[0001] 本发明涉及引物，更具体地，涉及用于检测多核苷酸序列中的突变的引物。本发明还涉及包含该引物的试剂盒和检测微卫星序列中的突变的方法。

[0002] 移码突变可通过破坏正常的蛋白质翻译而导致疾病。在其他病理学中，移码突变与癌症有关，特别是与微卫星不稳定性有关的癌症。微卫星不稳定性(MSI)是由DNA错配修复(MMR)受损引起的细胞的超突变状态。换句话说，受MSI影响的细胞没有适当的功能修复机制，因此在DNA复制过程中会产生自发突变，从而导致移码突变。这些错误尤其会在微卫星中积累，微卫星是DNA的重复序列(最常见的是核苷酸C和A的二核苷酸重复)。因此，MSI会导致这些称为微卫星的重复序列中发生插入和缺失突变。

[0003] MSI与许多癌症有关，包括结肠癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肝胆道癌、泌尿道癌、脑癌和皮肤癌(Cortes‑Ciriano等人，2017)。在ASTE1、TAF1B、KIAA2018和SLC22A9中发现了移码突变。特别是，TGFBR2的移码突变存在于大量由微卫星不稳定性(MSI)引起的结直肠癌(CRC)和胃癌(GC)中。TGFBR2的移码突变也已知与Lynch综合征相关。MSI由整个基因组中多段短串联DNA重复序列(微卫星)中的插入和缺失突变组成。据报道，CRC中超过95％的移码突变是单核苷酸缺失(Maby等人2015)。

[0004] 鉴于上述情况，移码突变为治疗与此类突变相关的疾病(包括许多癌症)提供了治疗靶点。然而，并非所有患有此类疾病的患者都会出现这种突变，特别是对于已知该疾病具有高度异质性的癌症患者。因此，重要的是能够检测疾病人群中具有移码突变的患者子集，以便找到对靶向移码突变的治疗有反应的患者。

[0005] 例如，由突变免疫原性肽组成的癌症疫苗FMPV‑1靶向移码突变体TGFBR2，如WO/2020239937中所述。并非所有MSI‑CRC(约75％)和MSI‑GC(约80％)患者都具有移码突变的TGFBR2。为了确保仅招募符合条件的患者参加FMPV‑1的临床研究，筛选患者以检测此类突变体TGFBR2以找到将从此类治疗中受益的患者将非常有用。换句话说，移码突变的检测可能有助于为可能存在或不存在这种突变的疾病提供个性化的医疗方法。此外，检测此类突变可以帮助招募合适的候选者进行临床试验，以测试靶向此类移码突变的疗法。

[0006] 这种筛查和个性化医疗方法对于ASTE1基因中存在单核苷酸缺失的患者也很有用。具体地，癌症疫苗FMPV‑2(也称为“fsp8”)是靶向移码突变体ASTE1的突变体免疫原性肽，如WO2021/239980中所述。该基因中的单核苷酸缺失是最主要的移码突变，但并非发生在所有MSI‑H癌症中。因此，如上文关于TGFβR2所提到的，筛选患者检测此类突变体ASTE1，以找到将从此类疗法中受益的患者将是有用的。

[0007] 目前，要么需要对患者的基因组进行测序以了解其TGFBR2和ASTE1状态，要么依靠DNA扩增然后测序来检测是否存在移码突变。这些测序方法大约需要2天才能完成，通常必须由外部实验室进行，因为医院通常没有可用于进行此类测序的设备。因此，这需要将样品运送到这样的测试实验室。因此，需要提供一种更简单的测定来特异性检测移码突变，特别是为了个性化医疗的目的。

[0008] 聚合酶链式反应(PCR)是一种成熟的DNA序列分析技术。PCR测试的DNA特异性由设计用于与靶标DNA序列相互作用的引物决定。然而，PCR引物通常无法靶向具有四个以上核苷酸重复的区域，这意味着使用引物检测微卫星区域的变化并非易事。

[0009] 因此，需要开发一种在肿瘤活检组织中特异性检测可能与疾病相关的移码突变的技术，特别是在TGFBR2和ASTE1中。实体瘤活检组织并不代表整个肿瘤，因为肿瘤往往是异质的，因此肿瘤活检组织仅代表活检组织所取自的肿瘤部分。相比之下，液体活检组织更能代表整个癌症，并且更容易进行。因此，希望该技术适用于检测液体活检组织(例如血浆)中的游离于细胞DNA(cfDNA)。