[0001] 本发明属于氨基甲酸乙酯的检测技术领域，具体涉及一种基于氧化银漆酶活性比色检测EC的方法。

[0002] 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)主要是发酵过程中由乙醇、尿素、瓜氨酸和氨基甲酰磷酸等产生和贮存下来的小分子化合物，其广泛存在于酒精饮料和发酵食品当中。2007年末，国际癌症研究机构将其升级为可能的人类致癌物(2A类)。氨基甲酸乙酯是一种有毒的氮代谢物，具有神经毒性和强致癌性。长期接触EC可导致人类神经系统疾病和肝脏损伤。然而，只有部分国家，如加拿大、韩国和某些欧盟成员国制定标准酒精饮料中最大‑1允许残留量为150μg·L 。综上所述，建立起检测氨基甲酸乙酯的新方法具有重要意义。迄今为止，很多研究人员针对于氨基甲酸乙酯主要是通过大型仪器进行检测，如气相色谱‑质谱联用(GC‑MS)，高效液相色谱法(HPLC)、同位素稀释气相色谱‑质谱法(ID GC‑MS)等检测方法。虽然大型仪器具有较高的灵敏度和特异性，但是需要较长的检测时间和专业的技术操作人员，前处理时间较长，定期维修设备费用昂贵，这些不足限制了它们在现场大批量初筛酒精饮料和发酵食品中的EC的运用。

[0003] 立方体氧化银(Ag2O)纳米颗粒具有良好的物理、化学、电子特性。同时也具有良好的催化活性、稳定性和环境耐受性。研究发现立方体Ag2O具有漆酶活性，并构建了检测马拉硫磷的比色传感体系。漆酶模拟物能够催化反应体系中的氧转化为水，不会造成环境的二次污染，是一种绿色的催化剂。但上述方法均是在溶液体系中进行其容易受到溶液pH值、高盐浓度、及溶液温度等的影响，限制了立方体Ag2O在食品检测领域运用范围。

[0028] 本发明的技术方案，具体可以按照以下方式实施。

[0029] 一、比色纳米酶片及其制备方法

[0030] 所述比色纳米酶片包括有纸片(类型为CH‑27)，所述纸片包括有底板、吸水垫和样品垫(底板、吸水垫和样品垫按1.3cm×1.3cm规格统一裁剪得到)，吸水垫和样品垫依次固定于底板上，如图5所示。所述纸片上固定有Ag2O‑EC1‑34识别探针，纸片提前经过缓冲液处理并烘干，并且经过石蜡油作疏水处理，形成疏水圈，在该疏水圈内滴加4μL的Ag2O‑EC1‑34识别探针，干燥处理(于37℃下干燥40min)后，得到纳米酶片。

[0031] 所述Ag2O‑EC1‑34识别探针的制备方法为：将立方体Ag2O和EC1‑34核酸适配体混匀后再加入超纯水在37℃条件下孵育10min，制备成Ag2O‑EC1‑34识别探针。

[0032] 优先的，上述立方体Ag2O、EC1‑34核酸适配体和超纯水的体积比为5μL∶4μL∶17μL；其中，立方体Ag2O的浓度为2mg/mL；EC1‑34核酸适配体的浓度为10μM，EC1‑34核酸适配体的序列为：5′‑ACCGACCGTGCTGGACTCTGGGGGCACGGGAGGT‑3′。

[0033] 二、比色法检测EC的方法

[0034] A.绘制EC浓度与颜色强度变化量的标准曲线，根据标准曲线建立线性回归方程；

[0035] A1.在比色纳米酶片上加入已知浓度的EC标准液，反应一定时间后，加入HEPES缓冲液、2,4‑DP溶液和底物4‑AAP制备得到待测组，为A1品；

[0036] A2.在比色纳米酶片上加入超纯水、HEPES缓冲液、2,4‑DP溶液和4‑AAP制备得到空白对照组，为A2品；

[0037] A3.取A1品和A2品，分别用软件处理得到区域颜色强度；

[0038] A4.根据颜色强度，将不同浓度的A1品与A2品之间的颜色强度差值作为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度作为横坐标绘制得到EC浓度与颜色强度变化量的标准曲线。

[0039] 其中，上述步骤A1、A2中，EC标准液/超纯水∶HEPES缓冲液∶2,4‑DP溶液∶4‑AAP的体积比为10μL∶5μL∶7μL∶5μL；步骤A1中，反应时间为10min。HEPES缓冲液的浓度为15mM，pH为7.5；2,4‑DP溶液的浓度为4mg/mL；4‑AAP溶液的浓度为1mg/mL。

[0040] 其中，上述步骤A4中，当EC浓度为10μg/L≤C≤200μg/L时，其浓度与颜色强度变化‑3 2量之间相互关系的回归方程为：y＝1.09×10 C+0.38(R ＝0.996)；其中，y为颜色强度差值＝含EC的待测品颜色强度‑A2品的颜色强度。

[0041] B.采用比色纳米酶片检测待测液并得到颜色强度，计算待测液与空白对照组的颜色强度差值，将该颜色强度差值代入线性回归方程中，即可获得待测液中EC的浓度。

[0042] 其中，上述步骤B中，比色纳米酶片检测待测液的方法为在比色纳米酶片上加入未知浓度的EC待测液，反应一定时间后，加入HEPES缓冲液、2,4‑DP溶液和底物4‑AAP，处理酶片得到颜色强度。EC待测液∶HEPES缓冲液∶2,4‑DP溶液∶4‑AAP的体积比为10μL∶5μL∶7μL∶5μL；其中，HEPES缓冲液的浓度为15mM，pH为7.5；2,4‑DP溶液的浓度为4mg/mL；4‑AAP溶液的浓度为1mg/mL；反应时间为10min。

[0043] 附图1和附图2是本发明的原理推测及可行性研究，表明本发明方法可用于氨基甲酸乙酯检测。附图1中，样品1为氧化银+2,4‑DP+底物(4‑AAP)；样品2为氧化银+适配体(EC1‑34)+2,4‑DP+底物(4‑AAP)；样品3为氧化银+适配体(EC1‑34)+氨基甲酸乙酯(50μg/L)+2,4‑DP+底物(4‑AAP)；样品4为氧化银+适配体(EC1‑34)+氨基甲酸乙酯(100μg/L)+2,4‑DP+底物(4‑AAP)；样品5为氧化银+适配体(EC1‑34)+氨基甲酸乙酯(200μg/L)+2,4‑DP+底物(4‑AAP)；样品6为氧化银+氨基甲酸乙酯(200μg/L)+2,4‑DP+底物(4‑AAP)。

[0044] 本申请利用EC1‑34核酸适配体序列增强立方体Ag2O的漆酶活性并构建快检比色酶片用于EC检测。本方法中使用的适配体序列EC1‑34有两个用途(如图2所示)：作为增强剂调节立方体Ag2O的漆酶催化活性，并作为识别元件结合待测体系中的EC。EC1‑34适配体序列通过附着于立方体Ag2O表面形成带负电荷较多的复合物。复合物能够吸引更多2,4‑DP，并促使它失去更多的电子，导致体系中含有更多的醌自由基，从而使得4‑AAP变为红色化合物，最终比色纳米酶片呈现红色。一旦加入EC，EC优先与EC1‑34结合，导致立方体Ag2O活性位点裸露，立方体Ag2O的漆酶活性不再增强，阻止体系中产生较多的醌自由基，使得快检酶片呈现浅红色甚至无色，如图2所示。并且所构建的比色纳米酶片颜色变化程度与EC浓度正相关，因而该方法可以用于EC检测。

[0045] 下面通过实际的例子对本发明的技术方案和效果做进一步的说明。

[0046] 实施例

[0047] 本发明提供三组采用本发明比色纳米酶片检测EC的实施例，具体实验步骤如下。

[0048] 一、比色纳米酶片的制备：按具体实施方法中比色纳米酶片的制备方法准备比色纳米酶片备用。

[0049] 其中，所使用的立方体Ag2O溶液的制备方法为：在恒温磁力搅拌器中(600rpm)里，‑1 ‑1将50mL氨水(0.01mol·L )缓慢滴入25mLAgNO3溶液(0.01mol·L )中。均匀搅拌10分钟后，边搅拌边向上述混合液中匀速缓慢滴加2.5mLNaOH溶液(2M)。最后将所得沉淀物留在溶液里面静置12个小时，随后以8000rpm的转速将复合物离心10分钟得到棕色沉淀物。收集得到的棕色沉淀物使用无水乙醇和超纯水清洗直到水溶液呈pH为中性。最后，将所收集到的立方体形状的Ag2O在60℃下恒温干燥箱中干燥并避光保存备用。

[0050] 其中，所使用的EC1‑34核酸适配体购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其序列为：5′‑ACCGACCGTGCTGGACTCTGGGGGCACGGGAGGT‑3′，使用前经过高效液相色谱纯化，10000rpm离心10min后溶解于超纯水。所有核酸适配体在使用前在95℃下变性5分钟，然后冷却到室温(25‑30℃)进行后续实验。

[0051] 二、绘制标准曲线，建立回归方程：

[0052] A1：在比色纳米酶片上加入10μL已知浓度的氨基甲酸乙酯标准液，反应10min之后，加入5μL的浓度为15mM(pH 7.5)的HEPES缓冲液，最后加入7μL的浓度为4mg/mL的2,4‑DP溶液和底物5μL的浓度1mg/mL的4‑AAP溶液即可制备得到待测组，为A1品；

[0053] A2：用超纯水替代已知浓度的氨基甲酸乙酯标准液，按照A1的方法即可制备得到空白对照组，为A2品；

[0054] A3：取A1品和A2品，用Image J和Origin 9.0软件处理获得阴性对照孔(G0)和样品孔(G)的区域颜色强度，然后计算颜色强度差值ΔG/G0，获得其颜色强度，ΔG＝G0‑G；

[0055] A4：根据颜色强度，将不同浓度的A1品与A2品之间的颜色强度差值作为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度作为横坐标绘制得到靶标浓度与颜色强度变化量标准曲线，如图3所示。

[0056] A5：根据靶标氨基甲酸乙酯浓度与颜色强度变化量标准曲线建立有关靶标氨基甲酸乙酯浓度与颜色强度变化之间相互关系的回归方程。当氨基甲酸乙酯浓度值C为10μg/L‑3≤C≤200μg/L时，其浓度与颜色强度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝1.09×10 C+
2
0.38(R＝0.996)；y为颜色强度差值＝含EC的待测品颜色强度‑A2品的颜色强度。

[0057] 由图3可知，本发明检测氨基甲酸乙酯的线性范围是10‑200μg/L，并具有最低检测限为10μg/L，表明本发明具有稳定性好、灵敏度高的特点。

[0058] 三、EC的检测

[0059] 在比色纳米酶片上加入10μL待测液，反应10min之后，加入5μL的浓度为15mM(pH7.5)的HEPES缓冲液，最后加入7μL的浓度为4mg/mL的2,4‑DP溶液和底物5μL的浓度1mg/mL的4‑AAP溶液即可制备得到待测组，使用ImageJ处理待测组的纳米酶片得到区域颜色强度，计算待测组与空白对照组的颜色强度差值，将该颜色强度差值代入线性回归方程中，即可获得待测液中靶标氨基甲酸乙酯的浓度。

[0060] 其中，实施例1的待测液为清香型白酒，实施例2的待测液为浓香型白酒，实施例3的待测液为酱香型白酒；分别将实施例1～3的白酒等分为3份，并往样品中分别加入0μg/L、50μg/L、100μg/L的氨基甲酸乙酯，然后采用本发明的方法进行EC的检测，结果如表1所示。

[0061] 表1实施例1～3的EC检测结果

[0062]

[0063]

[0064] 由表1可知，用本发明方法测定氨基甲酸乙酯，得到的回收率为96.5％～101.3％，证明本方法具有可靠性。本发明图4为其它干扰物质对氨基甲酸乙酯检测的影响示意图；由图4可以看出，本发明建立的方法可以特异性地检测出氨基甲酸乙酯，其他竞争性的靶标对氨基甲酸乙酯的检测几乎无干扰。

[0065] 以上所述，仅是本发明专利的较佳实施例而已，并非对本发明专利作任何形式上的限制，任何未脱离本发明专利技术方案内容，依据本发明专利的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变换材质、等同变化与修饰，均仍属于本发明专利技术方案的范围内。