[0001] 本发明属于生物育种的技术领域，具体涉及到一种利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法。

[0002] 羊肚菌(Morchella spp.)属于子囊菌门（Ascomycota），盘菌纲（Pezizomycetes），盘菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceae），是国际上公认的珍贵食药兼用真菌。羊肚菌质地柔嫩，风味独特，并具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节和抗肿瘤等多种生理活性。目前我国规模化推广的羊肚菌室外“土壤栽培模式”于2012年首先在我国川渝地区成功应用，并很快推广到全国各地。据不完全统计，2021年我国羊肚菌栽培面积为25万亩（1亩为666.7 2
m）左右，遍布全国除海南省以外的其他各省市区。

[0003] 目前的羊肚菌育种主要依靠常规的自然选育，即从野生或栽培的子囊果出发，通过组织分离、多孢分离或单孢分离获得大量菌丝体分离物，再从中筛选理想的生产菌株。然而，随着羊肚菌人工栽培规模和面积的不断扩大，再加上羊肚菌本身容易老化和退化，自然羊肚菌种植资源日益枯竭等原因，使得优质栽培菌株（品种）的选育速度远远跟不上羊肚菌人工栽培发展的步伐，这也是影响羊肚菌栽培的稳定性，造成菇农损失的重要原因之一。因此，寻求高效育种新技术，促进羊肚菌良种选育，对稳定羊肚菌生产和获取人工栽培理想的经济效益具有显著的现实意义。

[0004] 羊肚菌为土生菌，而土壤是微生物的大本营。羊肚菌在生长发育过程中，与土壤中的很多其他微生物发生着非常复杂的生态互作，包括拮抗、竞争和共生等，其中最重要的为共生关系。按照目前人们普遍接受的广义共生概念，共生不仅仅是一对一的互利共生关系，其实是包含互利共生、偏利共生和拮抗/寄生在内的共生连续体。在微生物之间的共生互作中，研究最为深入的是细菌‑真菌互作，即定殖于真菌菌丝细胞质或孢子细胞质内的内生细菌与真菌通过对抗、合作、协同、共栖及共生等类型的互作对彼此的生物学产生重要影响。

[0005] 近年来，采取组学技术等先进技术手段，表征了羊肚菌生长发育过程中相关微生物群落变化规律，发现了一些可能对羊肚菌生长发育具有促进作用的细菌。例如，Zhang et al. (2019)采用复制子测序技术研究了人工栽培六妹羊肚菌等不同发育阶段的土壤细菌群落多样性，发现在原基分化阶段具有出乎预期高比例的假单胞菌(25.30%)，暗示假单胞菌可能影响羊肚菌生长（Zhang F, Long L, Hu Z, Yu X, et al. Analyses of artificial morel soil bacterial community structure and mineral element contents in ascocarp and the  cultivated soil.  Canadian Journal of Microbiology, 2019, 65: 738‑749）。Lü et al. (2021) 采用复制子测序检测了尖顶羊肚菌（M. conica）发育子实体的细菌群落动态变化，转录组共表达分析发现细菌群落在调节羊肚菌基因表达中可能发挥重要作用；该研究发现，黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）和土地杆菌（Pedobacter）在尖顶羊肚菌子实体的全部发育阶段占优势，暗示其在羊肚菌发育中发挥功能；该研究发现几种内生细菌群落，包括草螺菌、土地杆菌、Arsenicitalea和杜擀氏菌（Duganella）与“细胞壁”和“蛋白酶调节亚基”富集的模块高度相关联，表明细菌群落可能通过调节与细胞壁合成和蛋白酶体相关途径特定酶的表达而促进子实体发育（Lü BB, Wu GG, Sun Y, Zhang LS, et al. Comparative transcriptome and endophytic bacterial community analysis of Morchella conica SH. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 682356）。

[0006] 我们也采取宏基因组学技术（复制子测序等）进行了土壤微生物群落对羊肚菌生长发育影响的相关研究。我们的研究发现，与羊肚菌发育相关的细菌菌群有副土地杆菌（Parapedobacter）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）等，这些细菌在播种前少量存在，菌丝体阶段大量富集，原基期和收获期种群数量减少，这些细菌可能是由羊肚菌菌丝养殖后期被羊肚菌降解作为营养消耗掉了。短波单胞菌属（Brevundimonas）、土地杆菌属（Pedobacter）、嗜甲基菌属（Methylobacillus）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）、马赛菌（Massilia）和草螺菌（Herbaspirillum）、杜擀氏菌（Duganella）、氢噬菌属（Hydrogenophaga）等在原基期大量富集，表明它们可能与促进羊肚菌的原基和子实体发育有关。

[0007] 在国外，人工内共生化（artificial endosymbiosis）为合成生物学的范畴，是指涉及建立自然界不存在的理想宿主内共生体关系的试验生物学或合成生物学过程。人工内共生化的终极目标是构建新型生物合成途径，可用于生物燃料生产、食品和农业、发酵工业、生物修复等行业；在新型代谢产物、生物肥料、化学品、酶和其他生物活性分子生产中也具有潜在应用价值；此外，还可用于建立在外空间和其他星球可以存活，或者可以适应地球巨大气候变化条件的新型生命形式（Puri KM, Butardo Jr V, Sumer H. Evaluation of natural endosymbiosis for progress towards artificial endosymbiosis. Symbiosis, 2021, 84: 1‑17）。然而，国内外均没有利用人工内共生化技术进行羊肚菌育种的研究和应用报道。

[0008] 本发明将这些微生物（对羊肚菌人工栽培有益酵母菌和细菌）导入羊肚菌栽培菌株菌丝细胞内部，使双方建立了稳定的内共生关系，研究了外源有益微生物导入对羊肚菌生长发育的影响，建立了人工内共生化技术，发现该技术在选育羊肚菌产量高、抗性强等优质菌株方面具有较大的推广应用潜力。

[0027] 下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

[0028] 实施例1本实施例的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种，步骤如下：
（1）育种出发羊肚菌菌株的活化培养：选定羊肚菌（菌株保藏编号：CCTCC KF 
2008790）为育种的出发菌株，将出发菌株接种CYM平板，20℃倒置避光培养至满板。

[0029] （2）限制马拉色菌导入羊肚菌菌丝细胞内部：在CYM平板一边划线接种限制马拉色菌（菌株保藏编号：ATCC 96810）（划线宽度2 cm左右），然后在离酵母菌划线区域2 cm处接种羊肚菌菌种块，20℃倒置培养1～2周，取长到酵母菌划线区域不同位置的羊肚菌培养物转接CYM斜面，斜面长满后，取爬壁的羊肚菌菌丝片段接种新的CYM斜面，纯化3次，斜面培养物于4 ℃保存。

[0030] （3）确证双方已经建立内共生化关系：采取PCR扩增法结合扫描电镜法确证双方已经建立内共生关系。

[0031] PCR扩增法：采取玻璃纸覆盖CYM平板法收集纯化羊肚菌菌株的菌丝体，菌丝体加入液氮充分磨碎，然后采取文献报道的方法（孙婷婷，赵明，李亚莉，等. 普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法研究. 中国农学通报，2011，27(15)：249‑253）提取已经转入马拉色菌或没有转入马拉色菌的羊肚菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以Malup：5’–GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG–3’和Maldown：5’–GGT CCG TGT TTC AAG ACG G–3’为引物对，扩增酵母菌扩增26S rDNA D1/D2 区序列，以不加模板的扩增体系为阴性对照，如果纯化后的羊肚菌扩增体系能扩增出酵母菌的26S rDNA D1/D2 区序列，则说明外源限制马拉色菌可能已经进入羊肚菌菌丝细胞内部。

[0032] 扫描电镜法：取新鲜内共生羊肚菌菌株、羊肚菌对照菌株和马拉色菌培养物，用体积分数 2.5% 的戊二醛4℃固定过夜，用无菌水清洗 2～3 遍，每次3 min ；用体积分数为25%、50%、75%、85%、95%、100%的乙醇溶液梯度脱水，每次15～20 min；脱水剂无水乙醇用 
100% 的醋酸异戊酯置换 2 次，每次 15 min。最后将处理后的样品置于二氧化碳临界点干燥仪中干燥处理。将导电胶带黏在扫描电镜载物台上，之后将干燥后的菌丝细胞小心的黏在导电胶带上，再用新的导电胶带对着已经粘好的菌丝细胞对贴后撕拉，目的使干燥的细胞产生撕裂，可以在随后的观察中观察到细胞内部的结构特征；将撕裂后的样本置于喷金设备中进行喷金后采用扫描电子显微镜观察和拍照。

[0033] 图4为检测马拉色菌是否转入羊肚菌菌丝细胞的PCR扩增结果。采取文献报道的方法（孙婷婷，赵明，李亚莉，等. 普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法研究. 中国农学通报，2011，27(15)：249‑253）提取已经转入马拉色菌或没有转入马拉色菌的羊肚菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，分别采用羊肚菌交配型基因特异性引物对MAT1‑1‑1F/R和马拉色菌26 S rDNA D1/D2区序列特异性引物（Malup/Maldown）进行PCR扩增，目标扩增产物分别为412 bp的羊肚菌交配型MAT 1‑1‑1基因片段和620 bp的马拉色菌26 S rDNA D1/D2区片段，扩增产物点样进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，第13和14泳道为未加模板的对照扩增，没有任何DNA条带；第1、3、5、7、9和11泳道为未转入马拉色菌的羊肚菌扩增结果，仅扩增出412 bp的羊肚菌交配型MAT 1‑1‑1基因片段；第2、4、6、8、10和12泳道为转入马拉色菌的羊肚菌扩增结果，仅扩增出620 bp马拉色菌26 S rDNA D1/D2区片段。

[0034] 采取PCR扩增法结合扫描电镜法，确证双方已经建立内共生关系。成功建立马拉色菌与羊肚菌内共生关系的羊肚菌菌株，采用扫描电子显微术观察，可在羊肚菌菌丝细胞内观察到马拉色菌细胞（见附图1右图）；采用马拉色菌26 S rDNA D1/D2区序列特异性引物（Malup/Maldown）进行PCR扩增，扩增产物点样1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，能够出现620 bp的马拉色菌26 S rDNA D1/D2区目标DNA片段（见附图4的第2、4、6、8、10和12泳道结果）。如果PCR扩增法和扫描电子显微术观察都出现阳性结果，则表明马拉色菌成功与羊肚菌建立了内共生关系。

[0035] （4）内共生化菌株培养性状测定：以初始羊肚菌菌株为对照，测定内共生酵母菌的羊肚菌菌株在生长适宜pH、温度范围内的菌丝生长速度和菌丝生物量；测定不同浓度重金属（铬、铅、锌、铜等）、扁桃酸（土壤酚酸自毒物质）等对内共生酵母菌的羊肚菌菌株生长的影响；测定内共生酵母菌的羊肚菌菌株在无氮培养基（测定固氮能力）和低碳培养基（测定对营养贫乏的胁迫抗性）的菌丝生长速度和菌丝生物量。测定表明，内共生限制马拉色菌的羊肚菌菌株在30℃培养菌丝生物量显著高于对照羊肚菌，表明内共生羊肚菌菌株对高温的抗性显著增强；在1/4和1/8 CYM培养基上培养菌丝生物量显著高于对照，表明对贫营养环境的抗性显著增强；内共生关系的建立对重金属ZnCl2、Pb（NO3）2和酚酸类自毒物质扁桃酸的适应性均显著提升。

[0036] （5）内共生化菌株生产性状测定：将羊肚菌对照菌株和建立内共生关系的菌株，在2
三地同时实验性栽培（每个菌株均为3 m），观察和记录产菌霜时间和相对强度、原基产生时间和多少、幼菇产生时间和多少、第一茬菇单位产量等产量性状，发现与马拉色菌建立内共生关系的羊肚菌菌株菌霜生长情况优于对照菌株；原基多，且分化快，出菇时间提前，幼菇数量也远比对照菌株高；相对于对照菌株，羊肚菌内共生化菌株产量提高3.5倍，显示良好的增产潜力。

[0037] 实施例2本实施例的利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种，步骤如下：
（1）育种出发羊肚菌菌株的活化培养：选定羊肚菌（菌株保藏编号：CCTCC KF 
2008793）为育种的出发菌株，将出发菌株接种CYM平板，20℃倒置避光培养至满板。

[0038] （2）土地杆菌导入羊肚菌菌丝细胞内部：在CYM平板一边划线接种土地杆菌（如土地土地杆菌，CGMCC编号1.15993）（划线宽度2 cm左右），然后在离酵母菌划线区域2 cm处接种羊肚菌菌种块，20℃倒置培养1～2周，取长到细菌划线区域不同位置的羊肚菌培养物转接CYM斜面，斜面长满后，取爬壁的羊肚菌菌丝片段接种新的CYM斜面，纯化3次，斜面培养物于4 ℃保存。

[0039] （3）确证双方已经建立内共生化关系：采取PCR扩增法结合扫描电镜法确证双方已经建立内共生关系。

[0040] PCR扩增法：采取玻璃纸覆盖CYM平板法收集纯化羊肚菌菌株的菌丝体，菌丝体加入液氮充分磨碎，采取文献报道的方法（孙婷婷，赵明，李亚莉，等. 普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法研究. 中国农学通报，2011，27(15)：249‑253）提取已经转入土地杆菌或没有转入土地杆菌的羊肚菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以通用引物27 F 5'–AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG–3'和1492 R 5'–TAC GAC TTA ACC CCA ATC GC–3'为引物对扩增细菌16S rDNA序列，以不加模板的扩增体系为阴性对照，如果纯化后的羊肚菌扩增体系能扩增出细菌的16S rDNA序列，则说明外源土地杆菌可能已经进入羊肚菌菌丝细胞内部。

[0041] 扫描电镜法：取新鲜内共生羊肚菌菌株、羊肚菌对照菌株和细菌培养物，用体积分数 2.5% 的戊二醛4℃固定过夜，用无菌水清洗 2～3 遍，每次3 min；用体积分数为25%、50%、75%、85%、95%、100%的乙醇溶液梯度脱水，每次15～20 min；脱水剂无水乙醇用 100% 的醋酸异戊酯置换 2 次，每次 15 min。最后将处理后的样品置于二氧化碳临界点干燥仪中干燥处理。将导电胶带黏在扫描电镜载物台上，之后将干燥后的菌丝细胞小心黏在导电胶带上，再用新的导电胶带对着已经粘好的菌丝细胞对贴后撕拉，目的使干燥的细胞产生撕裂，可以在随后的观察中观察到细胞内部的结构特征；将撕裂后的样本置于喷金设备中进行喷金后采用扫描电子显微镜观察和拍照。

[0042] 图3为检测土地杆菌是否转入羊肚菌菌丝细胞的PCR扩增结果。采取文献报道的方法（孙婷婷，赵明，李亚莉，等. 普洱茶发酵样品细菌和真菌DNA同时提取方法研究. 中国农学通报，2011，27(15)：249‑253）提取已经转入土地杆菌或没有转入土地杆菌的羊肚菌的基因组DNA作为PCR扩增的模板，分别采用细菌16S rDNA通用引物对27F/1492R和羊肚菌交配型基因特异性引物对MAT1‑1‑1F/R进行PCR扩增，目标扩增产物分别为1500 bp左右的细菌16S rDNA片段和412 bp的羊肚菌交配型MAT 1‑1‑1基因片段，扩增产物点样进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，第1、9和10泳道为未加模板的对照扩增，没有任何DNA条带；第2、4、6和8泳道为未转入土地杆菌的羊肚菌扩增结果，仅扩增出412 bp的羊肚菌交配型MAT 1‑1‑1基因片段；
第3、5和7泳道为转入土地杆菌的羊肚菌扩增结果，仅扩增出1500 bp左右的16 S rDNA条带。

[0043] 采取PCR扩增法结合扫描电镜法，确证双方已经建立内共生关系。成功建立土地杆菌与羊肚菌内共生关系的羊肚菌菌株，采用扫描电子显微术观察，可在羊肚菌菌丝细胞内观察到土地杆菌细胞（见图2右图）；采用土地杆菌16 S rDNA序列特异性引物对（27F/1492R）进行PCR扩增，扩增产物点样1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，能够出现1500 bp左右的土地杆菌16 S rDNA目标DNA片段（见图3的第3、5和7泳道结果）。如果PCR扩增法和扫描电子显微术观察都出现阳性结果，则表明土地杆菌成功与羊肚菌建立了内共生关系。

[0044] （4）内共生化菌株培养性状测定：以初始羊肚菌菌株为对照，测定内共生细菌的羊肚菌菌株在生长适宜pH、温度范围内的菌丝生长速度和菌丝生物量；测定不同浓度重金属（铬、铅、锌、铜等）、扁桃酸（土壤酚酸自毒物质）等对内共生酵母菌的羊肚菌菌株生长的影响；测定内共生酵母菌的羊肚菌菌株在无氮培养基（测定固氮能力）和低碳培养基（测定对营养贫乏的胁迫抗性）的菌丝生长速度和菌丝生物量。测定表明，内共生土地杆菌的羊肚菌菌株在30℃培养菌丝生物量显著高于对照羊肚菌，表明内共生羊肚菌菌株对高温的抗性显著增强；在1/4和1/8 CYM培养基上培养菌丝生物量显著高于对照，表明对贫营养环境的抗性显著增强；在无氮培养基有菌丝体生长，表明内共生关系的建立赋予了羊肚菌固氮的能力；内共生关系的建立对重金属CuCl2、Pb（NO3）2和酚酸类自毒物质扁桃酸的适应性均显著提升。

[0045] （5）内共生化菌株生产性状测定：将羊肚菌对照菌株和建立内共生关系的菌株，在2
三地同时试验性栽培（每个菌株均为3 m），观察和记录产菌霜时间和相对强度、原基产生时间和多少、幼菇产生时间和多少、第一茬菇单位产量等产量性状，发现与马拉色菌建立内共生关系的羊肚菌菌株在菌霜产生、原基生长、出菇时间和出菇数量几个方面均优于出发菌株，内共生羊肚菌产量比出发菌株提高6.2倍，显示良好的增产潜力。

[0046] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。