[0001] 本发明属于HIV病毒耐药基因检测领域与多重PCR领域，涉及一种用于HIV‑1耐药基因突变检测的多重引物组合及其应用。

[0002] HIV病毒感染并导致人体内CD4细胞计数低于200μL时，被称为艾滋病发病期，具有较高的死亡率。近年来，由于抗逆转录疗法(ART)的应用，顺利接受抗逆转录病毒疗法的艾滋病患者，其预期寿命已能够接近未感染人群，但这种疗法会受到HIV病毒耐药基因突变的影响，因此HIV病毒耐药基因突变位点的检测愈发重要。

[0003] HIV病毒耐药基因突变位点主要分布于其基因组中POL基因的逆转录酶、蛋白酶与整合酶编码区。目前已有较多PCR检测技术通过对各酶区进行单独扩增并Sanger测序进行耐药检测，这种方式虽然能够对耐药区段进行检测，但单对扩增操作繁琐且扩增片段较长易导致扩增灵敏度不够高，漏掉低病毒载量样本。

[0004] 此外，目前传统的Sanger测序方式进行耐药基因检测，其测序准确率虽然高，但受限于其读峰的测序原理，这种技术对低频突变(20％以下)的检测灵敏度较低，很大程度影响混合毒株感染样本检测能力。

[0005] 因此，亟需提供一种能够检测HIV‑1耐药基因低频突变的引物组合和方法。

[0068] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

[0069] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0070] 实施例1

[0071] 本实施例提供一种检测HIV‑1耐药基因突变的方法。

[0072] 使用复百澳(苏州)生物医药科技有限公司的HIV‑1假病毒(FNRV2708)作为模版进行扩增测试，扩增引物及定量PCR序列如表1所示，主要试剂如表2所示，多重巢式PCR反应条件如表3所示，第一轮PCR反应体系如表4所示，第二轮PCR反应体系如表5所示。

[0073] 具体步骤如下：将HIV‑1假病毒由108稀释至105次方后进行核酸提取，提取试剂采用金圻睿生物科技有限责任公司核酸提取试剂盒(KS619‑DNAmN24)，提取并得到HIV‑1假病毒核酸；对病毒核酸以1×、2×、8×、32×、128×作为为梯度进行稀释，共5个梯度，并进行染料法定量PCR检测，所述荧光定量试剂采购于翌圣生物科技(上海)有限公司，市面在售商品化SYBR、GREEN荧光定量PCR试剂均可替代。

[0074] 使用翌圣生物科技(上海)有限公司的全长cDNA合成试剂盒(13488)对所有梯度假病毒核酸进行逆转录，使用爱博泰克生物科技(武汉)有限公司的多重扩增反应液(BK0051)，对逆转录所得cDNA进行第一轮扩增，所用引物序列为SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8，所用扩增体系如表5所示，扩增程序如表4所示。第一轮扩增完成后，以扩增产物为模版按表6所示配制反应体系，扩增程序如表4所示，进行第二轮扩增反应，并对所得产物进行Q‑seq100片段检测。

[0075] 文库构建阶段可采用多种文库构建商品试剂盒进行文库制备，本实施例使用诺唯赞(南京)生物科技股份有限公司的转座酶快速建库试剂盒(TD501)对最低梯度核酸的扩增子进行制备文库并进行测序。

[0076] 表2

[0077]

[0078]

[0079] 表3

[0080]试剂组分 用途
多重扩增反应液 多重巢式PCR反应
逆转录酶 病毒全基因组逆转录

[0081] 表4

[0082]

[0083] 表5

[0084]组分 体积(μL)
逆转录后cDNA 1
第一轮扩增引物mix 4(每条引物终浓度0.1μM)
扩增反应液 12.5
无核酸酶水 7.5

[0085] 表6

[0086] 组分 体积(μL)第一轮PCR产物 1
第二轮扩增引物 4(每条引物终浓度0.1μM)
扩增反应液 12.5
无核酸酶水 7.5

[0087] 结果：5个梯度的Q‑seq100结果如图2B所示，每个梯度均出现4个明显的峰，这些峰分别对应了4个目标区域的产物，大小分别为约250bp/350bp/420bp/730bp，与HIV‑1基因组上对应长度基本接近(HIV不同毒株间存在一定差异)，各个梯度均扩增出明显条带，各梯度对应的qPCR扩增曲线与CT值如图2A所示。

[0088] 最低梯度(128×)核酸扩增子建库后测序深度结果如图3所示，测序数据量在0.3M的情况下，靶区平均深度大于10000×，高于耐药分析所需最低深度(100×)。

[0089] 实施例2

[0090] 本实施例以表2中所提供的引物序列为对照，并更换其中几对引物组合进行扩增。

[0091] 样本使用实施例1中的HIV‑1假病毒核酸(128×)梯度(所逆转录的cDNA。扩增及反应体系与实施例1一致，对照组第一轮与第二轮扩增引物序列与实施例1一致，测试组1将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.6更换为下表7中的SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20；测试组2将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.8更换为下表7中的SEQ ID NO.20与SEQ ID NO.21；测试组3第一轮扩增只使用SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.8，第二轮扩增只使用SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.16，作为长片段扩增测试。测试组4将SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.16更换为下表7中的SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24。测试组5将SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.8更换为下表7中的SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26。

[0092] 结果：Qseq‑100片段检测图如图4所示，对照组片段峰图完整，4个靶区的条带峰清晰；测试组1的峰图显示仅扩增出靶区2，其余3个靶区无明显峰；测试组2的峰图显示靶区3扩增效率明显下降；在长片段扩增的测试3中，耐药靶区无明显扩增；测试组4中靶区3能够扩增出条带，但其扩增效率明显下降；测试组5中靶区3与靶区4无扩增。

[0093] 表7

[0094]

[0095] 实施例3

[0096] 本实施例与实施例1区别在于进行长片段扩增HIV‑1感染样本核酸。

[0097] 本实施例中使用了7例HIV‑1感染样本核酸，由广州金域医学检验中心有限公司提供。核酸逆转录、扩增的操作步骤与实施例1一致，测试中添加HIV‑1假病毒核酸作为质控品。

[0098] 结果：Qseq‑100扩增峰图如图5所示，假病毒质控品与7例HIV‑1感染样本均有四个与目标大小匹配的峰，峰图无明显引物二聚体或非特异扩增。

[0099] 实施例4

[0100] 本实施例与实施例1区别在于进行Sanger检测。

[0101] 对实施例3的7例样本扩增产物分别进行NGS与Sanger检测，NGS文库制备过程与实施例1所述一致，Sanger检测由广州艾基生物技术有限公司提供。测序完成后，分别对耐药检出结果进行比对。

[0102] 结果：对比NGS与Sanger耐药检出结果，如下表8所示，7例样本中，Sanger检测到的耐药位点突变，在NGS的耐药结果中都有显示，此外，对于低频突变如HIVS589中的48V等，Sanger出现了遗漏且在测序峰图中未发现套峰。

[0103] 在HIVS519号样本中，NGS耐药分析显示有一个突变163K，并且突变频率达到42％，但Sanger结果中未显示突变，通过比对测序峰图(图6)发现，该位点的碱基突变在测序峰图中显示为套峰，因此在耐药突变结果中发生了漏检，这也是Sanger测序无法避免的情况。

[0104] 表8

[0105]

[0106]

[0107] 综上所述，本发明通过多重巢氏PCR的方式，使用特异性引物组合，降低了靶区扩增长度，提高了扩增能力，相比于传统的长片段扩增灵敏度与扩增效率更高(CT值高于35样本仍能有效扩增)，且操作更简易。

[0108] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。