[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及CVA16检测引物及检测方法。

[0002] 柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病的重要病原体。该病毒通过粪口传播，在儿童人群中传播较快，是重点检测的传染病原之一。

[0003] CVA16为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，由约7410个核苷酸组成，仅包含一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF),该ORF可进一步翻译产生11种蛋白产物，其中衣壳蛋白VP1是病毒主要的中和抗原决定簇位点，该区的基因序列常被用于病原的分子鉴定及分子流行病学研究。

[0004] 但遗憾的是，目前暂无针对CVA16的有效治疗药物和疫苗，CVA16的致病机制仍不清楚。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，研发一种省时、省力、特异性高的柯萨奇病毒A组16型检测方法非常必要。

[0005] 目前对于CVA16的检测主要依赖于传统的病毒培养和中和试验。该方法耗时5到7天，包括细胞培养、接种及后续的中和试验，耗时耗力。随着核酸诊断技术的快速发展，以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于CVA16的检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，复杂的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员，极大限制了这些技术的运用。且这些检测技术耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

[0006] 为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。较PCR技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、连置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，且也依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。

[0007] 近期，我国科学家发明了一种新的恒温扩增技术：多交叉置换扩增(Multiple cross displacement amplification，MCDA)。MCDA能够在恒温条件下实现靶序列扩增，可以仅使用一种恒温置换酶，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高的特点。为了使该技术更为广泛应用到生物、医药及卫生领域，后续研究已经将MCDA技术与纳米横向测流检测技术相结合，实现快速、简单、特异及敏感检测的纳米生物传感技术，即多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple Cross Displacement Amplification label‑based Polymer Nanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA‑LFB)。

[0008] 如果能将MCDA‑LFB技术用于CVA16的检测，针对柯萨奇病毒A组16型VP1基因设计一套MCDA扩增引物，则有望建立针对CVA16的快速、敏感和特异的MCDA‑LFB检测体系。

[0028] 为了验证、评价MCDA‑LFB技术及建立针对病原体CVA16的快速、敏感和特异的MCDA‑LFB检测体系。本发明提供了一套检测CVA16的引物，具体针对CVA16的特异性基因VP1。VP1是CVA16的特异性基因，能检测CVA16的不同基因亚型。利用引物设计软件PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物软件Primer premier5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图1。

[0029] 所述检测引物包括10条引物，分别识别靶序列的10个区域，具体包括两条置换引物F1和F2，两条交叉内引物CP1和CP2，6条扩增目的基因的引物C1和C2、D1和D2、R1和R2。以上引物在MCDA反应后用等温扩增仪可以监测浊度。为了构建可检测产物，通过增加在扩增引物C1的5’端标记生物素(Biotin)并命名为C1*，在扩增引物D1的5’端标记半抗原(FAM)并命名为D1*。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物，置换引物F1和F2在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2。六条扩增引物C1*和C2、D1*和D2、R1和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量，经过标记后的扩增产物可以实现生物传检测器(LFB)检测扩增结果，减少特殊设备的使用。

[0030] 所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示。所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:4所示。所述扩增引物C1的序列如SEQ ID NO:5所示，在扩增引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:6所示，所述扩增引物C2的序列如SEQ ID NO:7所示。所述扩增引物D1的序列如SEQ ID NO:8所示，扩增引物D1的5’端标记有生物素的引物D1*的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示。扩增引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，扩增引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示。

[0031] 需要说明的是，C1*的序列为：Biotin‑tgggcattgtgatgatgctgaca；D1*的序列为：Fam‑accagcacggctaaagaa。因“电子序列表校验及制作工具”无法识别“Biotin”和“Fam”，故序列表中C1*的序列与C1相同，D1*的序列与D1相同。

[0032] 本发明还提供了利用所述引物检测CVA16的方法。具体方法为：

[0033] 1、进行MCDA扩增反应。反应体系包括：所述交叉引物CP1(60pmol)和CP2(60pmol)、置换引物F1(10pmol)和F2(10pmol)、扩增引物R1(30pmol)和R2(30pmol)、扩增引物D1*(30pmol)和D2(30pmol)、扩增引物C1*(20pmol)和C2(20pmol)、10mM的Betaine、6mM的MgSO4、1mM的dNTP、12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液、10U的链置换DNA聚合酶、1μL的模板，补加去离子水至25μL。将体系在61～68℃下恒温反应35分钟，优选反应温度为61～64℃，更优选为64℃。反应结束，获得CVA16‑MCDA产物。

[0034] 2、MCDA扩增后，可通过可视颜色法或生物传检测器(LFB)检测扩增结果。

[0035] (1)可视颜色法：在步骤1反应后的混合物中加入可视染料(特异性核酸扩增指示剂，Visual Detection Reagent,VDR)。MCDA在合成DNA的同时会产生大量的阳离子，阳离子能够改变反应管中的pH,从而使VDR颜色发生改变。因此，可以通过反应管颜色变化判读结果。扩增结束后，阳性从无色变为亮绿色(表示检测模板为CVA16)，保持无色不变为阴性(表示检测模板不是CVA16)。

[0036] (2)LFB法：将CVA16‑MCDA产物直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将120uL的检测缓冲液(组成：pH＝8.8的Tris‑HCI 40mM，KCl 20mM，MgSO4 16mM，(NH4)2SO4 20mM，Tween‑20 0.2％，Betaine 1.6M，dNTPs 2.8mM；来自天津汇德鑫科技发展公司的脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒)加到样品垫区域，CVA16‑MCDA产物在虹吸作用下，从样品垫向吸水垫方向运动。
当CVA16‑MCDA产物达到金标垫后，所述产物的一端(即生物素标记端)与(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而实现对CVA16‑MCDA产物的可视化检测。此外，过剩的高分子金纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与CL(质控线)区域的B‑BSA(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)结合，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。由于针对CVA16检测的MCDA引物标记的半抗原为Fam(荧光素)，因此，当出现两条红色条带时为阳性(表示检测模板为CVA16)，出现一条红色条带(CL)时为阴性(表示检测模板不是CVA16)。两条条带指TL(Test Line，TL，检测线)和CL(质控线)。

[0037] 在实际使用时，本领域技术人员可以根据需要采取常规技术手段，将引物进一步制备为试剂盒、检测试纸、检测条、检测剂及其他检测用产品或检测用产品的组成部分。

[0038] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。

[0039] 本发明各实施例所涉及的试剂来源如下：

[0040] 抗荧光素抗体(anti‑FITC)、高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA‑NP)及生物素偶联的牛血清蛋白(B‑BSA)购于北京海泰正元生物科技有限公司。

[0041] 背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie‑Yi公司。

[0042] 恒温扩增试剂盒(Isothermal Amplification Kit)及可视染料(VDR)购于北京海泰正元生物科技有限公司(Beijing HaiTai‑Zhenyuan Co.Ltd.,Beijing,China)。

[0043] DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。

[0044] DL100 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。

[0045] 其余试剂均为市售分型纯产品。

[0046] 实施例一：提取并制备病毒模板

[0047] 1、基因组提取：柯萨奇病毒A组16型及其他病毒的基因组RNA的提取使用Qiagen公司的RNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组RNA的浓度和纯度，其他病原也用相应方法提取并于‑20℃保存备用。

[0048] 建立VP1克隆质粒，将CVA16的VP1亚克隆入pUC57载体，提取质粒并对其起始浓度定量，并将pUC57‑CVA16‑VP1稀释到所需浓度。以常见的肠道病毒其他型的RNA及条件致病菌DNA为模板评价CVA16‑MCDA技术的特异性。本发明所用各菌毒株信息如表1所示。需要说明的是，本发明课题组实际验证了数十株不同来源的CVA16，本发明方法均可对其进行有效验证；只是出于篇幅考虑，实施例中只体现了其中10株的验证结果(与实施例五对应)。

[0049] 表1各菌毒株信息

[0050]

[0051]

[0052] 实施例二：引物检测的可行性验证

[0053] 1、建立MCDA反应体系。反应体系包括：所述交叉引物CP1(60pmol)和CP2(60pmol)、置换引物F1(10pmol)和F2(10pmol)、扩增引物R1(30pmol)和R2(30pmol)、扩增引物D1*(30pmol)和D2(30pmol)、扩增引物C1*(20pmol)和C2(20pmol)、10mM的Betaine、6mM的MgSO4、1mM的dNTP、12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液、10U的链置换DNA聚合酶、1μL的模板，补加去离子水至25μL。恒温64℃反应35分钟。

[0054] 根据加入模板的不同，设置不同组别，每个组别重复3次。加入4×104copies/uL的1μL CVA16‑VP1质粒模板，作为处理组，加入10pg的EVA71 cDNA模板，作为阴性对照组1，加入10pg的CVA6 cDNA模板，作用阴性对照组2，以1μL的双蒸水代替模板，作为空白对照组。

[0055] 2、可视颜色法验证。在步骤1的反应混合物中加入VDR。

[0056] 因专利无法提供彩色图片，故未提供本组实验对应图片。结果显示，处理组从无色变为亮绿色，阴性对照组1、2及空白对照组均保持无色。即只有处理组出现了阳性扩增，说明针对VP1设计的检测CVA16的MCDA引物具有可行性，特异性强。

[0057] 3、LFB检测。将各组MCDA扩增产物分别、直接滴加到LFB的样品垫区域，然后加入120uL的检测缓冲液，观察出现的条带情况，结果如图2所示。图2从左到右分别为：处理组(图2中的1)、阴性对照组1(图2中的2)、阴性对照组2(图2中的3)、空白对照组(图2中的4)。
仅处理组出现2条条带，其余组别均只有1条条带，与可视颜色法验证结果相同。

[0058] 实施例三：扩增反应的温度选择

[0059] 在实施例二的反应体系条件下，模板选择1uL 4×104copies/uL CVA16‑VP1。其他条件完全相同，反应温度分别设置为61～68℃，各处理间温度差为1℃。使用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同浊度的动态曲线图，结果如图3所示。MCDA反应在63～66℃的扩增条件下，最先观察到阳性结果，因此被推进作为MCDA引物的最佳反应温度(图3C～3F),本发明的后续验证选择64℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图3表示针对VP1基因设计的检测CVA16的MCDA引物温度动态曲线图。

[0060] 实施例四：引物检测的敏感性测试

[0061] 使用实施例一连续稀释好的pUC57‑CVA16‑VP1质粒，按实施例二的处理组进行标准的MCDA扩增反应后，用LFB检测，结果如图4所示。图4从左到右对应的模板浓度依次为：46 5 4
×10copies/uL(图4中的1)、4×10copies/uL(图4中的2)、4×10copies/uL(图4中的3)、4
3 2
×10copies/uL(图4中的4)、4×10 copies/uL(图4中的5)、4×10copies/uL(图4中的6)、4‑1
×100copies/uL(图4中的7)、4×10 copies/uL(图4中的8)，最右侧为空白对照(图4中的
9)：使用1uL双蒸水代替模板。

[0062] 结果显示：MCDA‑LFB的检测范围为4×106～4×100copies/uL，LFB检测呈阳性(图‑14的1～7泳道)；当模板降低至4×10 copies/uL(图4的第8泳道)时，LFB结果为阴性。

[0063] 实施例五：引物检测的特异性测试

[0064] 以表1提供的各微生物为模板评价本发明提供引物的特异性。按实施例二的反应4
体系和方法进行，模板分别使用表1中的各微生物，用量均为1uL 4×10copies/uL。结果如图5所示。图5中1～10为10株不同来源的CVA16模板，11为EVA71模板，12为CVA2模板，13为CVA4模板，14为CVA6模板，15为CVA10模板，16为CVA24模板，17为CVB3模板，18为ECHO30模板，19为EVC96模板，20为Human rhinovirus模板，21为Norovirus模板，22为金黄色葡萄球菌模板，23为肺炎克雷伯杆菌模板，24为空白对照。结果表明，MCDA‑LFB能够正确的检测靶序列。

[0065] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。