引物延伸期间引物-引物相互作用的消除 发明领域 [0001] 本发明一般性地涉及核酸靶的体外分析，并且更具体地，涉及通过引物延伸富集核酸靶的改进方法。 [0002] 发明背景 引物二聚体和其它引物-引物相互作用是体外核酸合成反应的不希望的假象。引物设计工具通常用于避免能够交叉杂交或自杂交的引物序列。但是，研究显示了引物二聚体形成并变得延伸或复制需要很少互补性或不需要互补性。Brownie, J., et al. (1997) The elimination of primer dimers during PCR, Nucl. Acids Res., 25:3235. 建议的解释是高浓度的引物和低浓度的靶序列为引物-引物退火和延伸建立热力学有利的条件。 [0003] 引物二聚体可以导致不希望的副产物，其消耗试剂并与真实靶的扩增竞争。因此需要一种消除或减少引物-引物相互作用的方法。这种方法将特别有益于要检测稀有核酸靶的情况下的应用。这种方法将特别有益于临床诊断和新兴的流体活组织检查领域，或人血浆中多种稀有核酸靶的检测。 [0004] 发明概述 在一些实施方案中，本发明是以减少的引物-引物相互作用通过引物延伸合成核酸链的方法，所述方法包括：使靶核酸链与核酸聚合酶和包含至少一个修饰的核苷酸的引物接触，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。引物可以是单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。聚合酶可以是古细菌B家族聚合酶或复制聚合酶。修饰的核苷酸可以是尿嘧啶、无碱基核苷酸或嘧啶二聚体。 [0005] 在另一个实施方案中，本发明是以减少的引物-引物相互作用扩增样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：引物延伸步骤，其中使样品与核酸聚合酶和与靶核酸互补的第一引物接触，所述第一引物包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿，以产生引物延伸产物；和指数扩增步骤，其中使样品与第二引物接触，所述第二引物与引物延伸产物互补。引物延伸产物可在扩增步骤之前连接到双链衔接子。衔接子和第一引物可包含用于通用扩增引物的结合位点，和第二引物可为通用引物。引物可为单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。指数扩增步骤可利用耐受修饰的核苷酸的聚合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括在扩增步骤之前的纯化步骤，其中使第一引物和模板核酸与引物延伸产物分离。在一些实施方案中，修饰的核苷酸是尿嘧啶。所述方法可包括在扩增步骤之前的残余防止（carryover prevention）步骤，其中使样品与尿嘧啶DNA糖基化酶接触。 [0006] 在另一个实施方案中，本发明是用于以减少的引物二聚体形成通过引物延伸合成核酸链的试剂盒，其包含核酸聚合酶和第一引物，所述第一引物与靶核酸的第一链互补并且包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。试剂盒可进一步包含与靶核酸的第二链互补的第二引物或衔接子。引物可为单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。 [0007] 在又一个实施方案中，本发明是用于以减少的引物二聚体形成通过引物延伸合成核酸链的反应混合物，其包含核酸聚合酶和第一引物，所述第一引物与靶核酸的第一链互补并包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。 [0008] 附图简述 图1是显示不可延伸的引物二聚体假象（artifact）的本发明方法的图解。 [0009] 图2是显示由杂交的和延伸的分子倒置探针（molecular inversion probe，MIP）形成的假象的形成的图解。 [0010] 图3是显示由分子倒置探针（MIP）形成的不可延伸的假象的方法的图解。 [0011] 图4是显示任选的扩增步骤的本发明方法的图解。 [0012] 图5是显示使用分子倒置探针（MIP）的任选的扩增步骤的本发明方法的图解。 [0013] 发明详述 定义 术语“聚合酶”是指核酸聚合酶，无论是天然的（从其天然物种纯化）还是重组的（在转化的宿主中产生并从其中纯化）。在本发明的上下文中，聚合酶可具有其原始氨基酸序列或修饰的氨基酸序列，只要聚合酶根据本发明的方法保持其在修饰的碱基处使复制停顿的能力即可。 [0014] 术语“停顿（stall）”和“使复制停顿”是指减慢通过聚合酶的核苷酸掺入的速率或通过聚合酶的核苷酸掺入的完全停止。停顿的聚合酶可保持与底物结合或从底物解离。 [0015] 术语“修饰的核苷酸”是指含有除腺苷、鸟苷、胸苷或胞嘧啶之外的碱基的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。修饰的核苷酸可以是无碱基的（没有碱基）。修饰的碱基可以含有在自然界中发现的修饰：脱氨基、甲基化、氧化或UV诱导的连接。修饰的碱基可以含有在自然界中未发现的修饰。 [0016] 术语“探针”意味着能够选择性结合特定意图的靶生物分子的任何分子，所述靶生物分子例如，要通过探针结合、捕获或杂交的目标核酸序列。 [0017] 术语“衔接子”意味着可添加到另一序列以便将额外的特性导入该序列的核苷酸序列。衔接子可以是单链或双链的，或者可具有单链部分和双链部分二者。 [0018] 术语“通用引物”和“通用引发位点”是指不天然存在于靶序列中的引物和引发位点。通常，通用引发位点存在于衔接子或靶特异性引物中。通用引物可以结合通用引发位点并指导从通用引发位点的引物延伸。 [0019] 术语“引物二聚体”是指存在于同一反应容器中的两个寡核苷酸引物的退火产物。 引物二聚体可由两个相同的引物或具有不同序列的两个引物形成。引物二聚体可牵涉两个引物之间的一个或多个碱基配对区域。碱基配对可为Watson-Crick碱基配对以及稳定双链核酸的额外氢键（例如，Hoogsteen配对或碱基堆积）。引物二聚体可包含退火的引物、或退火的和延伸的引物。 [0020] 术语“复制聚合酶”是指共享共同特性和结构的染色体复制酶。共同特性包括利用单链DNA模板（非从头合成）向前延伸核酸引物的能力。共同结构包括掌、指和拇指结构域，参见Johansson et al., (2013) Replicative DNA Polymerases, Cold Spring Harb Perspect Biol. 5(6):a012799。复制聚合酶包括人和酵母聚合酶ε和聚合酶δ、古细菌Pol B和真细菌Pol III。 [0021] 本发明提供了以减少的引物-引物相互作用通过引物延伸合成核酸链的方法，所述方法包括：使靶核酸链与核酸聚合酶和引物接触，所述引物包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。引物可为单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。聚合酶可为古细菌B家族聚合酶或复制聚合酶。修饰的核苷酸例如可为尿嘧啶、无碱基修饰的核苷酸或嘧啶二聚体。 [0022] 本发明还提供了以减少的引物-引物相互作用扩增样品中的靶核酸的方法，所述方法包括a）引物延伸步骤，其中使样品与核酸聚合酶和与靶核酸互补的第一引物接触，所述第一引物包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿，以产生引物延伸产物；b）指数扩增步骤，其中使样品与第二引物接触，所述第二引物与引物延伸产物互补。在步骤b）之前，引物延伸产物可连接到双链衔接子。衔接子和第一引物可包含用于通用扩增引物的结合位点，并且第二引物是通用引物。引物可为单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。指数扩增步骤可利用耐受修饰的核苷酸的聚合酶。在步骤b）之前，可进行纯化。修饰的核苷酸可为尿嘧啶。在这一步骤中，方法可进一步包括在步骤b）之前的残余防止步骤，其中使样品与尿嘧啶DNA糖基化酶接触。 [0023] 本发明还提供了用于以减少的引物二聚体形成通过引物延伸合成核酸链的试剂盒，其包含核酸聚合酶和第一引物，所述第一引物与靶核酸的第一链互补并且包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。所述试剂盒可进一步包含与靶核酸的第二链互补的第二引物、和/或衔接子。引物可为单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。 [0024] 本发明另外提供了用于以减少的引物二聚体形成通过引物延伸合成核酸链的反应混合物，其包含核酸聚合酶和第一引物，所述第一引物与靶核酸的第一链互补并且包含至少一个修饰的核苷酸，所述核苷酸使通过聚合酶的核苷酸掺入停顿。 [0025] 本发明包括减少和消除在存在寡核苷酸引物的情况下、在体外核酸合成反应期间发生的引物-引物相互作用的方法。这种引物-引物相互作用通常是由于寡核苷酸引物之间的部分互补性和弱碱基配对。存在经验引物设计方法和软件工具以最小化或避免这种碱基配对。但是，这些方法对多重反应具有有限的适用性。在存在数十甚至数百个不同的寡核苷酸引物的情况下，一些交叉互补性即使并非不可能也是难以避免的。在高度多重引物延伸或指数扩增反应期间，引物-引物相互作用可以导致通常称为引物二聚体的不希望的副产物。这些副产物的主要贡献者是使用单独的引物作为模板的引物的聚合酶延伸。虽然难以防止交叉互补性和引物-引物退火，但减少或消除退火的引物对的延伸会减少或消除不希望的副产物的形成。 [0026] 在一个实施方案中，本发明是以减少或消除的引物二聚体形成扩增核酸靶的方法。所述方法包括使含有一种或多种靶核酸的样品与核酸聚合酶和含有修饰的碱基的一种或多种延伸引物接触，所述修饰的碱基在引物延伸期间引起核酸聚合酶的停顿。在修饰的核苷酸存在于其路径中的情况下，核酸聚合酶将在引物延伸期间在引物二聚体内停顿。不预期靶核酸含有修饰的核苷酸，并且聚合酶在与靶核酸退火的引物延伸期间不会停顿。（图 1）。 [0027] 当某些聚合酶遇到在模板链中可反映DNA损伤位点的异常核苷酸时，所述聚合酶使复制停顿。例如，DNA中的尿嘧啶引起几种聚合酶停顿，包括几种古细菌B家族和D家族聚合酶，例如Pfu聚合酶。参见Wardle, et al., (2007) Uracil recognition by replicative DNA polymerases is limited to the archaea, not occurring with bacteria and eukarya, Nucl. Acids Res., 36:705。无碱基位点引起原核和真核复制酶停顿，例如大肠杆菌的Pol III和酵母的聚合酶δ。参见Goodman, M. (2000) Coping with replication ‘train wrecks’ in Escherichia coli using Pol V, Pol II and RecA proteins. Trends in Biochem. Sci., 25:189; 和Boiteux, et al., (2004) Abasic sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae, DNA Repair 3:1。还已知由紫外光照射引起的环丁烷嘧啶二聚体和（6-4）光产物（TT二聚体）使古细菌和真核生物（包括哺乳动物）复制聚合酶停顿。Ghosal et al., (2013) DNA damage tolerance: a double-edged sword guarding the genome, Transl. Cancer Res. 2:107; Jozwiakowski, et al., (2015) Archaeal replicative primases can perform translesion DNA synthesis PNAS 112 (7) E633-E638。可通过亚磷酰胺（phorphoramidite）方法将嘧啶二聚体连同修饰的碱基掺入寡核苷酸引物。Yamamoto, et al. (2006) Chemical synthesis of oligodeoxy-ribonucleotides containing the Dewar valence isomer of the (6–4) photoproduct and their use in (6–4) photolyase studies, Nucl. Acids Res. 34:4406。除了本文所述的具体实例之外，本发明的描述使得能够使用任何其它修饰的核苷酸（已知的或有待合成的），其可以掺入引物中并且能够使DNA聚合酶停顿。 [0028] 在一些实施方案中，方法包括使样品与含有一个或多个尿嘧啶、或一个或多个无碱基位点、或一个或多个嘧啶二聚体的延伸引物和古细菌B家族DNA聚合酶（例如Pfu聚合酶）接触。在其它实施方案中，方法包括使样品与含有一个或多个嘧啶二聚体或无碱基位点的延伸引物、和真核或古细菌复制DNA聚合酶或其衍生物接触。 [0029] 在一些实施方案中，掺入修饰的核苷酸的引物是短寡核苷酸，所述短寡核苷酸主要由与靶核酸具有部分或精确互补性的单个区域组成（图1）。除了与靶具有互补性的区域之外，引物可任选地包含用于下游步骤的额外序列，例如限制性位点或与通用扩增引物结合位点互补的序列、通用测序引物结合位点或条形码。 [0030] 在其它实施方案中，掺入修饰的核苷酸的引物是设计以形成复杂二级结构的寡核苷酸，所述复杂二级结构由单链和自退火的双链区域的组合组成。在一些实施方案中，寡核苷酸是分子倒置探针（MIP）（图2）。MIP结构描述于Turner et al., (2009) Methods for Genomic Partitioning. Annu. Rev Genomics Hum. Genet., 10:263。MIP是单链寡核苷酸，其由与靶序列互补的两个臂组成，所述两个臂由与靶序列非互补的接头序列分开。靶序列内的探针互补序列彼此分开，使得当探针与靶序列杂交时探针的5'和3'末端彼此分开。 可以通过延伸杂交的探针的3'末端来填充空隙。在链延伸后，两个末端可以通过连接来接合。任选的外切核酸酶消化除去未环化的探针。 [0031] MIP寡核苷酸可偶尔共享互补性区域，其允许探针的3'末端退火和延伸至完整的环。环经历连接并变得抵抗外切核酸酶处理。（图2）。如果将阻止聚合酶的修饰的核苷酸掺入引物，则防止引物延伸和随后的连接。（图3）。 [0032] 在一些实施方案中，方法还包括在先前步骤中获得的引物延伸的产物的扩增。引物延伸的产物在引物体内含有修饰的核苷酸。在具有单个互补性区域的引物的情况下（图 1），方法可包括用基因特异性上游和下游引物扩增。 [0033] 在其它实施方案中，使用通用扩增引物。可将用于通用引物的结合位点引入初始引物延伸引物、并引入与引物延伸产物的3'末端连接的衔接子。将衔接子连接到单链核酸是本领域已知的，参见例如美国申请公开号20140193860。基本上，该方法使用一群衔接子，其中单链3'末端突出端具有随机序列，例如随机六聚体序列，而不是具有通用连接位点。在一些实施方案中，初始引物延伸引物包含用于通用引物之一的结合位点，并且衔接子包含用于第二通用引物的结合位点（图4）。在其它实施方案中，初始引物延伸引物包含用于两个通用引物的结合位点。（图5）。 [0034] 扩增可用耐受模板中修饰的核苷酸的存在的核酸聚合酶进行，即，能够掺入与修饰的核苷酸相对的碱基并完成链合成。例如，能够绕过尿嘧啶的聚合酶包括来自嗜热细菌的热稳定聚合酶，例如来自海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、水生栖热菌（Thermus aquaticus）、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）、黄栖热菌（Thermus flavus）、丝状栖热菌（Thermus filiformis）、栖热菌属物种Sps17（Thermus species Sps17）、栖热菌属物种Z05（Thermus species Z05）、Thermus caldophilus、Thermotoga neopolitana和Thermosipho africanus的DNA聚合酶。 [0035] 在一些实施方案中，方法还包括将引物延伸产物与靶核酸模板和未使用的引物分离的步骤。如果在扩增步骤中使用耐受尿嘧啶的DNA聚合酶，则必须从反应混合物中除去未延伸的具有尿嘧啶的引物二聚体。 [0036] 在掺入修饰的核苷酸的引物是短寡核苷酸、所述短寡核苷酸主要由与靶核酸具有部分或精确互补性的单个区域组成的情况下的实施方案中（图1），引物延伸产物可经历连接和第二链延伸。随后，可以通过大小分离包括引物的单链核酸。 [0037] 在掺入修饰的核苷酸的引物是设计以形成复杂二级结构的寡核苷酸、所述复杂二级结构由单链和自退火的双链区域的组合组成的情况下的实施方案中（例如，MIP，图2），引物延伸产物转化成环状DNA，没有游离的3'-OH。在此类实施方案中，可通过外切核酸酶消化除去未使用的探针和模板DNA。单链外切核酸酶（例如，Exo I）可以用于除去未使用的引物和变性的靶DNA或样品DNA，并且双链外切核酸酶（例如，T7外切核酸酶）可用于除去双链靶DNA。外切核酸酶的混合物可以用于减少样品中所有核酸的量，除了连接的（环化的）探针。 [0038] 在一些实施方案中，修饰的核苷酸是尿嘧啶。尿嘧啶在体外合成的DNA中的掺入可以在常规进行DNA的指数扩增的设施处用于残余防止。任选地，来自先前DNA扩增的含尿嘧啶的DNA污染物可以被尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）降解，UDG也称为尿嘧啶-N-DNA糖基化酶（UNG）。 参见Longo, et al., (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene 93:125。在这一实施方案中，UDG处理在引物延伸步骤之后和在指数扩增步骤之前进行。引物延伸步骤在反应混合物中没有dUTP的情况下被延续（carried over），使得（除了延伸引物）引物延伸产物不掺入任何尿嘧啶。在扩增步骤中，一些实施方案将利用耐受尿嘧啶的DNA聚合酶和dUTP以使得能够进行未来的残余防止。在一些实施方案中，不进行任选的UDG处理。如果根据本发明使用被尿嘧啶阻止的聚合酶，则含尿嘧啶的模板不允许引物延伸。用核酸酶消化具有非延伸的引物的单链残余核酸。 [0039] 本发明的方法可以用作更复杂的实验设计的一部分。在一些实施方案中，引物延伸或随后扩增的产物用于核酸测序方案，包括高通量单分子测序。具体地，该方法可以是文库生成步骤的一部分，其中多重引物延伸（和任选的扩增）产生待测序的靶核酸的文库。可修饰文库中的靶核酸以掺入条形码用于分子鉴定（独特的分子ID（MID））和样品鉴定（多重样品ID（SID））。这些条形码序列可掺入一个或两个引物或掺入衔接子。 [0040] 可以通过本领域已知的任何方法进行测序。特别有利的是高通量单分子测序。这些技术的实例包括Illumina HiSeq平台(Illumina, San Diego, Cal.)、Ion Torrent 平台(Life Technologies, Grand Island, NY)、利用SMRT®试剂的Pacific BioSciences平台(Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.)、或由Genia Technologies (Mountain View, Cal.)或Oxford Nanopore Technologies (Cambridge, UK)开发的基于纳米孔的测序技术、或确实牵涉或不牵涉通过合成测序的任何其它现有或未来的单分子测序技术。在一些实施方案中，测序利用通用引物位点，所述位点存在于与靶核酸的一个或两个末端连接的衔接子中、或者在测序之前用于拷贝扩增靶核酸的引物中。在另外其它的实施方案中，基因特异性引物用于测序。 [0041] 用于本发明方法的样品包括来自含有核酸的个体（例如人患者）或环境样品或实验室制品的任何样品。可以从样品中提取多核苷酸，或者可以使样品直接接受本发明的方法。起始样品也可以是提取的或分离的核酸、DNA或RNA。样品可以构成从生物体获得的任何组织或流体。例如，样品可为肿瘤活组织检查或血液或血浆样品。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定的、石蜡包埋的（FFPE）样品。样品可包含来自一个或多个来源、例如一个或多个患者的核酸。在一些实施方案中，组织可以被病原体感染，并且因此含有宿主的和病原体的核酸。 [0042] DNA提取的方法在本领域中是众所周知的。参见J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 1989, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, N.Y.)。各种试剂盒是市售的，用于从生物样品中提取核酸（DNA或RNA）（例如，BD Biosciences Clontech (Palo Alto, Cal.), Epicentre Technologies (Madison, Wisc.); Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, Minn.); 和Qiagen, Inc. (Valencia, Cal.), Ambion, Inc. (Austin, Tex.); BioRad Laboratories (Hercules, Cal.)；和更多。 [0043] 在一些实施方案中，用于本发明方法中的起始样品是文库，例如基因组文库或包含多个多核苷酸的表达文库。在其它实施方案中，使用本发明的引物延伸方法建立文库。在起始材料是生物样品的情况下，该方法建立扩增文库、或代表多样性的扩增子或序列的集合。可以存储文库和多次使用文库用于文库中的核酸的进一步扩增或测序。 [0044] 在一些实施方案中，本发明是用于靶核酸的引物延伸的试剂盒，其避免或具有减少数量的引物二聚体。该试剂盒包含含有修饰的碱基的一种或多种靶特异性引物、和在到达模板链中的修饰的碱基时使链合成停顿的核酸聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是古细菌聚合酶。在一些实施方案中，修饰的碱基是尿嘧啶，并且聚合酶是古细菌B家族聚合酶。 在其它实施方案中，修饰的核苷酸是无碱基的，并且聚合酶是复制聚合酶。在另外其它的实施方案中，修饰的核苷酸是嘧啶二聚体，并且聚合酶是复制聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含衔接子。衔接子可包含进一步体外分析步骤所需的序列，例如一个或多个分子条形码、连接位点和通用引物结合位点。试剂盒还可包含试剂和酶，用于核酸合成、扩增、连接和纯化，包括过量引物和探针的外切核酸酶消化。 [0045] 在一些实施方案中，本发明是用于靶核酸的引物延伸的反应混合物，其避免或具有减少数量的引物二聚体。反应混合物包含含有修饰的碱基的一种或多种靶特异性引物、和在到达模板链中的修饰的碱基时使链合成停顿的核酸聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是古细菌聚合酶。在一些实施方案中，修饰的碱基是尿嘧啶，并且聚合酶是古细菌B家族聚合酶。在其它实施方案中，修饰的核苷酸是无碱基的，并且聚合酶是复制聚合酶。在另外其它的实施方案中，修饰的核苷酸是嘧啶二聚体，并且聚合酶是复制聚合酶。 实施例 [0046] 实施例1（预言的）具有减少的分子倒置探针（MIP）的交叉反应性的靶捕获。 [0047] 分子倒置探针（MIP）已用于在下一代测序应用中富集靶序列。使用的探针池（probe pools）可以产生数百和甚至数千个靶扩增子。但是，设计探针以在数百或数千个其它探针的情况下表现良好并非微不足道。这是由于探针之间可以发生的相互作用，其在最终文库中建立不希望的产物。当在这些探针中使用独特的标识符序列时，这种情况可以恶化，因为它们是工程改造到探针中的随机序列，以使得能够通过测序进行分子鉴定。将尿嘧啶碱基掺入分子倒置探针应当通过在两个探针相互作用时阻止聚合酶延伸来减少不希望的产物的产生。 [0048] 如图2中所示，如果一个MIP与另一个MIP杂交，则启动引物延伸，连接关闭环并且保护所得产物免于核酸酶消化。根据本发明，根据推荐用于MIP的标准反应条件，将含有尿嘧啶的MIP与靶核酸和聚合酶温育。使反应混合物接受引物延伸、连接和任选地随后的扩增。存在用外切核酸酶消化线性（非环状）核酸的任选步骤。使用单链和双链外切核酸酶（ExoI和T7外切核酸酶）的混合物。如图3中所示，引物-引物相互作用可导致杂交，但在杂交产物中没有引物延伸且没有连接。在扩增步骤期间，不能扩增杂交产物。随后的扩增用耐受尿嘧啶的聚合酶进行。如果希望残余防止，则在引物延伸步骤后，用UDG处理反应混合物。如果希望随后的残余防止，则在dUTP存在下进行扩增。