[0001] 本发明涉及烟草黑胫病病检测技术领域，尤其涉及一种便携式野外烟草黑胫病的快速诊断方法及引物、探针和试剂盒。

[0002] 烟草黑胫病是由寄生疫霉(又名烟草疫霉，属卵菌，拉丁名为Phytophthora parasitica或Phytophthora nicotianae)侵染引起的、从幼苗到成株期均可危害烟草、从根部到叶部均能侵染的、半活体寄生的土传根茎类病害。寄生疫霉的寄主范围非常广泛，可侵染超过250个属的植物，通过轮作等方式进行病害防治收效有限。寄生疫霉侵染烟草造成烟草黑胫病的过程中，有一段难以察觉的潜伏期，出现症状后发病迅速，出现明显症状时再用药已难以挽回植株，常常在烟草种植过程中造成较大的经济损失，是烟草种植中的主要病害之一，所以烟草黑胫病早期的诊断尤为重要。因此建立高效、快速、实用的病菌检测技术，对烟草黑胫病的监测和诊断具有重要的意义。

[0003] 重组酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是基于T4噬菌体核酸复制机制进行的，通过T4噬菌体的重组酶蛋白(uvsX)、DNA单链结合蛋白(single‑strand binding protein,SSB)和DNA聚合酶(Bsu)的作用，在体外完成核酸的恒温扩增反应。而引物设计是决定重组酶聚合酶扩增的关键影响因素，RPA引物设计不同于一般的PCR引物设计，引物过长容易产生引物二聚体和发夹结构，引物过短降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度，目前还没有相关软件辅助引物筛选，这给引物筛选带来一定的困难。可见，在引物设计阶段，引物的设计原则、筛选原则均需要经过大量实验才能够获得。

[0004] 基于此，烟草黑胫病的早期快速诊断，可为烟草黑胫病防控精准施药提供重要依据，是绿色防控技术推广应用的重要基础，所以目前亟需一种能够在野外或田间对烟草黑胫病进行快速检测的方法。

[0051] 以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：

[0052] 实施例1：基因序列、探针与引物

[0053] 特异性和灵敏度是病原菌检测技术的两个关键性指标，核酸检测的特异性和灵敏度的影响因素有很多，例如检测样品的核酸质量、引物的设计、反应体系的优化配比和检测靶标序列的特异性与拷贝数等。靶序列拷贝数越高，以其为基础的检测体系的灵敏度就会越高。

[0054] 为了寻找适合于烟草黑胫病菌的新型多拷贝序列，利用Phytophthora parasitica参考基因组(GenBank登录号为GCA_000247585.2)进行基因组序列比对。在默认参数下使用BLASTN(v2.10.1)进行自我比对策略来识别潜在的多拷贝序列。通过两轮BLAST搜索筛选多拷贝序列。通过基因组比较，保留了长度超过150bp且具有两个以上高置信度(E值<；0.01)的序列。然后利用bedtools(v 2.30.0)软件对重叠的多拷贝序列进行组合，并基于这些折叠区域，利用samtools(1.9)软件收集潜在的多拷贝序列。最后，将多拷贝序列作为查询序列在NCBI数据库中与已知所有物种的基因组进行BLAST比对，获得高度特异的多拷贝序列。

[0055] 按照前面描述的多拷贝特异性序列筛选流程，获得的多拷贝特异序列。该序列长度为193bp，在寄生疫霉(Phytophthora parasitica)基因组中的拷贝数为13，且序列比对显示只特异存在于Phytophthora parasitica基因组中。得到的多拷贝特异序列如下：

[0056] CAGTAGATCGAATCCTTGGAGGAGATCGTGTATCCAAATGATTGCATCATGCCGATCCACTCCGA GGATTACGTAATCTTCACAGATGATGACGTAATCACTGACGCGCCGTCGTCGACCACGAGTCTCAGGGC TGGATCGGGTCACTTCCCATCGATCAGCTTTCTTGTTCACAAAGGCCAACTGGCGCTTC。

[0057] 在Primer5等软件协助下设计候选的引物和探针，得到的序列如序列表SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.7所示。下游修饰引物的5’端具有生物素标记，将探针的5’端采用FAM荧光标记，探针的中间序列含有四氢呋喃残基，以及3’端具有spacerC3阻隔基团，具体的如表1所示：

[0058] 表1

[0059]

[0060] 实施例2：诊断方法及试剂盒

[0061] 依据实施例1公开的上游引物、下游修饰引物、探针构建在野外使用的烟草黑胫病快速诊断方法及试剂盒。

[0062] 检测方法如下：

[0063] 将待测发病植物组织的DNA提取液加入反应体系后进行RPA扩增反应，然后采用采用免疫胶体金侧流层析试纸条读取结果。

[0064] 具体的，如图1所示试剂盒组成如下：

[0065] ①裂解液：3％PEG 2000+25mM NaOH+2mM EDTA，总体积为300μL；

[0066] ②反应液a：上游引物(10μM、2μL)、下游修饰引物(10μM、2μL)、探针(10μM、0.6μL)、商用RPA反应Buffer A(君诺德，货号A4631，40.9μL)，总体积为45.5μL；

[0067] ③反应液b：商用RPA反应Buffer B(君诺德，货号A4631，2.5μL)；

[0068] ④干粉小管：重组酶蛋白(uvsX)、DNA聚合酶Bsu、核酸外切酶nfo和SSB组成的RPA反应扩增酶和核酸外切酶干粉管(成品购于君诺德，货号A4631)，制备成干粉后更稳定、方便运输和保存；

[0069] ⑤稀释液：400μL的灭菌超纯水；

[0070] ⑥试纸条：针对6‑FAM和Biotin的商用“双抗夹心”免疫胶体金侧流层析试纸条(成品购于Milenia Biotec公司，货号MGHD1)；

[0071] ⑦一次性塑料研磨棒；

[0072] ⑧塑料微量吸管。

[0073] 具体的试剂盒的使用方法如下：

[0074] (1)取半个指甲盖大小的待测的发病植物组织约0.05g后加入裂解液进行研磨，研磨裂解后等2min充分裂解(裂解时间不能超过5min)，得到DNA提取液；

[0075] (2)将反应液a加入干粉管中，用吸管提取DNA提取液(液体吸到吸管细黑线处)到反应管中，在吸取反应液b到反应管后进行RPA反应，用手握住或放衣服口袋中保持温度到30‑45℃以上15min；

[0076] ()用吸管吸取所有反应液到装有稀释液的1.5mL管中进行稀释，检测试纸条(带有箭头端浸入液体中)插入此管中，3‑5min后读取结果。

[0077] 当所述侧流层析试纸条上的C线和T线都出现条带，则检测样品为阳性；当所述侧流层析试纸条上的C线出现条带，T线未有条带，则检测样品为阴性。

[0078] 本发明公开的试剂盒具有便携、操作简单、不受检测场地限制和无需额外装备的优点，非常适合用于田间或野外使用。

[0079] 实施例3：不同引物组合检测烟草黑胫病

[0080] 参考实施例2的检测方法，以Phytophthoraparasitica基因组DNA为反应模板(1ng)，反应时间为15min，反应温度为37℃，通过比较不同引物组合下(分别以上游引物和下游修饰引物进行组合，探针不变)的RPA联合免疫胶体金测流层析检测。

[0081] 进行实验的引物组合如下：

[0082] 无引物、PPM25‑F1+PPM25‑R1、PPM25‑F1+PPM25‑R2、PPM25‑F1+PPM25‑R3、PPM25‑F2+PPM25‑R1、PPM25‑F2+PPM25‑R2、PPM25‑F2+PPM25‑R3、PPM25‑F3+PPM25‑R1、PPM25‑F3+PPM25‑R2和PPM25‑F3+PPM25‑R3，得到的结果如图2所示。

[0083] 分析结果可知：任意不同的上游引物和下游修饰引物都适合于针对Phytophthora parasitica的检测，T线条带明显，由此可以说明本发明公开的引物可以将上游引物和下游修饰引物灵活配对。

[0084] 实施例5：不同反应温度检测烟草黑胫病

[0085] 同样参考实施例2的方法，以Phytophthoraparasitica基因组DNA为反应模板(1ng)，反应时间为15min，引物组合选用PPM25‑F1+PPM25‑R1，验证30‑45℃的温度均可进行反应。RPA反应温度分别设置为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，得到的结果如图3所示。

[0086] 分析结果可知：反应温度在30‑45℃范围内的RPA反应均能较好地进行，说明本发明公开的检测方法适用于不同的室外环境，考虑到烟草黑胫病发病时节的气候温度在23‑35℃范围内，完全可以用手捂反应管的方法提供适宜的RPA反应温度。

[0087] 实施例6：特异性测试

[0088] 参加实施例2的方法，选择以PPM25‑F1+PPM25‑R1为引物组合，反应温度为37℃，DNA模板为1ng的条件进行特异性实验。其中前三个为分离于不同地区的烟草黑胫病病原菌(Phytophthora parasitica)，而后依次为烟草棒孢霉叶斑病病原菌(Corynespora cassioha)、烟草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)、烟草赤星病病原菌(Alternariaalternate)、烟草炭疽病病原菌(Colletotrichum micotianae)、烟草根黑腐病病原菌(Thielaviopsis basicola)、烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)特异性实验。其中烟草黑胫病病菌检测时选用分离于三个不同地区的病菌进行检测，得到的结果如图4所示。

[0089] 分析结果可知：所选的检测序列、引物和探针都具有高度特异性，除了Phytophthora parasitica基因组外，不会匹配到任何其他物种基因组中的序列，说明本发明的检测方法只特异检测烟草黑胫病病菌，在检测其他常见烟草病害时不会出现假阳性。
说明引物、探针具有高度特异性，仅针用于检测烟草黑胫病。

[0090] 实施例7：在Phytophthora parasitica近缘种中的交叉反应测试

[0091] 为了进一步明确诊断试剂盒针对寄生疫霉(Phytophthora parasitica)检测的特异性，我们另外选择了5个不同的寄生疫霉近缘种进行交叉反应测试。如图5所示，从左到右，前三个为分离至不同地区的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)，而后依次为：致病疫霉(Phytophthorainfestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)和恶疫霉(Phytophthora cactorum)等5个不同的疫霉。

[0092] 分析结果可知：本发明的诊断试剂盒只在Phytophthoraparasitica中检测到阳性条带，在其它近缘种中均无交叉反应，这进一步表明诊断试剂盒具有高度特异性。

[0093] 实施例8：灵敏度测试

[0094] 参考实施例2的方法，以不同浓度的Phytophthora parasitica基因组DNA为反应模板，设置反应时间为15min、反应温度为37℃，进行RPA扩增，模板量分别为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg和NTC(无基因组模板)，得到的结果如图6所示。

[0095] 分析结果可知：本发明公开针对Phytophthora parasitica的检测极限为100fg，在1pg及其以上基因组模板的情况下，检出条带非常明显。

[0096] 实施例9：人工接种病样的无装备检测实验

[0097] 为了验证试剂盒在野外实际使用效果，参考实施例2的方法利用试剂盒在野外无任何额外装备的情况下对6个人工接种Phytophthoraparasitica后的烟草根茎部组织进行病原检测，得到的结果如图7所示。

[0098] 分析结果可知：从左到右依次为：阴性对照、病样1～6。结果显示，其中所有病样检出的条带很清晰检出的正确率为100％。

[0099] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。