[0001] 本申请涉及植物遗传资源保护技术领域，尤其涉及一种银白杨种子玻璃化超低温保存的方法。

[0002] 超低温保存是指在极端低温如液氮(‑196℃)中长期存储植物细胞或组织，在极端低温环境下被保存的种质资源的细胞分化、新陈代谢以及生理、生化反应几乎完全停止，而细胞活力和形态发生的潜能仍保存。目前超低温保存已在植物的种子、茎段和茎尖的分身组织、胚和体细胞胚、愈伤组织、悬浮细胞、芽等组织或器官中得到成功应用。超低温保存具有无需继代、被保存的种质资源无变异发生以及被保存的材料具有高度的遗传稳定性的优点，是非正常性植物种子和无性繁殖植物等种质资源长期安全的保存方法，也是生物技术材料有效、安全、稳定、经济、长期保存的唯一方法。目前基于超低温保存的方式已经建立了多种保存方法，例如二步降温法、预培养法、包埋干燥法、玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴冰冻法等，其中玻璃化法是指利用高浓度且黏稠的冷冻保存剂为原料，并促使冷冻保存剂与水分子发生强烈的水合作用，从而增加溶液黏性，最后利用该溶液对植物细胞进行渗透脱水，以降低超低温保存过程中冰晶形成速度，因此当温度降低至极端温度时，植物细胞就会转化为无定形的玻璃化结构，而不会受到冰晶损伤，从而使细胞在快速降温或复温过程中得以保护。

[0003] 而玻璃化法的冷冻保存剂经常采用玻璃化保存剂PVS2，且一般的超低温保存流程是：先通过对保存材料进行合适的预培养、装载等处理提高材料对玻璃化液毒害作用的忍耐力，再将植物材料经高浓度的冷冻保护液处理后，迅速投入液氮中，使其组织中的水分转化为玻璃化状态，从而避免形成冰晶造成机械损伤，达到有效保护植物的目的。但冷冻保护液往往具有一定的毒性，存在易造成细胞功能损伤等问题，因此一般需要在植物材料投入液氮之前进行清洗。

[0004] 银白杨属于杨柳科落叶乔木，具有耐寒、深根性、抗风力强、土壤适应性广、木材可用于建筑和造纸等优点，非常适合大面积种植，有助于防治沙漠化、调节气候、保持水土等环境保护方面，另外，银白杨还可以创造经济价值等。但是银白杨种子在自然条件下的寿命很短，另外，现阶段研究证实普通种子库在5℃或‑20℃的标准温度都不足以长期保持银白杨种子的生存能力。

[0031] 为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

[0032] 除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

[0033] 需要说明的是，一般银白杨种子的寿命很短，同时银白杨种子对储存期间低水分和低温的综合压力很敏感，另外自然条件随季节、微环境而异，这使得银白杨种子在自然条件下仅能维持2周至1个月的活力；现阶段研究证实，普通种子库在5℃或‑20℃的标准温度都不足以长期保持银白杨种子的生存能力。因此对于银白杨种子的异地保护和大规模长期保护的唯一选择就是冷冻保存，而冷冻保存的最佳保存方式就是在液氮中的超低温保存。有鉴于银白杨的各种优异特性，为了种植业的可持续发展，有必要对银白杨种子进行超低温冷冻保存。

[0034] 另外，传统的超低温保存过程中发现将植物种子细胞暴露于高浓度的玻璃化冷冻保存剂对植物种子细胞是有害的，因此为了降低玻璃化溶液的毒性，常规的玻璃化超低温保存方式需要通过对种质资源先进行合适的预培养、装载等处理，以提高种质资源对玻璃化液毒害作用的忍耐力和随后高浓度玻璃化冷冻保存剂所引起的脱水耐受性。

[0035] 图1示例性地示出了本申请实施例提供的一种银白杨种子玻璃化超低温保存的方法流程示意图；

[0036] 如图1所示，本申请实施例提供一种银白杨种子玻璃化超低温保存的方法，所述方法包括：

[0037] S1.对银白杨种子进行脱水处理，以得到具有预设含水率的含水种子；

[0038] S2.采用玻璃化冷冻保存剂对具有预设含水率的所述含水种子进行浸泡处理，以得到保护处理种子；

[0039] S3.采用玻璃化冷冻保存剂对所述保护处理种子进行冷冻，以实现所述银白杨种子的超低温保存；

[0040] 其中，所述预设含水率为3.5％～4.5％；

[0041] 在这些实施方式中，预设含水率可以是3.5％～4.5％，可以降低银白杨种子中自由水的含量，而在浸泡处理过程中玻璃化冷冻保存剂对自由水含量低的银白杨种子产生的细胞毒性相对较少，从而可以维持银白杨种子在浸泡处理过程中的细胞活性，进而可以提高玻璃化超低温保存过程中银白杨种子的生存能力。

[0042] 该预设含水率可以是3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％或4.5％。

[0043] 需要说明的是，相比传统的玻璃化超低温保存用来保存植物茎尖的方式，银白杨种子具有较长的时间内保持较高的保存耐久性。

[0044] 需要说明的是，在玻璃化超低温保存过程中，银白杨种子可以在玻璃化冷冻保存剂的保护作用下减缓银白杨种子内冰晶的形成，从而可以保护银白杨种子的细胞结构，有助于维持银白杨种子的代谢活性，另外，经过脱水处理的银白杨种子的细胞质中自由水含量少，在使用玻璃化冷冻保存剂对脱水处理的银白杨种子浸泡处理后，可以提高银白杨种子对玻璃化冷冻保存剂的耐受能力，从而可以在玻璃化超低温保存过程中提高银白杨种子的存活率以及银白杨种子对逆境条件的抵抗性，进而可以促使银白杨种子在玻璃化超低温保存过程中存活下来。

[0045] 在一些可选的实施方式中，所述预设含水率为4.0％；

[0046] 在这些实施方式中，预设含水率可以是4.0％，可以进一步降低银白杨种子中自由水含量，从而可以进一步维持银白杨种子在浸泡处理过程中的细胞活性，进而可以进一步提高玻璃化超低温保存过程中银白杨种子的生存能力。

[0047] 在一些可选的实施方式中，所述浸泡处理的温度为20℃～27℃，所述浸泡处理的时间为55min～65min；

[0048] 在这些实施方式中，浸泡处理的温度可以是20℃～27℃，以及浸泡处理的时间可以是55min～65min，可以促使玻璃化冷冻保存剂充分地渗透到银白杨种子的内部以形成保护性的玻璃化状态，从而可以启动银白杨种子对逆环境的适应性，另外，脱水的银白杨种子会引起细胞结构的损伤，细胞结构的损伤会影响银白杨种子的正常生长和发芽，该浸泡处理还可以避免银白杨种子发生脱水，从而可以维持银白杨种子在玻璃化超低温保存过程的正常代谢活动，进而提高银白杨种子的存活率。

[0049] 该浸泡处理的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。

[0050] 该浸泡处理的时间可以是55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min或65min。

[0051] 在一些可选的实施方式中，所述玻璃化冷冻保存剂包括玻璃化保存剂PVS2；

[0052] 以体积分数计，所述玻璃化保存剂PVS2的原料包括：

[0053] 甘油：25％～35％，乙二醇：10％～20％，二甲基亚砜：10％～20％和蔗糖溶液：35％～45％；

[0054] 在这些实施方式中，玻璃化冷冻保存剂可以包括玻璃化保存剂PVS2，以及玻璃化保存剂PVS2的原料可以包括甘油：25％～35％，乙二醇：10％～20％，二甲基亚砜：10％～20％和蔗糖溶液：35％～45％，可以通过玻璃化冷冻保存剂充分地渗透到银白杨种子的内部以形成保护性的玻璃化状态，从而可以启动银白杨种子对逆环境的适应性。

[0055] 需要说明的是，该蔗糖溶液的浓度可以是0.4M。

[0056] 图2示例性地示出了本申请实施例提供的一种银白杨种子玻璃化超低温保存的方法详细流程示意图；

[0057] 如图2所示，在一些可选的实施方式中，所述对银白杨种子进行脱水处理，以得到具有预设含水率的含水种子，包括步骤：

[0058] S101.对银白杨种子进行自然晾干，后进行干燥处理，以得到具有预设含水率的含水种子；

[0059] 在这些实施方式中，脱水处理可以包括自然晾干和干燥处理，可以减少银白杨种子表面的霉菌和细菌的生长，从而可以降低银白杨种子腐败和损坏的可能性，另外，脱水处理可以促使银白杨种子的含水率达到预设含水率的范围，从而可以维持银白杨种子在浸泡处理过程中的细胞活性，进而可以提高玻璃化超低温保存过程中银白杨种子的生存能力。

[0060] 需要说明的是，该干燥处理可以采用烘箱烘干的方式进行。

[0061] 需要说明的是，该脱水处理还可以降低银白杨种子在冷冻过程中玻璃化冷冻保存剂产生冰晶的概率，另外还能降低已经形成的冰晶对银白杨种子的细胞的损害，同时还不会对银白杨种子本身造成伤害。

[0062] 在一些可选的实施方式中，所述自然晾干的时间≥2周；和/或，

[0063] 所述干燥处理的温度≥100℃，所述干燥处理的时间≤6h；

[0064] 在这些实施方式中，自然晾干的时间可以是≥2周，干燥处理的温度可以是≥100℃，以及干燥处理的时间可以是≤6h，可以促使银白杨种子的自由水含量降低，以得到预设含水率的银白杨种子，另外，该自然晾干和干燥处理还可以减少银白杨种子表面的霉菌和细菌的生长，从而可以降低银白杨种子腐败和损坏的可能性。

[0065] 需要说明的是，该自然晾干可以使用阴凉干燥处自然晾干的方式进行自然晾干。

[0066] 在一些可选的实施方式中，所述超低温保存的时间≥3个月；

[0067] 在这些实施方式中，超低温保存的时间可以是≥3个月，这说明该银白杨种子可以在玻璃化超低温保存条件下长期保存。

[0068] 在一些可选的实施方式中，所述方法还包括：

[0069] S4.对超低温保存的所述银白杨种子进行化冻、冲洗和培养，以实现银白杨种子的恢复培养；

[0070] 在这些实施方式中，方法还可以包括化冻、冲洗和培养，可以促使银白杨种子由冷冻状态恢复到正常状态。

[0071] 在一些可选的实施方式中，所述化冻的温度为35℃～45℃，所述化冻的时间为1.0min～2.0min；

[0072] 在这些实施方式中，化冻的温度可以是35℃～45℃，以及化冻的时间可以是1.0min～2.0min，可以加速银白杨种子的复苏过程以及提高银白杨种子的发芽率，另外，该化冻还可以减轻玻璃化超低温保存过程中对银白杨种子可能造成的冻结伤害，同时该化冻还可以避免化冻过程中因缓慢升温导致的银白杨种子细胞和银白杨种子组织的冻结伤害，从而可以更有利于维持银白杨种子的细胞活力。

[0073] 该化冻的温度可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。

[0074] 该化冻的时间可以是1.0min、1.1min、1.2min、1.3min、1.4min、1.5min、1.6min、1.7min、1.8min、1.9min或2.0min。

[0075] 在一些可选的实施方式中，所述培养的温度为20℃～27℃，所述培养的相对湿度为60RH～70RH；

[0076] 在这些实施方式中，培养的温度可以是20℃～27℃，以及培养的相对湿度可以是60RH～70RH，可以有效地促进化冻后的银白杨种子萌发，从而提高玻璃化超低温保存的银白杨种子的成活率。

[0077] 培养的温度可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。

[0078] 该培养的相对湿度可以是60RH、61RH、62RH、63RH、64RH、65RH、66RH、67RH、68RH、69RH或70RH。

[0079] 需要说明的是，该培养可以使用浸湿的脱脂棉在培养皿中的方式进行培养。

[0080] 该培养可以在暗光条件下进行培养。

[0081] 下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照行业标准测定。若没有相应的行业标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

[0082] 实施例1

[0083] 如图2所示，一种银白杨种子玻璃化超低温保存的方法，包括：

[0084] S101.对银白杨种子在阴凉干燥处进行自然晾干，然后选取部分银白杨种子并使用分析天平测定初始重量，后进行干燥处理，测定干燥后的银白杨种子恒重后，以得到具有预设含水率的含水种子；

[0085] S2.选取具有预设含水率的银白杨种子放入1.8mL的液氮冻存管，然后采用玻璃化冷冻保存剂对具有预设含水率的含水种子进行浸泡处理，以得到保护处理种子；

[0086] S3.采用玻璃化冷冻保存剂对液氮冻存管内的保护处理种子进行冷冻，以实现银白杨种子的超低温保存；

[0087] S4.将超低温保存的液氮冻存管内银白杨种子投入到水浴锅中进行化冻，然后将银白杨种子转移到滤纸上并使用纯水进行3min的冲洗，再将冲洗的银白杨种子转移到含浸湿脱脂棉的培养皿进行暗光培养，以实现银白杨种子的恢复培养；其中，预设含水率为4.0％。

[0088] 浸泡处理的温度为20℃～27℃，浸泡处理的时间为55min～65min。

[0089] 玻璃化冷冻保存剂包括玻璃化保存剂PVS2；以体积分数计，玻璃化保存剂PVS2的原料包括：甘油：30％，乙二醇：15％，二甲基亚砜：15％和蔗糖溶液：40％。

[0090] 自然晾干的时间为2周；

[0091] 干燥处理的温度为100℃，干燥处理的时间为6h。

[0092] 超低温保存的时间为3个月。

[0093] 化冻的温度为40℃，化冻的时间为1.5min。

[0094] 培养的温度为25℃，培养的相对湿度为60RH～70RH。

[0095] 实施例2

[0096] 将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：

[0097] 浸泡处理的温度为20℃，浸泡处理的时间为55min。

[0098] 实施例3

[0099] 将实施例3和实施例1进行对比，实施例3和实施例1的区别在于：

[0100] 浸泡处理的温度为27℃，浸泡处理的时间为65min。

[0101] 实施例4

[0102] 将实施例4和实施例1进行对比，实施例4和实施例1的区别在于：

[0103] 化冻的温度为45℃，化冻的时间为1.0min。

[0104] 实施例5

[0105] 将实施例5和实施例1进行对比，实施例5和实施例1的区别在于：

[0106] 化冻的温度为35℃，化冻的时间为2.0min。

[0107] 对比例1

[0108] 将对比例1和实施例1进行对比，对比例1和实施例1的区别在于：

[0109] 直接对具有预设含水率的银白杨种子进行超低温保存，不采用玻璃化冷冻保存剂进行处理。

[0110] 对比例2

[0111] 将对比例2和实施例1进行对比，对比例2和实施例1的区别在于：

[0112] 浸泡处理的时间为45min。

[0113] 对比例3

[0114] 将对比例3和实施例1进行对比，对比例3和实施例1的区别在于：

[0115] 不采用超低温保存以及玻璃化冷冻保存剂的浸泡处理步骤，直接将具有预设含水率的银白杨种子进行4℃的低温保存。

[0116] 对比例4

[0117] 将对比例4和实施例1进行对比，对比例4和实施例1的区别在于：

[0118] 不采用超低温保存以及玻璃化冷冻保存剂的浸泡处理步骤，直接将具有预设含水率的银白杨种子进行‑18℃的低温保存。

[0119] 对比例5

[0120] 将对比例5和实施例1进行对比，对比例5和实施例1的区别在于：

[0121] 化冻的温度为13℃～19℃。

[0122] 对比例6

[0123] 将对比例6和实施例1进行对比，对比例6和实施例1的区别在于：

[0124] 化冻的温度为30℃。

[0125] 对比例7

[0126] 将对比例7和实施例1进行对比，对比例7和实施例1的区别在于：

[0127] 化冻的温度为50℃。

[0128] 对比例8

[0129] 将对比例8和实施例1进行对比，对比例8和实施例1的区别在于：

[0130] 化冻的方式为慢速复苏，即在0℃冷冻24h后，再在温度为14℃～20℃的条件下化冻3h。

[0131] 对比例9

[0132] 将对比例9和实施例1进行对比，对比例9和实施例1的区别在于：

[0133] 在浸泡处理的前后增加对玻璃化冷冻保存剂的装载和卸载处理，即为：将完整的具有预设含水率的银白杨种子放入冻存管后，向冻存管内加入装载液(LS)处理浸泡20min，然后使用玻璃化冷冻保存剂浸泡处理45min；

[0134] 化冻后使用纯水浸泡2min。

[0135] 对比例10

[0136] 将对比例10和实施例1进行对比，对比例10和实施例1的区别在于：

[0137] 在浸泡处理的前后增加对玻璃化冷冻保存剂的装载和卸载处理，即为：将完整的具有预设含水率的银白杨种子放入冻存管后，向冻存管内加入装载液(LS)处理浸泡20min，然后使用玻璃化冷冻保存剂浸泡处理60min；

[0138] 化冻后使用纯水浸泡2min。

[0139] 对比例11

[0140] 将对比例11和实施例1进行对比，对比例11和实施例1的区别在于：

[0141] 在浸泡处理的前后增加对玻璃化冷冻保存剂的装载和卸载处理，即为：将完整的具有预设含水率的银白杨种子放入冻存管后，向冻存管内加入装载液(质量浓度为60％的PVS2)处理浸泡20min，然后使用玻璃化冷冻保存剂浸泡处理45min；

[0142] 化冻后使用纯水浸泡2min。

[0143] 对比例12

[0144] 将对比例12和实施例1进行对比，对比例12和实施例1的区别在于：

[0145] 在浸泡处理的前后增加对玻璃化冷冻保存剂的装载和卸载处理，即为：将完整的具有预设含水率的银白杨种子放入冻存管后，向冻存管内加入装载液(质量浓度为60％的PVS2)处理浸泡20min，然后使用玻璃化冷冻保存剂浸泡处理60min；

[0146] 化冻后使用纯水浸泡2min。

[0147] 对比例13

[0148] 将对比例13和实施例1进行对比，对比例13和实施例1的区别在于：

[0149] 浸泡处理的时间为45min，浸泡结束后更换新鲜的玻璃化冷冻保存剂溶液。

[0150] 对比例14

[0151] 将对比例14和实施例1进行对比，对比例14和实施例1的区别在于：

[0152] 浸泡结束后更换新鲜的玻璃化冷冻保存剂溶液。

[0153] 相关结果和数据：

[0154] 统计实施例1至5以及对比例1至14的各组保存银白杨种子的存活率，统计结果如表1所示，其中，存活率的统计方式为：

[0155] 恢复培养时选取20粒的银白杨种子，然后记录恢复培养阶段所萌发的银白杨植株的数量，以计算成活率，成活率的计算公式为：

[0156] 成活率(％)＝银白杨种子萌发数/20×100％

[0157] 表1各实施例和对比例所保存的银白杨种子的存活率

[0158]

[0159]

[0160] 从表1可知，相比于对比例中省略浸泡处理的步骤或缩短浸泡处理的时间至45min，本申请控制浸泡处理的时间为60min，其玻璃化超低温保存的银白杨种子成活率显著提升。

[0161] 由对比例5、对比例6与实施例相比可知，采用对比例5的较低化冻温度，会降低银白杨种子的化冻速度，从而会提高超低温冷冻保护剂中二甲基亚砜对银白杨种子的毒害作用，影响银白杨种子的成活率。

[0162] 同时将对比例13、对比例14与实施例相比，虽然其成活数和成活率与实施例的相近，但是对比例13和对比例14都引入了“在浸泡结束后更换新鲜的玻璃化冷冻保存剂溶液”这一操作，这使得对比例14和对比例14的整体的超低温保存的耗时会增加5min以上。

[0163] 另外相比于传统玻璃化超低温保存过程中装载、卸载处理和更换玻璃化冷冻保存剂等步骤(对比例9至对比例12)，总耗时大约131min(装载液LS/60％PVS2配制需要大约10min、装载处理浸泡需要大约23min、卸载处理需要大约23min、PVS2的配制需要大约
10min、PVS2的浸泡处理需要大约60min、化冻需要大约2min以及纯水冲洗需要大约3min)，本发明在省略这些步骤后，耗时大约75min(超低温冷冻保存剂的配制需要大约10min、超低温冷冻保存剂的浸泡处理需要大约60min、化冻需要大约2min以及纯水冲洗需要大约
3min)，并且经过玻璃化超低温保存的银白杨种子的成活率并未下降甚至略微提升。

[0164] 此外，本申请实施例中化冻的温度对银白杨种子的成活率也具有较大影响，同时保存温度的合理选择也能够对银白杨种子的成活率起到积极作用。

[0165] 本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

[0166] 在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a‑b(即a和b),a‑c,b‑c,或a‑b‑c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

[0167] 以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。