[0001] 本发明涉及冬虫夏草保鲜技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草的液氮冻结锁鲜工艺及贮运方法。

[0002] 鲜冬虫夏草作为一种名贵的中药材，其保鲜问题一直是困扰季节性产品质量控制和运输的难题。由于冬虫夏草的生长周期和采摘时间具有季节性特点，采摘后若不能及时进行有效保鲜，极易导致其活性成分和营养物质的损失，从而影响其药用价值和市场价格。传统的保鲜方法如冷藏和冷冻虽能在一定程度上延长冬虫夏草的保质期，但仍存在部分营养成分流失和品质下降的问题。冷藏方法在低温环境下只能延缓微生物的繁殖，但并不能完全抑制酶的活性，从而导致部分营养成分的降解。传统的冷冻方法虽然能够抑制微生物和酶的活性，但在冷冻过程中，冰晶的形成会破坏冬虫夏草的细胞结构，导致其组织结构受到损伤，解冻后容易出现品质下降和营养流失的现象。冬虫夏草作为名贵的中药材，通常会选择装入更有美感和高级感的有形容器中，从而提高其感官价值和市场价值，但是如何将刚采摘的冬虫夏草尽可能得保鲜冷冻于有形容器中，提高其品质是目前需要解决的问题之一。

[0021] 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0022] 常规的液氮冻结技术可以在短时间内迅速将冬虫夏草冷冻至适当温度，避免大冰晶形成，同时在运输过程中保持稳定的低温环境，防止温度波动带来的解冻和再次冻结问题，有助于维持产品的感官品质和营养价值，延长其保质期，提高市场竞争力。但是，针对容器装的冬虫夏草，不管是先将冬虫夏草液氮冻结后装入容器，还是将容器与冬虫夏草一起冻结，均存在冬虫夏草保鲜效果不佳，以及冬虫夏草易断裂的问题。

[0023] 鉴于此，本发明的一个方面，本发明提供一种冬虫夏草的液氮冻结锁鲜工艺。根据本发明的实施例，该工艺包括：S100：采挖的新鲜冬虫夏草清洁后装入容器

[0024] 该步骤中，将冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，若采挖地与工厂相距较远，清洁处理后可使用冰袋保鲜，24小时内运输至工厂装入容器进行后续处理，尽可能的保持了冬虫夏草采挖前的新鲜度。

[0025] 本领域技术人员可以理解的是，冬虫夏草采挖后在环境中停留的时间越短，冬虫夏草的品质损失减少的越少，对于采挖后冬虫夏草的具体的处理工艺，本领域技术人员可根据实际进行调整选择，此处不做特别限定。

[0026] S200：向装有冬虫夏草的容器加入加液氮

[0027] 该步骤中，向装有冬虫夏草的容器内加入液氮，液氮的挥发使容器内的空气排出，一方面，冬虫夏草至于氮气中，避免了空气中氧气等成分造成的冬虫夏草的氧化，同时避免了冬虫夏草的有氧呼吸造成的代谢物积累引起的冬虫夏草新鲜度丧失；另一方面，液氮的迅速挥发可以对容器内的冬虫夏草有一定的预冷作用。

[0028] 根据本发明的实施例，液氮的加入量至少要置换出容器中所有的空气。本领域技术人员可以理解的是，液氮的滴加最终是为了排出容器内所有的空气，因此，为了保证冬虫夏草完全处于氮气中，尽可能的滴加一定数量的液氮，保证容器内空气的排出。容器的大小不同，本领域技术人员可根据容器的大小来衡量滴加的液氮的质量。

[0029] S300：置换出空气后对容器进行封口

[0030] 该步骤中，将封口后的容器用液氮进行喷淋，因为上述液氮挥发的预冷作用，一方面，有利于容器内的冬虫夏草快速冻结，节约喷淋液氮的用量，降低了成本，且避免了直接液氮喷淋造成得冬虫夏草的断裂；另一方面，预冷后再进行液氮喷淋冷冻，可以更大程度减少大冰晶的形成，保持了冬虫夏草的细胞结构，提高其品质和营养。

[0031] 根据本发明的实施例，置换出空气后在3s～8s内对容器进行封口。在置换出空气后，迅速将容器封口，可以避免外部的空气再次进入容器内，进而保证了冬虫夏草一直处于氮气气氛中。

[0032] S400：将封口后的容器用液氮进行喷淋

[0033] 该步骤中，将封口后的容器用液氮进行喷淋，通过在容器上喷淋液氮，迅速对容器以及容器内的冬虫夏草进行降温冻结，从而实现了容器内的冬虫夏草的快速冻结。

[0034] 根据本发明的实施例，液氮包括‑80℃至‑130℃雾化液氮。例如雾化液氮的温度为‑80℃，‑90℃，‑95℃，‑100℃，‑110℃，‑120℃，‑125℃，‑130℃等，采用上述温度的雾化液氮，可以迅速的将容器内的冬虫夏草冻结，且避免了大冰晶的形成以及解决了冬虫夏草的断裂问题。进一步地，雾化液氮喷淋的时间为30s～180s。

[0035] 根据本发明的实施例，冬虫夏草液氮冻结后的温度为‑20℃至‑30℃，从而保证了冬虫夏草的最大新鲜度以及避免冬虫夏草的断裂。

[0036] 目前的快递运输行业越来越普及，特别是冬虫夏草的快递运输也越来越多，如何保证快递运输过程中冬虫夏草的新鲜度是保证客户满意的重要因素。然而特别是环境温度较高时，快递运输不可能保证冬虫夏草一直处于冷冻装置内，此时如何避免运输中高温环境造成的冻结的冬虫夏草的解冻是非常关键地，它决定了客户在收到冬虫夏草后直接感官评价。

[0037] 鉴于此，本发明的另一方面，本发明提出了一种贮运上述液氮冻结锁鲜工艺得到的冬虫夏草的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将液氮冻结后的装有冬虫夏草的容器置于运输盒中，所述运输盒内装有干冰和冰
块。

[0038] 通过在运输盒内装有干冰和冰块，干冰的挥发可以降低运输盒内的温度，冰块可以调控干冰的挥发速率，通过干冰和冰块的混合协同使用，保证在一定时间内运输盒内的冬虫夏草维持在需要的温度范围内，即使在快递运输过程中外界环境温度较高，也能保证48小时内，运输盒内环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，从而保证了冬虫夏草在快递运输过程中的新鲜度和品质。

[0039] 本领域技术人员可以理解的是，运输盒是采用保温效果较好的材质制成，例如泡沫材质等，通过选择保温效果好的运输盒，可以保证运输盒内的温度变化幅度小，从而保持了冬虫夏草的低温环境。

[0040] 根据本发明的实施例，干冰与冰块的质量比为(1～3)：(1～3)。例如，干冰与冰块的质量比为1:1，1:2，1:3，2:1，2:3，3:1，3:2等。发明人发现，通过控制干冰与冰块的质量比在上述范围内，可以显著发挥干冰和冰块的协同作用，保证48小时内，运输盒内的温度较低。

[0041] 根据本发明的实施例，运输盒的体积为31500cm3，运输盒内装有1～3袋干冰和1～3袋冰块，干冰每袋300g，冰块每袋300g。

[0042] 下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

[0043] 实施例1

[0044] (1)野生冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，使用冰袋保鲜，16小时内运输至工厂，进行包装。

[0045] (2)滴氮降温及气体置换：在装有野生冬虫夏草包装瓶(瓶的体积为75.4cm3，直径为4cm，高度为6cm)中滴入1滴液氮，迅速降温，液氮在降温的过程中于包装瓶内汽化。

[0046] (3)汽化气调及密封处理：通过汽化形成的氮气置换出空气，在3秒内进行封口。

[0047] (4)雾化液氮喷淋冻结：将上述带包装的冬虫夏草样品用温度为‑80℃雾化液氮喷淋150秒钟，冬虫夏草中心温度达到‑20℃。

[0048] (5)将雾化液氮处理的包装的冬虫夏草样品，放入提前准备好的运输泡沫盒中，泡3
沫盒体积为31500cm，即长×宽×高为35cm×30cm×30cm，泡沫盒内包含预先放置好1袋
(300g)干冰和3个冰袋(300g)，密封泡沫盒。

[0049] (6)48小时内，泡沫盒环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，此时外界环境温度为20℃，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，贮藏1‑3个月。

[0050] 实施例2

[0051] (1)野生冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，使用冰袋保鲜，16小时内运输至工厂，进行包装。

[0052] (2)滴氮降温及气体置换：在装有野生冬虫夏草包装瓶(瓶的体积为282.6cm3，直径为6cm，高度为8cm)中滴入2滴液氮，迅速降温，液氮在降温的过程中于包装内汽化。

[0053] (3)汽化气调及密封处理：通过汽化形成的氮气置换出空气，在4秒内进行封口。

[0054] (4)雾化液氮喷淋冻结：将带包装的冬虫夏草样品用温度为‑100℃雾化液氮喷淋90秒。雾化液氮喷淋冬虫夏草中心温度达到‑20℃。

[0055] (5)将雾化液氮处理的冬虫夏草样品，放入提前准备好的运输泡沫盒中，泡沫盒体3
积为31500cm ,即长×宽×高为35cm×30cm×30cm，泡沫盒内包含预先放置好2袋(每袋
300g)干冰和2个冰袋(每袋300g)，密封泡沫盒。

[0056] (6)48小时内，泡沫盒环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，此时外界环境温度为20℃，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，贮藏时间1‑3个月。

[0057] 实施例3

[0058] (1)野生冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，使用冰袋保鲜，20小时内运输至工厂，进行包装。

[0059] (2)滴氮降温及气体置换：在装有野生冬虫夏草包装瓶(瓶的体积为502.4cm3，直径为8cm，高度为10cm)中滴入3滴液氮，迅速降温，液氮在降温的过程中于包装内汽化。

[0060] (3)汽化气调及密封处理：通过汽化形成的氮气置换出空气，在7秒内进行封口。

[0061] (4)雾化液氮喷淋冻结：将带包装的冬虫夏草样品用温度为‑120℃雾化液氮喷淋30秒，冬虫夏草中心温度达到‑25℃。

[0062] (5)将雾化液氮处理的冬虫夏草样品，放入提前准备好的运输泡沫盒中，泡沫盒体3
积为31500cm ,即长×宽×高为35cm×30cm×30cm，泡沫盒内包含预先放置好2袋(每袋
300g)干冰和1个冰袋(每袋300g)，密封泡沫盒。

[0063] (6)48小时内，泡沫盒环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，此时外界环境温度为20℃，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，贮藏时间1‑3个月。

[0064] 对比例1

[0065] (1)野生冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，使用冰袋保鲜，16小时内运输至工厂，进行包装。

[0066] (2)将带包装的冬虫夏草样品置于‑20℃实验冰箱中冷冻120分钟，冬虫夏草中心温度达到‑20℃。

[0067] (3)将冷冻的冬虫夏草样品，放入提前准备好的运输泡沫盒中，泡沫盒体积为3
31500cm ,即长×宽×高为35cm×30cm×30cm，泡沫盒内包含预先放置好1袋(300g)干冰和
3个冰袋(300g)，密封泡沫盒。

[0068] (4)48小时内，泡沫盒环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，贮藏时间1‑3个月。

[0069] 对比例2

[0070] (1)野生冬虫夏草采挖后，即刻进行刷土、深度清洁处理，使用冰袋保鲜，16小时内运输至工厂，进行包装。

[0071] (2)雾化液氮喷淋冻结：将装有野生冬虫夏草样品的包装瓶(瓶的体积为75.4cm3，直径为4cm，高度为6cm)，用温度为‑80℃雾化液氮喷淋150秒，冬虫夏草中心温度达到‑20℃。

[0072] (3)将雾化液氮处理的冬虫夏草样品，放入提前准备好的运输泡沫盒中，泡沫盒体3
积为31500cm ，即长×宽×高为35cm×30cm×30cm，泡沫盒内包含预先放置好1袋(300g)干冰和3个冰袋(300g)，密封泡沫盒。

[0073] (4)48小时内，泡沫盒环境温度始终维持在‑20℃以下，鲜冬虫夏草不解冻，此时外界环境温度为20℃，冬虫夏草到达目的地，立即于‑20℃的冰箱中贮藏，贮藏时间1‑3个月。

[0074] 对实施例1‑3和对比例1‑2中经冻藏后的冬虫夏草进行品质测定，主要包括：丙二醛、细胞活力、感官评价、质构测定、虫草多糖含量测定、虫草素含量测定、ABTS自由基清除能力的测定、DPPH自由基清除能力和SOD酶活力的测定。具体方法如下：(1)丙二醛的测定：参照Yan等人(Variation in cell membrane integrity and 
enzyme activity of the button mushroom(Agaricus bisporus)during storage and transportation.Journal of Food Science and Technology,2021,58:1655‑1662)，将
0.5g解冻后的冬虫夏草浸入5mL 100g/L三氯乙酸(TCA)中，4℃下9000×g离心20min，取
0.3mL MDA上清与3mL 0.5％硫代巴比妥酸溶液混合。然后在100℃下加热20分钟，冷却至室温。在450nm、532nm、600nm处测量该混合物的吸光度，丙二醛含量计算公式:c(μ/mol)＝(OD532‑OD600)×6.45‑OD450×0.56。

[0075] (2)细胞活力(μgTTC/g)的测定：参考Li等人(Effects of high‑pressure freezing and deep‑frozen storage on cell structure and quality of cordyceps sinensis.LWT,2023,175:114044)，冷冻的冬虫夏草样品在冰箱中4℃解冻2h，然后在试管中浸入5ml 2,3,5‑三苯基四唑氯(TTC)溶液和5ml磷酸钾缓冲液中，在37℃黑暗中孵育3h，然后加入2ml硫酸溶液(1mol/L)终止反应。孵育后，将样品放入冷平台上的研钵中以保持研钵的低温。砂浆中加入石英砂1g和乙酸乙酯3‑5mL，充分研磨提取三苯基甲酸(TF)，转移到容量瓶中，总容积定容为20ml，记录TF‑乙酸乙酯溶液在485nm处的吸光度。以Na2S2O4建立TF溶液的校准曲线，以乙酸乙酯吸光度为空白计算CS样品中TF的含量。

[0076] (3)硬度的测定方法：采用CT3质构分析仪，将方形探针以1mm/s的恒定速度压在冬虫夏草上，连续两个周期，周期间隔10s。

[0077] (4)虫草多糖含量的测定：参考GB/T 15672‑2009《食用菌中总糖含量的测定》方法。

[0078] (5)虫草素和腺苷的测定方法为，将0.2g冬虫夏草样本称取于EP管中，加入8mL水进行超声提取60min，期间振荡数次，8000r/min离心8min，取上清液并定容至10mL。吸取适量上清液后0.22μm针头式过滤器过滤后上机检测。检测波长为260nm，C18反相色谱柱(250mm x4.6 mm，5μm)，柱温30℃；流动相A为水、流动相B为甲醇溶液。梯度洗脱：0～5min，95％→85％A；5～10min，85％→80％A；10～20min，80％→60％A；21～28min，5％A；29～
40min，95％A；流速0.5mL/min，进样体积10μL。同时称取腺苷、虫草素标准品，用水溶解配制成不同质量浓度的标准溶液。按照上述条件依次检测标准溶液峰面积，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，计算得到标准品曲线。将样品测定的峰面积带入标准曲线后计算对应含量。

[0079] (6)ABTS(2,2'‑联氮‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸)自由基清除能力的测定参考Hanani等人(Effect of pomegranate(Punica granatum L.)peel powder on the antioxidant and antimicrobial properties of fish gelatin films as active packaging.Food Hydrocolloids,2019,89:253‑259.)，分别配制7mM ABTS溶液和2.45mM过硫酸钾溶液并等量(1:1，v/v)混合均匀，室温避光放置12‑16h，即为ABTS母液；用蒸馏水稀释ABTS母液直至其吸光值在734nm处为0.70±0.02，该稀释液用于后续试验。取80μL冬虫夏草水提取液和8mL ABTS稀释液混合均匀后避光反应10min，随后在734nm处测定吸光值，空白对照为等量的蒸馏水。

[0080]

[0081] (7)DPPH(1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼)自由基清除能力的测定：参考Henriques等人(Characterization of protein hydrolysates from fish discards and by‑products from the North‑West Spain fishing fleet as potential sources of bioactive peptides.Marine Drugs,2021,19(6),338.)。取不同浓度的样品溶液0.5mL和
5mL的DPPH溶液混合均匀后，室温避光反应30min，随后在517nm处测定吸光值；空白对照更换为等量的蒸馏水，维C溶液作为阳性对照。

[0082]

[0083] (8)超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定：采用黄嘌呤氧化酶法，具体步骤如下：首先，制备含有0.05M磷酸缓冲液(pH 7.8)、0.1mM EDTA、0.1mM黄嘌呤和0.025mM氮蓝四唑(NBT)的反应液。然后，将样品与反应液混合，在室温下反应5分钟。接着，加入0.1U/mL黄嘌呤氧化酶启动反应，并在560nm波长下测定吸光度变化。SOD活性通过抑制NBT还原生成蓝色色产物的能力来计算，单位定义为50％抑制率所需的酶量。

[0084] (9)感官评价方法：由受专门培训的感官评定小组(12人)根据表1对鲜虫草解冻后虫草的感官品质综合评分，最后取平均值。以五项指标成绩取平均作为最终感官评价结果，<5分表示已发生较明显的品质劣变。

[0085] 表1冬虫夏草感官评价标准

[0086] 实施例1‑3和对比例1‑2中的冬虫夏草在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的主要品质指标测定结果见表2。

[0087] 表2

[0088] 从表2的数据可知，实施例1、实施例2和实施例3在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的感官评价、硬度、丙二醛(MDA)含量、TTC含量指标均优于对比例1和对比例2，对比例2在各时间点的指标优于对比例1。实施例组在各时间点的感官评分显著高于对比例组，显示出更好的外观和气味保留效果。硬度方面，实施例组也表现出更高的数值，表明本申请的液氮冻结工艺可以有效保持冬虫夏草的质地。此外，实施例组的丙二醛含量较低，TTC含量较高，进一步证明了本申请的液氮冻结工艺在减少脂质过氧化和保留活性成分方面的优势。实施例1、实施例2和实施例3在各时间点的指标优于对比例2，表明本申请的滴氮降温和气体置换具有良好的效果。

[0089] 实施例1‑3和对比例1‑2中的冬虫夏草在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的主要营养指标测定结果见表3。

[0090] 表3

[0091] 根据表3的数据可知，实施例1、实施例2和实施例3在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的虫草多糖、腺苷和虫草素含量均显著高于对比例1和对比例2。实施例组在90天时的虫草多糖含量显著高于对比例组，显示出更好的营养成分保留效果。腺苷和虫草素含量方面，实施例组在整个贮藏期间均保持较高水平，表明本申请的液氮冻结工艺在保持冬虫夏草营养成分方面具有显著优势。实施例1、实施例2和实施例3在各时间点的指标优于对比例2，表明本申请的滴氮降温和气体置换在营养成分保留效果方面具有良好的效果。

[0092] 实施例1‑3和对比例1‑2中的冬虫夏草在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的主要抗氧化活性指标测定结果表4。

[0093] 表4

[0094] 根据表4的数据可知，实施例1、实施例2和实施例3在低温冷库(‑20℃)贮藏期间的抗氧化能力(ABTS、DPPH、SOD)均优于对比例1和对比例2。实施例组在各时间点的ABTS和DPPH抗氧化活性显著高于对比例组，显示出更强的抗氧化能力。SOD活性方面，实施例组在贮藏期间保持较高水平，进一步证明了本发明的滴氮及雾化液氮速冻与干冰贮运方法，能够很好地保持冬虫夏草的品质，在增强冬虫夏草抗氧化能力方面的有效性。

[0095] 以上结果表明，与传统冷冻方法(对比例1)相比，滴氮及雾化液氮冻结锁鲜工艺在保持冬虫夏草的品质和营养成分方面具有明显优势。滴氮降温和气体置换结合液氮冻结锁鲜工艺和冷冻运输方法为冬虫夏草的长时间贮藏和运输提供了科学有效的解决方案，具有显著的应用前景和创新性

[0096] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。