 列SEQ ID NO.2和酶的序列(SEQ ID NO 25)； 图12显示的是不同PPase序列(SEQ ID NOS 2-9)的比对，包 括如SEQ ID NO.2所示的Aeropyrum pernix的蛋白质序列； 图13显示的是从Aeropyrum pernix分离焦磷酸酶期间产生的686 个碱基对的PCR产物(SEQ ID NO 10)； 图14显示的是从Aeropyrum pernix分离焦磷酸酶所用的多接头 序列(SEQ ID NO 11)； 图15显示的是从Aeropyrum pernix分离焦磷酸酶所用的 pTTQ18NHK载体的序列(SEQ ID NO 12)； 图16显示的是pTTQ18NHK载体的序列(Z＝终止)，包括从 Aeropyrum pernix分离焦磷酸酶所用的PPase序列(SEQ ID NO 13)； 及 图17显示的是本发明方法采用来自Aeropyrum pernix的无机焦 磷酸酶所获得的结果。 实施例1 PPi对PCR的影响 在不同量的无机焦磷酸盐，十水合焦磷酸四钠(PPi)存在下采用 Taq DNA聚合酶及下列试剂，进行标准500bpλ模板PCR。 试剂 体积 终浓度 10×反应缓冲液 5μl 1x 25mM MgCl2 3μl 1.5mM 5mM dNTPs 2μl 200μM 5’引物(10pm/μl) 5μl 1μM 3’引物(10pm/μl) 5μl 1μM 模板 1ng DNA DNA聚合酶(5u/μl) 0.25 1.25u 加水至总体积 50.0μl λ500bp引物序列 5’引物 GAT GAG TTC GTG TCC GTA CAA CTG G(SEQ ID NO 14) 3’引物 GGT TAT CGA AAT CAG CCA CAG CGC C(SEQ ID NO 15) 1×反应缓冲液：10mM Tris.pH8.0，50mM KCl。 用于试验的PCR条件如下： i)94℃ 3.00分钟 ii)20个循环的：94℃ 10秒 50℃ 10秒 72℃ 30秒 iii)72℃ 7分钟 iv)25℃保持 添加PPi使其在反应混合物中的最终浓度为0、1、2、3、4和5mM。 结果如图1所示。该图中，泳道与PPi的下列浓度对应。 泳道 1+2 0 PPi 3+4 1mM PPi 5+6 2mM PPi 7+8 3mM PPi 9+10 4mM PPi 11 5mM PPi 在所有测试的PPi水平上，均没有产生PCR产物。 实施例2 增加镁离子浓度的影响 Mg结合PPi，因此实施例1的观测结果有可能是由于Mg被过量的 PPi螯合而产生。这导致存在的Mg不足以使引物延伸得以进行。为消 除这种可能性，在不同浓度镁离子存在下重复进行采用3mM PPi的实 施例1的步骤。 结果如图2所示。该图中，泳道代表下列反应： 泳道 1+2 1.5mM MgCl2 3+4 5mM MgCl2 5+6 7.5mM MgCl2 7+8 10mM MgCl2 9+10 1.5mM MgCl2+3mM PPi 11+12 5mM MgCl2+3mM PPi 13+14 7.5mM MgCl2+3mM PPi 15 10mM MgCl2+3mM PPi 结果显示添加Mg++高达10mM最终浓度(1.5mM是PCR中的标准)， 也不能使PCR发生，这表明是PPi阻滞了引物延伸。 实施例3 在PPi和PPase存在下的PCR反应 重复实施例1的500bpλPCR，不过这次在含焦磷酸盐(PPi)的 反应中包括了0.2u的嗜酸热硫化叶菌PPase(Sac PPase)。在0.2u 的Sac PPase存在下，于95℃温育反应5分钟，足以破坏焦磷酸盐， 使PCR反应得以进行。 结果如图3所示，其中泳道代表下列反应： 泳道 上排 1+2 1mM PPi+0.2u PPase 3+4 2mM PPi+0.2u PPase 5+6 3mM PPi+0.2u PPase 7+8 4mM PPi+0.2u PPase 9+10 5mM PPi+0.2u PPase 下排 1+2 1mM PPi 3+4 2mM PPi 5+6 3mM PPi 7+8 4mM PPi 9+10 5mM PPi 11+12 0mM PPi 当与没有PPi和PPase二者参与的反应相比时，产生了PCR产物 的可比较水平。 采用小于1mM的PPi浓度重复该实施例。结果(未示出)表明0.4mM 的PPi不能完全抑制PCR，但在PPi浓度为0.6mM时，PCR不能发生。 实施例4 PCR试验 将本发明方法应用到需要“热启动”反应的试验体系，以产生正确 大小的PCR产物。 试验基于人类血管紧张素基因的321bp片段的扩增。该试验被认 为仅在甜菜碱存在情况下可产生正确扩增产物(EP-A-0962526-具体见 实施例8)。 无甜菜碱存在时，热启动DNA聚合酶产生很少或根本不产生非特 异性扩增产物，反之，非热启动DNA聚合酶PCR可产生大量非特异性 扩增产物。 血管紧张素试验所用的PCR条件可概括如下： 试剂 体积 最终浓度 10×反应缓冲液 5μl 1× 25mM MaCl2 3μl 1.5Mm 5mM dNTPs 2μl 200μM 5’引物(100μm) 0.25 0.5/μM 3’引物(100μm) 0.25 0.5/μM 模板100ng/μl 50ng 人类xsomal DNA 5M甜菜碱 10.0 1M DNA聚合酶(5u/μl) 0.25 1.25u 加水至总体积 50.0μl 血管紧张素引物序列 5’引物GCA ACG CCC CTC ACT ATA AA (SEQ ID NO 16) 3’引物GCA CCC CGC CCT TGA AGT CC (SEQ ID NO 17) 1×反应缓冲液：10mM Tris.pH8.0，50mM KCl。 用于试验的PCR条件如下： i)95℃2分钟或少于2分钟 ii)35个循环的95℃ 15秒 50℃ 30秒 72℃ 30秒 iii)72℃ 7分钟 iv)25℃保持 采用PE9700仪器，在实施例3所述3mM PPi和0.2u PPase的存 在情况下进行反应。 结果如图4所示，其中泳道代表下列反应。 泳道 1标准Taq聚合酶PCR—无甜菜碱—许多错误引发 2标准Taq聚合酶PCR—有甜菜碱—亮条带是正确产物—有一些错 误引发 3标准Taq聚合酶PCR—无甜菜碱，但有3mM PPi和0.2u Sac PPase—无错误引发--95℃下5分钟变性 4标准Taq聚合酶PCR—有甜菜碱，还有3mM PPi和0.2u Sac PPase—仅有正确产物--95℃下5分钟变性 5+6按照3的反应，但在95℃下仅2分钟变性 7+8按照4的反应，但在95℃下仅2分钟变性 很明显，采用本发明方法可实现有效的“热启动”反应。在甜菜碱 存在情况下，采用PPi和Sac PPase可获得纯的单一产物。另外，未 发现错误引发，甚至在甜菜碱不存在的情况下，也未发现错误引发。 实施例5 室温储存的影响 研究在进行血管紧张素试验前，将含0.2u Sac PPase和3mM PPi 的PCR混合物置于室温20℃，持续不同时间段的影响。尽管Sac PPase 是耐热酶，但仍然可能在室温下具有低水平的酶活性。这可能导致反 应中抑制/终止DNA聚合酶的PPi的量不足，从而引起引物延伸，并缺 乏“热启动”功能性。 重复实施例4的方法，但是在进行试验前将反应混合物储存于室 温，持续不同时间段最长达2小时。 结果如图5所示，其中： 上排—显示的是室温下温育试剂所示的时间后，进行血管紧张素的 常规Taq聚合酶PCR的结果(有或无甜菜碱存在)；及 下排—显示的是根据本发明方法的相似的一组试验，在所有情况 下，每50μl PCR试验混合物中含有3mM PPi和0.2u PPase。 泳道 甜菜碱的存在 22℃持续时间段(室温) 1+2 - 0 3+4 + 0 5+6 - 30mins 7+8 + 30mins 9+10 - 60mins 11+12 + 60mins 13+14 - 120mins 15+16 + 120mins 甚至在2小时以后，根据本发明的试验仍然如预想进行，表明室温 下，Sac PPase对PPi的消化是不充分的。 图5显示的结果表明如果采用PPi和Sac PPase，在PCR前将PCR 混合物室温温育2小时对特异性没有影响。 实施例6 其它耐热PPase在本发明方法中的用途 重复实施例4的试验，同时进行相似反应，采用不同的商业可获得 耐热PPase(具有不同单位定义的活性)取代Sac PPase。结果如图6 所示，其中泳道代表下列反应： 泳道 1+2标准Taq聚合酶PCR-无甜菜碱 3+4标准Taq聚合酶PCR-有甜菜碱 5+6标准Taq聚合酶PCR-无甜菜碱，但有3mM PPi和0.2u Sac PPase 7+8标准Taq聚合酶PCR-有甜菜碱，及3mM PPi和0.2u Sac PPase 9+10标准Taq聚合酶PCR-无甜菜碱，但有3mM PPi和 10u*Thermococcus litoralis PPase 11+12标准Taq聚合酶PCR-有甜菜碱，及3mM PPi和 10u*Thermococcus litoralis PPase *该情况采用的单位由生产商提供，定义为：于标准反应条件下 (50mM Tricine[pH8.5]、1mM MgCl2、0.32mM PPi、0.5ml反应体积 中，75℃反应10分钟)，每分钟可产生40nmol磷酸盐的酶的量。 该试验中Thermococcus litoralis PPase(获得自New England Biolabs)似乎具有与Sac PPase相同的效果。 实施例7 不同耐热DNA聚合酶在发明方法中的用途 在本发明方法和一些比较试验中，应用了多种耐热DNA聚合酶。 这些酶包括一些未校正的栖热菌DNA聚合酶、校正的超耐高度嗜热的 古生菌DNA聚合酶，及未校正和校正的DNA聚合酶的混合物。 采用如实施例1所述的500bpλPCR测试所有酶(图7a和7b)， 个别采用实施例4所述血管紧张素试验进行测试(图8a和8b)。 具体试验条件概括如下： 图7a—栖热DNA聚合酶 泳道 上排 1+2 Taq聚合酶0mM PPi，无PPase 3+4 Taq聚合酶3mM PPi，无PPase 5+6 Taq聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 7+8 Tbr聚合酶0mM PPi，无PPase 9+10 Tbr聚合酶3mM PPi，无PPase 11+12 Tbr聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 下排 1+2 Tth聚合酶0mM PPi，无PPase 3+4 Tth聚合酶3mM PPi，无PPase 5+6 Tth聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 7+8 TspNH聚合酶0mM PPi，无PPase 9+10 TspNH聚合酶3mM PPi，无PPase 11+12 TspNH聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 图7b—古生菌校正DNA聚合酶 泳道 上排 1+2 Pfu聚合酶0mM PPi，无PPase 3+4 Pfu聚合酶3mM PPi，无PPase 5+6 Pfu聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 7+8 9°N外聚合酶0mM PPi，无PPase 9+10 9°N外聚合酶3mM PPi，无PPase 11+12 9°N外聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 下排 1+2 VENT聚合酶0mM PPi，无PPase 3+4 VENT聚合酶3mM PPi，无PPase 5+6 VENT聚合酶3mM PPi，0.2u Sac PPase 图8a血管紧张素试验，无PPi，无Sac PPase(有和无甜菜碱) 泳道 1+2 Taq聚合酶无甜菜碱 3+4 Taq聚合酶有甜菜碱 5+6 Accurase聚合酶无甜菜碱 7+8 Accurase聚合酶有甜菜碱 9+10 Tbr聚合酶无甜菜碱 11+12 Tbr聚合酶有甜菜碱 13+14 Tth聚合酶无甜菜碱 15+16 Tth聚合酶有甜菜碱 图8b血管紧张素试验，有PPi，有Sac PPase(有和无甜菜碱) 对照泳道为1-4(上排)和12-16(下排) 泳道 上排 1+2 Taq聚合酶，无甜菜碱，有3mM PPi，无Sac PPase 3+4 Taq聚合酶，有甜菜碱，有3mM PPi，无Sac PPase 以下全部有3mM PPi和0.2u Sac PPase 5+6 Taq聚合酶，无甜菜碱 7+8 Taq聚合酶，有甜菜碱 9+10 Accurase聚合酶，无甜菜碱 11+12 Accurase聚合酶，有甜菜碱 13+14 Tbr聚合酶，无甜菜碱 15+16 Tbr聚合酶，有甜菜碱 下排 以下全部有3mM PPi和0.2u Sac PPase 1+2 Tth聚合酶无甜菜碱 3+4 Tth聚合酶有甜菜碱 5+6 TspNH聚合酶无甜菜碱 7+8 TspNH聚合酶有甜菜碱 9+10 Pfu聚合酶无甜菜碱 11+12 Pfu聚合酶有甜菜碱 13+14 Taq聚合酶对照无甜菜碱，无PPi或PPase 15+16 Taq聚合酶对照有甜菜碱，无PPi或PPase 测试的所有DNA聚合酶均受PPi抑制，采用Sac PPase可克服该 抑制作用。 比较实施例8 本发明方法与常规“热启动”方法学的比较 我们有一些原始结果(图9和10)显示：化学修饰的Taq聚合酶 (如美国专利No 5,677,152所述方法进行修饰)在缺乏甜菜碱时会产 生一些错误PCR产物，但在甜菜碱存在情况下可得到正确产物。 图9血管紧张素试验 泳道 1+2 Taq聚合酶，无甜菜碱 3+4 Taq聚合酶，有甜菜碱 5+6 化学修饰的Taq，无甜菜碱 7+8 化学修饰的Taq，有甜菜碱 9+10 本发明的方法(3mM PPi和2u Sac PPase)，无甜菜碱 11+12 本发明的方法(3mM PPi和2u Sac PPase)，有甜菜碱 看来在这些环境下，化学修饰的酶是无活性的，直到在95℃下激 活10分钟才具有活性。没有经过初步温育时，产生的PCR产物少到可 以忽略。因为化学修饰的Taq在室温是无活性的，所以难以解释在缺 乏甜菜碱时产生错误PCR产物和明显错误引发的原因。 图10血管紧张素试验，有Taq和抗Taq抗体 泳道 1+2 抗-Taq抗体加Taq聚合酶，无甜菜碱 3+4 抗-Taq抗体加Taq聚合酶，有甜菜碱 在抗Taq DNA聚合酶抗体介导的热启动中，在缺乏甜菜碱的情况 下产生大量的错误产物(与无甜菜碱的标准Taq聚合酶PCR类似)， 并且在甜菜碱存在的情况下，伴随正确产物也产生了极少的错误产 物。 发明方法似乎给出比这些商业HotStart方法学更为特异的快速 PCR反应。 实施例9 从Aeropyrum pernix分离无机焦磷酸酶 从J.C.M.保藏中心获得Aeropyrum pernix。克隆、表达并纯化无 机焦磷酸酶。 从A.pernix克隆并表达无机焦磷酸酶 包含Aeropyrum pernix的焦磷酸酶基因的基因组序列如图11所 示。所用的引物是从Aeropyrum pernix的基因组序列设计而来。这些 引物以5’-3’的顺序如下所示，并具有黑体显示的限制酶切位点。 上引物，导入Nde I位点：(SEQ ID NO 18) TGCATGCATATGACAGGCTGTCTGAAAATTG 下引物，导入Hind III位点：(SEQ ID NO 19) TAAGTGTAAGCTTGACTGTGGGGGCGGTGAAAG 来自具有其它焦磷酸盐基因的基因组的推断序列的比对表明：后一 个ATG应该是起始蛋氨酸，并非数据库所显示的那样(图11SEQ ID NO.1 中的斜体显示)，并且酶的氨基酸序列实际上如SEQ ID NO 25所示。 因此根据后一个蛋氨酸设计引物(图11SEQ ID NO.1中的黑体显示)。 采用100ng的Aeropyrum pernix DNA和50pM的上述引物，在 100μl反应体积中进行PCR。进行20个循环，55℃退火，45秒延伸时 间。 最初在94℃保持3分钟。 20个循环的94℃，10秒，55℃，10秒，68℃，45秒。 最终在72℃保持7分钟。 PCR条件 50pM上引物(5’......TGCATGCATATGACAGGCTGTCTGAAAATTG..3′-SEQ ID NO 18) 50pM下引物(5’......TAAGTGTAAGCTTGACTGTGGGGGCGGTGAAAG..3′- SEQ ID NO 19) 1.5mM MgCl2 1.25u Accurase DNA聚合酶(Cat.No.AC001，GeneSys Ltd.) 75mM Tris，pH8.8 20mM硫酸铵 0.1％(w/v)Tween20 100ng Aeropyrum pernix基因组DNA PCR产物长度为686个碱基对，如图13所示。按照生产商推荐条 件采用PrepanolTM(Cat.No.P001，GeneSys Ltd.)沉淀PCR产物， 并最终重悬浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。 采用限制酶Nde I和Hind III消化PCR产物，苯酚提取，乙醇沉 淀，并重悬浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。 pTTQ18NHK载体(如图15所示)也由Nde I和Hind III消化， 苯酚提取，乙醇沉淀，并重悬浮于10mM Tris，0.1mM EDTA中。 在1×NEB连接缓冲液中，采用200u的New England Biolabs T4 DNA 连接酶使100ng切割的PCR序列与1μg切割的pTTQ18NHK载体连接， 总体积为10μl，16℃下过夜(见图16)。质粒载体是pTTQ18NHK，即 载体pTTQ18的修饰形式(StarkMJ，Gene，1987；51(2-3)：255-67)， 该修饰载体含有插入在独特的Eco0109 I限制酶位点的卡那霉素抗生 素基因，和插入在原始载体的EcoR I位点和Hind III位点之间的替 代多接头(见图14)。 添加20μl水，并把反应加热到70℃持续20分钟。添加1/10体积 pH5.2的3M乙酸钠和2体积乙醇。混匀后在-20℃存放1小时。在 10,000g微离心10分钟后，从沉淀的DNA中移去上清液，并在5μl水 中重悬浮DNA。 通过电穿孔将0.5μl导入大肠杆菌TOP10F’细胞中，并在37℃恢 复1小时后，将细胞的等分试样平铺在卡那霉素Luria Broth琼脂平 板上。在37℃温育过夜。 将菌落在新鲜卡那霉素Luria培养液琼脂平板上，和添加有1μl 20mg/ml XGAL及1μl0.5M IPTG/毫升琼脂凝胶的卡那霉素Luria培 养液琼脂平板(KIX平板)上以双份铺格。 在37℃温育过夜后，通过PCR以M13正向和反向引物筛选在KIX 平板上的白色菌落，以检测相应于Aeropyrum pernix PCR产物的插 入是否存在。 当含有701bp产物的9个菌落在加有100μg/ml卡那霉素的20ml LB中生长至OD600＝1.0时，通过添加IPTG至0.5mM的最终浓度，以 诱导表达。细胞进一步生长4小时，然后收获细胞，并于-20℃冷冻存 放。 通过添加0.5ml含50mM pH7.9的Tris-HCl、50mM葡萄糖、1mM EDTA的溶液和0.5ml含10mM pH7.9的Tris-HCl、50mM KCl、1mM EDTA、0.5％(v/v)Tween20、0.5％(v/v)Nonidet-P40的溶液，并于80 ℃温育15分钟以裂解细胞。 室温下10,000g离心10分钟后，通过凝胶浓度为12％的SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析取自每一裂解细胞的等分试样。电泳完成后，采 用考马斯亮蓝R250进行染色。所有样品均显示大约23kDa的条带与推 定的PPase大小符合。 然后采用Jukka K.Heinonen，Reijo J.Lahti.(1981) Analytical Biochemistry，Vol.113，pp313-317描述的比色分析 法检验同一样品在75℃的PPase活性。 所有样品均显示阳性，证实表达的蛋白质具有嗜热无机焦磷酸酶活 性。 随后利用第一个克隆大规模制备蛋白质。 焦磷酸酶的纯化 将该克隆培养在24升的LB中。一旦OD600达到大约1.5的时候， 采用0.5mM IPTG诱导培养物，并继续生长4小时。然后收获细胞，并 裂解细胞沉淀。通过在苯基-琼脂糖凝胶CL4B(Amersham Pharmacia Biotech)、羟磷灰石(Bio-rad Laboratories)及Hi-Performance Q琼脂糖凝胶(Amersham Pharmacia Biotech)上进行标准柱层析以 纯化表达的酶，最后将纯化的酶-20℃存放在含有下列物质的溶液中： 20mM Tris-HCl，pH8.0、100mM NaCl、0.5％(v/v)Tween 20、 0.5％(v/v)Nonidet P40、0.1mM EDTA、1mM二硫苏糖醇、50％甘油。 实施例10 采用A.pernix无机焦磷酸酶的PCR试验 采用A.pernix无机焦磷酸酶进行本发明的方法。试验基于人类 B-肌动蛋白基因的扩增。 该试验中，采用获得自Eurogentec S.A.，ParcScientifique du Sart-Tilman，rue Bois Saint-Jean 14，4102 SERAING，Belgium(Cat. No.RT-QP73-05)的试剂盒。标准Taq聚合酶被试剂盒提供的HotStart Taq聚合酶替代。 PCR反应混合物 1×反应缓冲液 200μM，dATP，dCTP，dGTP和400μM dUTP 0.025u/μl未修饰Taq聚合酶 0.025u/μl Aeropyrum pernix无机焦磷酸酶 0.3μM 5’引物(5′GAC TCG TCA TAC TCC TGC TTG CT 3′-SEQ ID NO 22) 0.3μM 3’引物(5′CAT TGC CGA CAG GAT GCA GAA 3′-SEQ ID NO 23) 0.15μM Taqman探针(FAM-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGACAGT-TAMRA- SEQ ID NO 24) 5mM MgCl2 2mM NaPPi 被动参考 从7.5ng(2500拷贝)起始对人类基因组DNA进行1∶4稀释。 循环条件 94℃最初变性3分钟 40个循环的94℃，15秒和60℃，60秒 结果如图19所示。 总之，我们相信采用本发明方法，利用焦磷酸盐抑制PCR，并随后 消除抑制作用，例如80℃-95℃通过利用耐热PPase，表现方式与 HotStart PCR相同，但快速并兼具增加特异性的益处。 在以上说明书中提到的文献在此引入，作为参考。本发明的其它修 改没有背离发明范围和精神，并且对本领域内的技术人员来说是显而 易见的。尽管本发明是连同特定优选实施方案一起被描述的，仍然应 当理解权利要求的发明不应当过度局限于这些特定实施方案。实际 上，如本领域技术人员所熟知的，对描述的实施发明的方式所进行的 多种修改应该被包括在下文权利要求的范围内。 序列表 <110>英国国防部 英国威尔特郡 <120>扩增方法 <130>CG/P/133/WOD <140> <141> <150>GB 0110501.4 <151>2001-04-30 <160>26 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>960 <212>DNA <213>Aeropyrum pernix <400>1 taatcctaat tcgctttatg tggacgatcc ttcccagcaa aaccgggttt gttaacagcc 60 ttagctttat aactcgacta gccaaactat cggttagacg ggtgcatgca atgacaggct 120 gtctgaaaat tggtcctgga gatgaggctc cagatgttgt gaatgtcgtt atagagatac 180 ctatgaacag ttctgttaag tacgagttcg acaaggaggc gtgtattgtt aaggttgata 240 ggttccttta caccagcatg gtctacccct tcaactacgg gttcatacca ggcactctag 300 aggaggacgg agatcctgtt gacgttctag ttattagccg ggagcccgtt gctcccggct 360 cgcttataga ggctgtgccc gtggccgtgt tagacatgga ggacgaggag ggtccggaca 420 gcaaggttgt tgccgtaccc aaggccaagc tggaccccct attcgccagc tataaggacg 480 ttggcgacat acctgatgcc ctgaaatcca agataaagca cttcttcgag cactataagg 540 agctggagcc tggaaagtgg gttagagtga ctggatggag gcctgctgcc gatgcgaagg 600 agattataag gagggctata gagaggtata agggggcgtg atgagggctt aacggctcac 660 gttttctggg agagtgtcgc acctttgagg gcgatcaccc tcgccagcgt gcgtgtgctt 720 ttgtctatga ttatggctac agttcttcta gccgctttca ccgcccccac agtcaataca 780 cttacaccta gaggttctgc gctgtatgct gtggatgtag ttgtagtaga cgccagcaca 840 ggatctgccc tggggttctc ccggtttgtc gtatccgcct acagaggggg ggtcggggat 900 gtgggtgtta tctactcttc gggggtctca gtatcagggt ctagtctgga aaggctgctg 960 <210>2 <211>207 <212>PRT <213>Aeropyrum pernix <400>2 Met Trp Thr Ile Leu Pro Ser Lys Thr Gly Phe Val Asn Ser Leu Ser 1 5 10 15 Phe Ile Thr Arg Leu Ala Lys Leu Ser Val Arg Arg Val His Ala Met 20 25 30 Thr Gly Cys Leu Lys Ile Gly Pro Gly Asp Glu Ala Pro Asp Val Val 35 40 45 Asn Val Val Ile Glu Ile Pro Met Asn Ser Ser Val Lys Tyr Glu Phe 50 55 60 Asp Lys Glu Ala Cys Ile Val Lys Val Asp Arg Phe Leu Tyr Thr Ser 65 70 75 80 Met Val Tyr Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Ile Pro Gly Thr Leu Glu Glu 85 90 95 Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Ile Ser Arg Glu Pro Val Ala 100 105 110 Pro Gly Ser Leu Ile Glu Ala Val Pro Val Ala Val Leu Asp Met Glu 115 120 125 Asp Glu Glu Gly Pro Asp Ser Lys Val Val Ala Val Pro Lys Ala Lys 130 135 140 Leu Asp Pro Leu Phe Ala Ser Tyr Lys Asp Val Gly Asp Ile Pro Asp 145 150 155 160 Ala Leu Lys Ser Lys Ile Lys His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu 165 170 175 Glu Pro Gly Lys Trp Val Arg Val Thr Gly Trp Arg Pro Ala Ala Asp 180 185 190 Ala Lys Glu Ile Ile Arg Arg Ala Ile Glu Arg Tyr Lys Gly Ala 195 200 205 <210>3 <211>173 <212>PRT <213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus) <400>3 Met Lys Leu Ser Pro Gly Lys Asn Ala Pro Asp Val Val Asn Val Leu 1 5 10 15 Val Glu Ile Pro Gln Gly Ser Asn Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Asp Glu 20 25 30 Glu Gly Val Ile Lys Val Asp Arg Val Leu Tyr Thr Ser Met Asn Tyr 35 40 45 Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Ile Pro Gly Thr Leu Glu Glu Asp Gly Asp 50 55 60 Pro Leu Asp Val Leu Val Ile Thr Asn Tyr Gln Leu Tyr Pro Gly Ser 65 70 75 80 Val Ile Glu Val Arg Pro Ile Gly Ile Leu Tyr Met Lys Asp Glu Glu 85 90 95 Gly Glu Asp Ala Lys Ile Val Ala Val Pro Lys Asp Lys Thr Asp Pro 100 105 110 Ser Phe Ser Asn Ile Lys Asp Ile Asn Asp Leu Pro Gln Ala Thr Lys 115 120 125 Asn Lys Ile Val His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu Glu Pro Gly 130 135 140 Lys Tyr Val Lys Ile Ser Gly Trp Gly Ser Ala Thr Glu Ala Lys Asn 145 150 155 160 Arg Ile Gln Leu Ala Ile Lys Arg Val Ser Gly Gly Gln 165 170 <210>4 <211>176 <212>PRT <213>大肠杆菌(Escherichia coli) <400>4 Met Ser Leu Leu Asn Gly Pro Ala Gly Lys Asp Leu Pro Glu Asp Ile 1 5 10 15 Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Ala Asn Ala Asp Pro Ile Lys Tyr Glu 20 25 30 Ile Asp Lys Glu Ser Gly Ala Leu Phe Val Asp Arg Phe Met Ser Thr 35 40 45 Ala Met Phe Tyr Pro Cys Asn Tyr Gly Tyr Ile Asn His Ile Leu Ser 50 55 60 Leu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Pro Thr Pro Tyr Pro Leu 65 70 75 80 Gln Pro Gly Ser Val Ile Arg Cys Arg Pro Val Gly Val Leu Lys Met 85 90 95 Thr Asp Glu Ala Gly Glu Asp Ala Lys Leu Val Ala Val Pro His Ser 100 105 110 Lys Leu Ser Lys Glu Tyr Asp His Ile Lys Asp Val Asn Asp Leu Pro 115 120 125 Glu Leu Leu Lys Ala Gln Ile Ala His Phe Phe Glu His Tyr Lys Asp 130 135 140 Leu Glu Lys Gly Lys Trp Val Lys Val Glu Gly Trp Glu Asn Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Glu Ile Val Ala Ser Phe Glu Arg Ala Lys Asn Lys 165 170 175 <210>5 <211>178 <212>PRT <213>Aquifex aeolicus <400>5 Met Gly Tyr Asp Gln Leu Pro Pro Gly Lys Asn Pro Pro Glu Asp Ile 1 5 10 15 Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Gln Gly Ser Ala Val Lys Tyr Glu Leu 20 25 30 Asp Lys Asp Thr Gly Val Ile Phe Val Asp Arg Phe Leu Phe Thr Ala 35 40 45 Met Tyr Tyr Pro Phe Asn Tyr Gly Phe Val Pro Gln Thr Leu Ala Asp 50 55 60 Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Ile Ser Arg Glu Pro Val Val 65 70 75 80 Pro Gly Ala Val Met Arg Cys Arg Pro Ile Gly Met Leu Glu Met Arg 85 90 95 Asp Glu Ala Gly Ile Asp Thr Lys Val Ile Ala Val Pro His Glu Lys 100 105 110 Leu Asp Pro Ser Tyr Ser Asn Ile Lys Thr Val Asp Asn Leu Pro Glu 115 120 125 Ile Val Arg Glu Lys Ile Lys His Phe Phe Glu His Tyr Lys Glu Leu 130 135 140 Glu Pro Gly Lys Trp Val Lys Val Glu Asn Trp Lys Gly Leu Gln Asp 145 150 155 160 Ala Ile Glu Glu Ile Lys Lys Gly Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Asn Lys 165 170 175 Glu Gly <210>6 <211>178 <212>PRT <213>Pyrococcus horikoshii <400>6 Met Asn Pro Phe His Asp Leu Glu Pro Gly Pro Asn Val Pro Glu Val 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Lys Gly Ser Arg Asn Lys Tyr Glu 20 25 30 Leu Asp Lys Glu Thr Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Val Leu Tyr Thr 35 40 45 Pro Phe His Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Ile Ile Pro Arg Thr Trp Tyr 50 55 60 Glu Asp Gly Asp Pro Phe Asp Ile Met Val Ile Met Arg Glu Pro Thr 65 70 75 80 Tyr Pro Leu Thr Ile Ile Glu Ala Arg Pro Ile Gly Leu Phe Lys Met 85 90 95 Ile Asp Ser Gly Asp Lys Asp Tyr Lys Val Leu Ala Val Pro Val Glu 100 105 110 Asp Pro Tyr Phe Lys Asp Trp Lys Asp Ile Ser Asp Val Pro Lys Ala 115 120 125 Phe Leu Asp Glu Ile Ala His Phe Phe Lys Arg Tyr Lys Glu Leu Glu 130 135 140 Gly Lys Glu Ile Ile Val Glu Gly Trp Glu Gly Ala Glu Ala Ala Lys 145 150 155 160 Arg Glu Ile Leu Arg Ala Ile Glu Met Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Lys 165 170 175 Lys Glu <210>7 <211>178 <212>PRT <213>Pyrococcus abyssi <400>7 Met Asn Pro Phe His Asp Leu Glu Pro Gly Pro Asn Val Pro Glu Val 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu Ile Glu Ile Pro Lys Gly Ser Arg Asn Lys Tyr Glu 20 25 30 Leu Asp Lys Lys Thr Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Val Leu Tyr Ser 35 40 45 Pro Phe Phe Tyr Pro Val Asp Tyr Gly Ile Ile Pro Arg Thr Trp Tyr 50 55 60 Asp Asp Asp Asp Pro Phe Asp Ile Met 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ccaacttaat cgccttgcag 2160 cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 2220 aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 2280 tgtgcggtat ttcacaccgc ataaattccc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 2340 ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 2400 agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 2460 gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 2520 aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 2580 cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 2640 gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 2700 gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttcctgtc gtcatatcta caagccatcc 2760 ccccacagat acggtaaact agcctcgttt ttgcatcagg aaagcaggga atttatggtg 2820 cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 2880 acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 2940 gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 3000 acgaaagggc ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 3060 tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 3120 ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 3180 acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 3240 ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagnt tatgcatttc tttccagact 3300 tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta 3360 ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta 3420 caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca 3480 cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccngggat cgcagtggtg 3540 agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat 3600 tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg 3660 ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca 3720 cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg 3780 gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa 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cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 780 taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 840 cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 900 gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 960 gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1020 agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1080 aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1140 agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1200 cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1260 accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1320 aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1380 ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1440 cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1500 gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 1560 tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 1620 agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 1680 aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gaattaattc tcatgtttga 1740 cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc 1800 tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc 1860 ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat 1920 gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 1980 ttcacacagg aaacacatat atgcaccacc accaccacca tatgacaggc tgtctgaaaa 2040 ttggtcctgg agatgaggct ccagatgttg tgaatgtcgt tatagagata cctatgaaca 2100 gttctgttaa gtacgagttc gacaaggagg cgtgtattgt taaggttgat aggttccttt 2160 acaccagcat ggtctacccc ttcaactacg ggttcatacc aggcactcta gaggaggacg 2220 gagatcctgt tgacgttcta gttattagcc gggagcccgt tgctcccggc tcgcttatag 2280 aggctgtgcc cgtggccgtg ttagacatgg aggacgagga gggtccggac agcaaggttg 2340 ttgccgtacc caaggccaag ctggaccccc tattcgccag ctataaggac gttggcgaca 2400 tacctgatgc cctgaaatcc 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