[0001] 本发明涉及一种核酸恒温扩增技术领域，特别涉及模板长度大于500 bp的双链DNA分子的恒温扩增技术领域。

[0002] 1983年，Mullis等发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，由于其在灵敏度和特异性方面的优势，被迅速运用于科学研究和临床研究的各个方面。这种技术主要依赖于与靶序列两段互补的寡核苷酸引物，利用热循环实现信号放大。反应主要包括模板高温变形、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，经过多次循环反应，使得低浓度的靶标可以被扩增到可检测的水平。这一技术极大地促进了生物研究的进展。

[0003] PCR技术在应用上的几点限制：第一，该技术需要昂贵的实验仪器，同时该机器需要具备精确的控温程序，以保证模板链在高温下变形，保证模板链与引物在较低温度下退火，同时重复高温、冷却、保温等步骤。为了保证仪器在短时间内完成温度变化，需要配备银制或者金制的加热模块，仪器成本显著增加。第二，扩增体系中的酶必须耐受高温，否则每次进入新循环时需要补加酶，容易造成污染。第三，在扩增反应中，退火时间短，必须有过量的引物才能使引物与模板上相应的序列快速配对。但是过量的引物会与模板错配，引发非特异性扩增，引物二聚体等问题。

[0004] 1991年Compton等发明了依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA），该技术是一种基于转录的扩增技术，反应温度为37 -41 ºC。反应涉及三种酶：T7 RNA聚合酶（对T7启动子序列具有高度特异性，以含有T7启动子序列的双链DNA为模板，合成与启动子下游的DNA互补的RNA），AMV反转录酶（以RNA为模板合成DNA，以DNA为模板合成DNA），RNase H酶（降解DNA/RNA杂合分子中的RNA链）。反应涉及两条引物：正向引物5′端是T7 启动子序列，3′端序列与靶标DNA3′端序列互补；反向引物与cDNA 的3′端序列互补。过程如下：正向引物结合到靶标DNA上，在AMV逆转录酶作用下延伸，反向引物结合到正向引物延伸后形成的DNA上，以正向引物延伸后形成的DNA为模板进行延伸，由于正向引物5′端含有T7启动子序列，因此反向引物延伸到此位置后便形成双链T7启动子。T7 RNA聚合酶识别T7启动子，并以启动子下游的DNA为模板转录合成RNA，由此，NASBA进入了循环扩增模式，得到大量RNA扩增子。

[0005] NASBA技术的特点：第一，该技术是恒温扩增反应，反应温度为37 -41 ºC，不需要使用精密的温度循环仪器。第二，扩增反应涉及AMV逆转录酶，适合RNA模板。第三，扩增的产物是单链RNA。第四，反应需要三种酶协同作用。第五，靶标长度限定在100-250个碱基。

[0018] 一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为8.5。

[0019] 上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于捷瑞（上海）生物科技公司。

[0020] 上述反应试剂氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、盐酸（HCl）购于上海林峰精细化工有限公司。

[0021] 上述反应试剂二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma-Aldrich公司（Saint Louis，美国）。

[0022] 上述反应试剂T7 RNA 聚合酶、AMV反转录酶、RNase H酶、牛血清白蛋白（BSA）购于纽英伦生物技术公司（Nebraska，美国）。

[0023] 上述反应试剂核糖核苷酸（NTP）、RNA酶抑制剂（RNase inhibitor）购于赛默飞世尔科技有限公司（北京，中国）。

[0024] 上述反应试剂脱氧核糖核苷酸（dNTP）购于生工公司（上海，中国）。

[0025] 一种连接反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为7.9。

[0026] 上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。

[0027] 扩增反应引物的设计依据为靶标模板的序列。

[0028] Tris–HCl的作用在于维持一定的pH，以便酶在最适pH下进行扩增反应，其浓度可以根据需要进行相应的调整。

[0029] KCl的作用在于提供一定的例子浓度，其用量可以根据核酸扩增情况进行一定的调整。

[0030] T7 RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNase H酶的用量可以根据需要调整。

[0031] 恒温扩增反应后可以用凝胶电泳对反应产物进行检测。

[0032] 一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与扩增反应试剂混合，恒温扩增至预期量后，完成恒温扩增。

[0033] 作为上述反应试剂的进一步改进，恒温扩增的温度为37 -41 ºC。

[0034] 下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

[0035] 实施例1：一种长双链DNA的剪切反应试剂的具体成分如下：
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。

[0036] 一种连接反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。

[0037] 一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于捷瑞（上海）生物科技公司。

[0038] 上述反应试剂氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、盐酸（HCl）购于上海林峰精细化工有限公司。

[0039] 上述反应试剂二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma-Aldrich公司（Saint Louis，美国）。

[0040] 上述反应试剂T7 RNA 聚合酶、AMV反转录酶、RNase H酶、牛血清白蛋白（BSA）购于纽英伦生物技术公司（Nebraska，美国）。

[0041] 上述反应试剂核糖核苷酸（NTP）、RNA酶抑制剂（RNase inhibitor）购于赛默飞世尔科技有限公司（北京，中国）。

[0042] 上述反应试剂脱氧核糖核苷酸（dNTP）购于生工公司（上海，中国）。

[0043] 实施例2同实施例1，不同之处在于长双链DNA的剪切反应试剂，具体成分如下：
上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。

[0044] 下面结合具体的实验，进一步说明本发明。

[0045] 鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的invA基因的恒温扩增正向引物：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAATAGAGAAGACAAC
AAAACCCACC
反向引物：GCCGATGCCGGTGAAATTATCG
正向T7序列：CGTTCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTT
GAGGGGTTTTTTGGATCACTAATACGACTCACTATAGGGC
反向T7序列：CATGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATCCAAAAAAC
CCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGAA
本实施例用鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的invA基因作为样本，用无菌双蒸水作为阴性对照，在反应管中加入不同浓度的基因样本，同时进行恒温扩增反应。37 ºC反应60 min后取出反应管。取出9 μL反应液混合1μL 10 x Loading buffer后进行电泳，电泳结果显示84 bp处有条带，阴性对照则没有。（结果见附图1）
质粒pET28a上随机500 bp序列的扩增
正向引物：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGACGCGTCAGTGGGCT
GATCATTAAC
反向引物：GCGCGATTTGCTGGTGACCCAAT
正向T7序列：ATCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA
GGGGTTTTTTGGATCACTAATACGACTCACTATAGGGA
反向T7序列：CGCGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATCCAAAAAACC
CCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGGAT
本实施例用pET28a上随机500 bp序列作为样本，为阳性组，用无菌双蒸水作为阴性对照，同时进行恒温扩增反应。37 ºC反应60 min后取出反应管。取出9 μL反应液混合1μL 10 x Loading buffer后进行电泳，电泳结果显示200 bp处有条带，阴性对照则没有。（结果见附图2）。