[0001] 本发明涉及种子无菌保存技术领域，具体涉及一种柑橘种子无菌保存方法和无菌黄化苗的培育方法。

[0002] 柑橘是我国重要的经济果树，长期的无性繁殖使柑橘易感染多种病毒和类病毒病害，在生产中造成巨大的经济损失，种植无病毒苗是目前防治该类病害最为有效的措施。柑橘基因的研究可以改良其品质，提高抗病、抗虫、抗旱等性状，提高产量和农业效益，而研究过程中必须使用转基因植株对基因功能进行鉴定。柑橘无病毒苗和转基因植株培育中都需要使用无菌黄化苗作砧木进行微嫁接，而无菌黄化苗是无菌柑橘种子在无菌培养基中暗培养而成，被细菌或真菌污染的柑橘种子难以培养出无菌黄化苗，因此柑橘种子的无菌保存对黄化苗的培育至关重要。

[0003] 柑橘种子每年集中于10‑12月成熟，而组培工作是全年进行的，黄化苗要现培育现用，保存时间超过30天的黄化苗活力明显下降，因此种子需要长时间的无菌保存。目前，主要采用鲜果内保存和种衣剂拌种两种方法来保存培育黄化苗的柑橘种子。鲜果内保存就是在果实采摘后不将种子取出而是直接保存果实，使用时将种子从果实中取出后立即播种，不需要额外使用杀菌剂处理果实和种子；该方法需要大量的储存空间，存放过程中需不断挑选出霉烂果实，耗费较多人力和物力，且保存时间也不长。种衣剂拌种是果实采摘后立即取出种子，用种衣剂拌种后存放于阴凉干燥处；此方法种子无菌保存时间短，一般保存3‑6个月后真菌或细菌污染到子叶部位使用消毒剂也无法灭杀，用于无菌培养会产生大量的污染，难以获得无菌黄化苗，严重影响播种效果。

[0004] 因此，发明一种柑橘种子无菌保存的方法来解决上述问题很有必要。

[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

[0029] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0030] 1、主要实验材料：

[0031] 本发明中的柑橘种子指柑橘类(Citrus reticulata Blanco)果实的种子，柑橘包括橙、柚、枳、枸橼、金橘、大冀橙、宜昌橙和宽皮柑橘八大类。本发明各实施例中用的柑橘种子都是卡里佐枳橙(Poncirus trifoliata(L.)Raf.×Citrussinensis(L.)Osbeck)的种子。

[0032] 2、主要试剂：

[0033] MS培养基：常规植物组织培养基，常规市售产品。

[0034] 二氯异腈脲酸钠：C3Cl2N3NaO3，CAS号2893‑78‑9。

[0035] 吐温20：一种表面活性剂，常规市售产品。

[0036] 10％二氯异腈脲酸钠+0.1％吐温20溶液：称取10g二氯异腈脲酸钠溶解于100ml水中，再加入0.1ml吐温20，搅拌均匀。5％二氯异腈脲酸钠+0.1％吐温20溶液的配制方法按此类推。柑橘种子较轻，消毒时有的会漂浮在消毒液表面，使种子消毒不完全，吐温20可降低溶液的表面张力，使种子完全浸没在消毒液中，消毒完全。

[0037] 5％次氯酸钠：5mL次氯酸钠加入100mL水中，搅拌均匀。1％的次氯酸钠溶液配制方法按此类推。

[0038] 1％的8‑羟基喹啉硫酸盐溶液：将1g 8‑羟基喹啉硫酸盐(CAS号：134‑31‑6)加入100mL水中溶解，搅拌均匀。

[0039] 实施例1、本发明的柑橘种子无菌保存方法以及无菌黄化苗培育方法[0040] 一、种子容器

[0041] 用于本发明方法保存种子的种子容器的结构如图1所示，种子容器1的中下部设置有隔水垫2，顶部设置有盖子3，所述隔水垫2上设置有透水孔2a，隔水垫2的上表面与种子容器1的底部之间留有距离，以将隔水垫2上堆积的柑橘种子与种子容器1底部蓄积的水隔开，防止柑橘种子浸泡在种子容器1底部的水中。种子消毒后经无菌水清洗后在种子表面带水的状态下直接放入种子容器1中堆积在隔水垫2的上表面上，种子表面带的无菌水从隔水垫2上的透水孔2a漏到种子容器1的底部，隔水垫2将种子保持在种子容器1底部蓄积的水之上，防止种子浸泡在水中，同时种子容器1底部的水也能维持种子容器1内部的湿度，利于种子的长期保存。

[0042] 二、本发明的柑橘种子无菌保存方法以及无菌黄化苗培育方法

[0043] 本发明的柑橘种子无菌保存方法，其按照以下步骤操作：

[0044] S1.种子容器、实验器具准备与消毒：本实施例中，种子容器采用玻璃试管，将耐高温的PC(聚碳酸酯，分子链中含有碳酸酯基的高分子聚合物)薄板卷成与直径2.5厘米的试管匹配且种子不会漏下去的圆筒状(高约4厘米)作为隔水垫(如图2所示)，放入试管底部，盖上试管塞后120℃灭菌20分钟；

[0045] 实验过程中需要用到的各种器具消毒：蒸馏水装入锥形瓶，镊子、药匙和滤纸装入烧杯，装有MS固体培养基的试管，空培养瓶、锥形瓶和培养皿均120℃灭菌20分钟。

[0046] S2.种子取出与清洗：用刀将采摘的新鲜、无霉烂卡里佐枳橙果实切开，取出果实中的种子，用自来水反复冲洗，直至完全去除种子上残存的果肉，并将不饱满、外种皮有裂口或被刀割伤的种子扔掉，只留下完整饱满的种子。

[0047] S3.种子消毒：用滤纸吸干柑橘种子表面的水分，先用75％酒精浸泡30～60秒，再放入10％二氯异腈脲酸钠+0.1％吐温20溶液中浸泡20分钟。

[0048] S4.冷藏保存：消毒后的柑橘种子用无菌水清洗3次，第3次清洗后尽量将容器中的无菌水倒出，此时种子表面还带有大量水分，直接将清洗后的种子装入S1中灭菌后的试管中(种子在保存过程中需要保持一定的湿度)，盖上塞子(如图3所示)后放入4℃环境中保存。

[0049] 本发明的无菌黄化苗培育方法，是在前述步骤S1～S4的基础上进行步骤S5：

[0050] S5.无菌黄化苗培育：保存的柑橘种子剥除内、外种皮，得到种子胚，用1％的次氯酸钠溶液浸泡10分钟，用无菌水清洗3次，播种在装有MS+蔗糖30g/L的固体培养基的试管中，每支试管播1颗种子，于27℃暗培养14天，培育出无菌黄化苗(如图4所示)。三、不同保存时间种子的播种污染率：

[0051] 采用前述本发明的方法，将处理至步骤S4的种子在4℃中保存了90天，180天，270天和360天的种子分别按照步骤S5培育无菌黄化苗，测定不同保存时间种子的出苗率和播种污染率情况，结果如表1所示。

[0052] 表1、不同保存时间种子出苗数和播种污染率

[0053]

[0054] 注：试管中出现霉斑或菌斑的即判为污染苗。

[0055] 从表1可以看出：保存时间在180天之内的种子播种黄化苗未出现污染，之后随着种子保存时间的增加，黄化苗的污染率显著增高，但360天时污染率也仅为5.5％，说明本发明保存方法切实可行。

[0056] 对比例1、不同种子保存方法对种子出苗率和播种污染率的影响

[0057] 本实施例进行了不同的种子保存方法的比较，共进行了C1‑C5组实验，这些实验组的处理方法与实施例1中本发明的方法的不同之处在于：

[0058] C1为保存种子的试管中不放入折叠为圆筒状的PC薄板，直接将种子放入试管中；

[0059] C2为种子消毒时，用5％二氯异腈脲酸钠+0.1％吐温20溶液浸泡20分钟；

[0060] C3为种子消毒时，用10％二氯异腈脲酸钠+0.1％吐温20溶液浸泡10分钟；

[0061] C4为种子消毒时，用5％次氯酸钠+0.1％吐温20溶液中浸泡20分钟；

[0062] C5为播种时无菌保存的种子不剥除内、外种皮，不消毒而直接播入培养基。由于种子本是无菌保存的，由于不剥除种皮，整个操作并未脱离无菌环境，因此不用消毒直接播种。

[0063] 不同的方法下，种子均保存270天，C1‑C4组按照实施例1中S5步骤培育无菌黄化苗，实验统计得到种子出苗率和播种污染率，如表2所示。

[0064] 表2、C1‑C5实验组种子出苗率和播种污染率

[0065]

[0066]

[0067] 从表2可以看出：本发明方法较其它5种对比方法能更好获得柑橘的无菌黄化苗。

[0068] 本发明方法与C1区别在于折叠的PC薄板避免了底层种子浸泡在残留的水分中，种子泡水时间长会加速其呼吸作用并引发酵素反应，造成种子死亡。本发明方法中的种子消毒方法明显较C2、C3和C4的消毒方法更适合柑橘种子的长期无菌保存，污染率显著降低。相较于C5，本发明方法剥去内、外种皮有助于种子的吸水和发芽，出苗率显著提高，且使种子发芽时间较一致易于操作管理；剥去内、外种皮还可以使内、外种皮已被污染的种子经再次消毒后播种仍能得到无菌黄化苗。

[0069] 对比例2、常规储存柑橘果实取种子的方法

[0070] 储存柑橘果实取种子的方法是目前较为常用的方法：果实采摘后不将种子取出而是直接保存果实，使用时将种子从果实中取出后立即播种。

[0071] 一、储存柑橘果实取种子的方法

[0072] 按照如下步骤操作：

[0073] 1.保鲜剂配制：将13.5克科力鲜(高效柑桔专用贮藏保鲜剂，中国农业科学院柑橘研究所研制)药粉倒入容器中，然后加入少量温热水，搅拌至粉末完全溶解，再加自来水至总体积5升，充分搅匀。

[0074] 2.浸果：采摘的新鲜、无霉烂卡里佐枳橙果实完全浸入1所述科力鲜溶液中，然后捞出阴干。

[0075] 3.果实保存：阴干的柑橘果实用水果保鲜袋套袋密封(一果一袋)，放入4℃环境中保存，每30天检查一次，扔掉霉烂的果子。

[0076] 4.无菌黄化苗培育：选取未霉烂的果实用刀切开取出种子，种子用自来水反复冲洗，直至完全去除种子上残存的果肉，剥除种子的内、外种皮，用1％的次氯酸钠溶液浸泡10分钟，用无菌水清洗3次，播种在装有MS+蔗糖30g/L的固体培养基的试管中，每支试管播1颗种子，于27℃暗培养14天。

[0077] 二、不同保存时间种子的播种污染率

[0078] 将新鲜果实中取出的种子和按照上述方法放置在温度为4℃中保存了90天，180天的果实中取出的种子分别播种培育无菌黄化苗，暗培养14天，测定不同保存时间种子的出苗率和播种污染率。约210天时发现储藏的果子已经全部霉烂，所有种子污染严重，故没做保存270天和360天的播种试验。

[0079] 表3、不同保存时间种子出苗率和播种污染率

[0080]

[0081] 从表3可以看出：随着种子保存时间的增加，种子播种的黄化苗污染率急剧增加；特别是210天时果子霉烂严重，种子都已污染不可用于培育无菌黄化苗，说明此保存方法保存时间短；而本发明方法种子保存270天后播种培育无菌黄化苗的出苗率仍然高达100％，污染率也仅为2％。本发明方法显著优于本实施例方法。

[0082] 对比例3、常规储存柑橘种子的方法

[0083] 一、储存柑橘种子的方法

[0084] 按照如下步骤操作：

[0085] 1.种子取出与清洗：用刀将采摘的新鲜、无霉烂卡里佐枳橙果实切开，取出果实中的种子，用自来水反复冲洗，直至完全去除种子上残存的果肉，并将不饱满、外种皮有裂口或被刀割伤的种子扔掉，只留下完整饱满的种子。

[0086] 2.种子消毒：用滤纸吸干柑橘种子表面的水分，完全浸没于1％的8‑羟基喹啉硫酸盐溶液约1分钟，取出阴干。

[0087] 3.种子保存：阴干的柑橘种子装入密封袋中密封，放入4℃环境中保存。

[0088] 4.无菌黄化苗培育：保存的种子剥除内、外种皮，用1％的次氯酸钠溶液浸泡10分钟，用无菌水清洗3次，播种在装有MS+蔗糖30g/L的固体培养基的试管中，每支试管播1颗种子，于27℃暗培养14天。

[0089] 二、不同保存时间种子的播种污染率

[0090] 按照上述方法，将新取出种子和在4℃中保存了90天，180天，270天和360天的种子分别播种培育无菌黄化苗，测定不同保存时间种子的出苗率和播种污染率。

[0091] 表4、不同保存时间种子出苗率和播种污染率

[0092]

[0093] 从表4可以看出：随着种子保存时间的增加，种子播种的黄化苗出苗率降低，污染率显著增加，保存180天的种子黄化苗污染率即达到13.5％，保存270天的种子黄化苗出苗率为95％，污染率高达20％；而本发明方法种子保存270天后播种培育无菌黄化苗的出苗率仍然高达100％，污染率也仅为2％；本发明方法保存360天的种子仍然有100％的出苗率，污染率也仅为5.5％。本发明方法显著优于本实施例方法。