[0001] 本公开涉及一种诊断测试，所述诊断测试用于因发生与糖尿病(DM)相关的PDAC的风险增加而选择的患者群组中的胰腺癌[即胰腺导管腺癌，‘PDAC’]或胰腺炎的早期检测。

[0002] 将正常细胞转化为癌细胞涉及通常若干基因的DNA序列中的连续体细胞和/或可遗传突变，导致细胞蛋白的功能变化，所述功能变化赋予自身未突变但有助于癌细胞的增殖优点的其它基因的增殖优点和表达水平(在mRNA和蛋白质水平)的变化。在生殖系(来自一个或两个亲本)中遗传的遗传突变也可能在个体中易于发展成癌症。然而，一般而言，癌症和尤其是胰腺导管腺癌(PDAC)在经典意义上主要不是‘遗传确定的’。

[0003] 胰腺具有复杂的解剖和细胞组合物，其包括将若干重要激素释放到血液中的内分泌细胞(如胰岛素、升糖素和生长抑素)和将脂肪酶和蛋白酶分泌到肠道中以帮助消化的外分泌细胞。外分泌胰腺被认为是PDAC的起源组织。PDAC通常具有模糊症状或被视为无症状的，直到晚期常常使得疾病在其诊断之前转移到其它器官。未治疗的转移性PDAC具有3‑5个月的中值存活率。局部晚期疾病的存活期为6‑10个月。然而，大部分病例在是晚期诊断的，对于潜在治愈性切除来说太晚。此外，化学疗法并非治愈性的，使得PDAC的死亡率接近发病率。

[0004] 在导致临床诊断的无症状期间，原发性肿瘤将潜在转移性的“种子”细胞释放到循环中。在肿瘤<1cm时进行切除的情况下，与肿瘤较大(与约5％相比75％)相比，五年存活率显著更好。如果可以在肿瘤小于1cm的同时对所有患者进行诊断，那么可以通过手术切除显著改善存活率。然而，目前不存在检测无症状PDAC的可靠手段。

[0005] PDAC的发病率增加，预计到2030年，其将超过乳腺癌，成为癌症相关死亡的第二主因。因为通常在晚期检测到PDAC，所以大部分PDAC患者并不符合潜在治愈性手术的条件，然而，在可能进行手术的情况下，总存活率已显示出显著改进。

[0006] 对公众进行PDAC筛查存在现实障碍。尽管疾病是癌症死亡的主因，但其相对罕见且发生率仅为0.014％。因此，筛查测试将必须极其具体且几乎接近100％，以便避免大量假阳性。然而，目前不存在此类筛查测试。CA19‑9是用于管理PDAC的常规临床用途中的唯一生物标记。然而，由于其低灵敏度和特异性，筛查测试中的假阳性率异常高，并且确认诊断的额外测试昂贵，使得筛查效率低并且成本高。

[0007] 所属领域中已知其它标记。US9863960公开了一种通过测量介白素‑1受体拮抗剂(IL‑1Ra)的存在而诊断胰腺癌的方法。WO2017109518公开了确定靶蛋白的蛋白质糖基化标记以确定受试者是否患有胰腺癌的方法。CA‑19‑9和CEA的超糖基化显示为与胰腺癌相关。此外，US20170003294和WO2015157557公开了用于检测例如胰腺癌或胰腺发炎病况的疾病的诊断测试，其包括确定是否存在多种生物标记。

[0008] 研究已显示，在PDAC诊断时，大部分PDAC患者患有糖尿病(DM)1、2。相比之下，患有3
肺、乳房、前列腺和结肠直肠癌的个体中DM的发病率不高于非癌症对照组。PDAC与DM之间的关系是复杂的。长期DM增加PDAC的风险，但仅增加大约两倍(大致等效于吸烟)。然而，流
4
行病学数据表明PDAC可以引起DM，新发病的DM是PDAC存在的早期预警标志。在大约50％的PDAC病例中，糖尿病是最近发作的(≤3年)，使得患有新发作DM的个体成为PDAC的最大高风
5
险组。新发作DM的诊断与PDAC的后续诊断之间的平均时间为13个月。

[0009] 虽然此表示对PDAC的较早检测来说是相当大的机会，但是存在挑战。DM在一般群体中的发病率上升，其中估计英国每年诊断出200,000例新的2型DM(T2DM)。在10％的新发作DM病例中，DM继发于胰腺疾病(PDAC、慢性胰腺炎和其它)，并且被称为3cDM型；然而，在大多数情况下，其被误诊为T2DM。

[0010] 本公开涉及一种用于在患有新发作糖尿病的个体中检测PDAC或胰腺炎的高度特异性测试的表征，其测量生物样本中脂联素和IL‑1Ra的水平以区分外分泌胰腺(3c型，包括PDAC和胰腺炎相关的DM)的糖尿病与T2DM，使得前者进入PDAC的筛查。

[0079] 材料和方法

[0080] 患者群组

[0081] 来自患有胰腺癌(手术前)的个体和健康受试者的血清和血浆样本获自利物浦大学GCP实验室设备生物库(University of Liverpool GCP Laboratory Facility Biobank)。在糖尿病诊所和初级保健中心转诊后，在皇家利物浦大学医院(Royal Liverpool University Hospital)收集来自糖尿病个体的血清和血浆样本。所有参与者均使用经批准的道德协议，在皇家利物浦大学医院提供了书面知情同意书(道德标识符：11/NW/0083和16/LO/1630)。

[0082] 样本组

[0083] 分析三个独立样本组。第一发现组(n＝60)由40个患有组织学上确认的PDAC的个体和20个健康对照个体组成。将患有PDAC的个体进一步细分为患有糖尿病阳性诊断的个体(12名患者，HbA1c≥48mmol/mol)和糖尿病阴性或无明确诊断的个体(28名患者，HbA1c<47mmol/mol或无数据)。为了确定患有2型糖尿病的个体中的候选标记的水平，分析第二独立的训练样本组(n＝135)。这包括80名患有组织学上确认的PDAC的个体(40名诊断患有糖尿病的个体和40名诊断患有阴性糖尿病的个体)、20名患有慢性胰腺炎的个体(10名诊断患有糖尿病的个体和10名诊断为阴性糖尿病的个体)、20名患有长期(诊断后>3年)2型糖尿病的个体和15名健康受试者。第三独立验证组(n＝175)用于评估患有新发作的2型糖尿病(诊断后<3年)的个体中候选标记的水平。验证组由78名患有组织学上确认的PDAC的个体(37名诊断患有糖尿病和41名诊断为阴性糖尿病)、39名患有慢性胰腺炎的个体(19名诊断患有糖尿病和20名诊断为阴性糖尿病)、20名患有长期(诊断后>3年)2型糖尿病的个体、18名患有新发作(诊断后≤3年)2型糖尿病的个体和20名健康受试者组成。

[0084] 患有PDAC的个体患有可切除的疾病，并以治愈为目的进行手术。

[0085] 样本收集

[0086] 在Sarstedt Monovette血清Z管或K+EDTA管(英国莱斯特莎斯特有限公司(Sarstedt Ltd,Leicester,UK))中收集血液，并且使其在室温下静置30分钟，随后在800×g下离心10min以用于血清分离，并且在16000x g下离心1分钟以用于血浆分离。将血清和血浆部分等分到冷冻管中并且在使用之前储存于‑80℃下。

[0087] 发现分析

[0088] 使用如先前所描述的样本的发现组；PDAC(n＝40)和健康对照(n＝20；总n＝60)进6、7
行用于相对和绝对定量(iTRAQ)的Luminex和基于质谱基的等压标签 。将由我们的iTRAQ数据产生的显著更改的蛋白质的列表上载到生物反应路径分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)软件(http://www.ingenuity.com)中。进行核心分析和生物标记过滤器两者以鉴别与代谢疾病途径和糖尿病相关的那些蛋白质。

[0089] 训练分析

[0090] 使用对135血清和血浆样本的免疫分析评估经由IPA产生的候选生物标记；PDAC(n＝40，患有糖尿病，n＝40，无糖尿病)、慢性胰腺炎(n＝10，患有糖尿病，n＝10，无糖尿病)、长期2型糖尿病(n＝20)和健康对照(n＝20)。

[0091] 验证分析

[0092] 使用对175血清和血浆样本的免疫分析评估从训练分析产生的最有前景的标记；PDAC(n＝37，患有糖尿病，n＝41，无糖尿病)、慢性胰腺炎(n＝19，患有糖尿病，n＝20，无糖尿病)、长期2型糖尿病(n＝20)、新发作的2型糖尿病(n＝18)和健康对照(n＝20)。

[0093] 生物标记测量和数据过滤

[0094] 使用市售Luminex(分别为生物‑Plex Pro糖尿病脂联素分析和生物‑Plex Pro人类细胞因子27‑Plex分析；生物‑Rad，英国)在生物‑Plex200系统(生物‑Rad，英国)上测量血清脂联素和血浆IL‑1Ra水平。所有样本遵循制造商的说明书重复测量两次，其中使用3个质量对照/组评估组间变化性。

[0095] 使用四或五参数逻辑回归模型，由阳性对照蛋白质的标准曲线测定生物标记浓度。小于或等于15％的组间偏差被视为可接受的；重复落在该范围之外的任何组。从数据集去除浓度落在线性范围外的定量生物标记和具有变异系数(CV)>20％的重复测量值的那些定量生物标记。

[0096] 血糖(HbA1c mmol/mol)通过皇家利物浦大学医院临床生物化学系(Royal Liverpool University Hospital Clinical Biochemistry Department)使用国际临床化学联合会(nternational Federation of Clinical Chemistry)批准的方法测量。

[0097] 统计分析

[0098] 使用JMP14版(美国北卡罗来纳州凯瑞SAS学会公司(SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA))和RStudio 1.1.463版(R,RStudio Inc.,波士顿，马塞诸塞州，美国；http://rstudio.com/的联合开发)。使用双尾Mann–Whitney U测试分析蛋白质表达数据，并使用逐步回归模型来选择最有前景的标记组合。通过ROC分析评估单独和以组合形式的每一候选标记(脂联素和IL‑1Ra)的诊断精确性。

[0099] 尿样收集

[0100] 从两个健康受试者获得尿样并且在含有及不含有蛋白酶抑制剂的情况下处理。将尿样进行以下稀释：(1:1)、(1:2)、(1:4)、(1:5)、(1:10)、(1:20)、(1:100)。从一个健康受试者和一个胰腺癌患者处获得血浆对照并且制备成(1:400)稀释液。使用生物‑Plex Pro人类糖尿病脂联素分析(生物‑Rad,#171A7003M)测量脂联素水平。

[0101] 使用生物‑Plex管理器软件处理数据。将脂联素浓度取平均值并且计算出的<15％的变异系数(CV)值对于标准品和样本视为可接受的。具有CV>15％的数据点被标记为离群值，因此产生用于进一步分析的8点校准曲线。

[0102] 还使用血浆对照的脂联素浓度进行质量控制检查，其中CV值<15％被认为是可接受的。

[0103] 表1：用于检测尿液中的IL‑1Ra的市售试剂盒

[0104]

[0105] 实例1

[0106] 将由PDAC引起的新发作的DM与T2DM区分开将允许更早诊断PDAC。

[0107] DM在一般群体中的发病率上升，其中估计英国每年诊断出200,000例新的2型DM(T2DM)。在10％的新发作DM病例中，DM继发于胰腺疾病(PDAC、慢性胰腺炎和其它)，并且被8
称为3cDM型(T3cDM)；然而，在大多数情况下，其被误诊为T2DM(图1)。PDAC相关DM占误诊新发作的T3cDM(等于T2DM的新诊断的0.8‑1％)的病例的8‑10％。

[0108] 使用当前筛查模式，鉴别具有潜在PDAC相关DM的0.8‑1％的患有新发作的糖尿病的个体是不可行的。将T3cDM与T2DM区分开将鉴别富含PDAC的群体，使得筛查此亚群是可行的。如果建立将结合其它临床特征辅助鉴别这些高风险个体的诊断生物标记，那么将有利于筛查。

[0109] 为了改进PDAC的早期诊断，我们广泛分析了用于检测和开发蛋白质生物标6、7、9‑15
记 的血清和血浆。使用等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ)结合液相色谱‑串联质谱法(LC‑MS/MS)和免疫分析(Luminex，基于规则的药物、ELISA和蛋白质印迹法)，我们执行了全面的发现程序。

[0110] 使用来自利物浦的>500个诊断和对照样本，我们的发现工作已经在PDAC中鉴别了379种差异调节的血清蛋白质。生物反应路径分析(IPA)选择与代谢疾病路径和糖尿病相关联的那些差异表达的蛋白质。这些样本的子集的分析(其中DM状态为已知的)使得我们能够观察胰腺癌(无关于DM状态)与健康对照之间的差异。使用独立血清和血浆训练和验证组的
19种候选生物标记的后续分析突出显示脂联素和介白素‑1受体拮抗剂IL‑1Ra)作为用于检测T3cDM(包括PDAC‑DM)的新颖组的重要潜在组分。

[0111] 低循环脂联素(<4μg/mL)与T2DM16相关。然而，我们观察到，与独立发现、训练和验证样本组(图2)中的健康对照(无关于DM状态)相比，在PDAC患者中观察到此脂肪素的血清水平显著升高。在我们的训练组中，对于PDAC和DM个体(n＝89)，与长期DM对照(分别为p＝0.001和p＝0.0004；图2B)相比，显示糖尿病和非糖尿病PDAC患者两者中的脂联素升高。脂联素水平在慢性胰腺炎患者与PDAC患者之间是类似的且不受黄疸影响(数据未示出)，这是
12
重要的考虑因素，因为我们先前已经证明升高胆红素对血液 中的某些蛋白质的所测量水平的影响。

[0112] 独立组中的验证(n＝175)证实相比于患有T2DM的那些个体，在患有PDAC的个体中存在显著较高水平的脂联素。无关于DM的持续时间(长期和新发作的T2DM；图2C)，都观察到血清脂联素中升高。还发现与T2DM对照(n＝39，数据未示出)相比，在糖尿病(n＝19)和非糖尿病(n＝20)慢性胰腺炎(CP)患者中也发现脂联素升高。

[0113] 在新诊断DM的个体中，在诊断时脂联素水平显著降低17个更高水平的脂联素可以突出显示PDAC的存在。此外，脂联素的较低循环水平为T2DM的预测值，并且逐渐表明脂联素18
测量将提供对即将发生的糖尿病 的更早鉴别的手段。随着脂联素在DM诊断中的作用的认识增加，产生了检测PDAC相关的DM的机会。

[0114] 我们的数据表明，应检测患有DM但具有正常至高脂联素的临床指标的个体的胰腺癌。

[0115] 介白素‑1受体拮抗剂(IL‑1Ra)降低促炎性细胞因子的IL‑1家族的内源活性，保护19
β细胞免于高葡萄糖暴露的破坏性影响，并且尽管IL‑1Ra的β细胞表达在患有T2DM 的患者中降低，血液水平提高。我们发现，在基于Luminex的发现程序中，与血清和血浆中的健康对
20
照相比，IL‑1Ra表达不受黄疸影响并且PDAC升高(p<0.05，数据未示出 )。在独立训练和验证组中的血浆中证实了这种观察，与T2DM(分别为p<0.006和<0.03；图3A和B)和新发作的T2DM(p<0.0001；图3B)相比，PDAC和PDAC‑DM两者中的水平均显著升高。我们的数据支持使用循环IL‑1Ra作为在新诊断患有DM的高风险个体中更早检测PDAC的有价值的标记。

[0116] 尽管发现脂联素和IL‑1Ra的血液水平在PDAC和CP(未示出)中升高，而不考虑DM状态，但其在鉴别患有T2DM个体中的T3cDM(PDAC相关和CP相关)的潜在作用被突出显示，其中在两个组之间观测到的中值生物标记水平的显著分离(p<0.0001；图4A和B)。

[0117] 与T2DM对照相比，PDAC和慢性胰腺炎(CP)中脂联素和IL‑1Ra两者的表达增加与DM状态无关，表明3c型特异性效应(图4)。此外，脂联素与IL‑Ra的组合在区分T3cDM(PDAC相关和CP相关)与T2DM(AUC 0.90，图5A)方面表现出良好性能，灵敏度/特异性为73.7％/83.7％。更确切地说，在将T3cDM与患有新发作的T2DM的个体区分开时，脂联素与IL‑1Ra的组合实现了0.91的AUC，灵敏度和特异性为83.7％(图5B)。

[0118] 我们的测试针对的是估计每年在英国新诊断出患有T2DM的20万名个体。我们的标记使得我们能够区分由常见T2DM引起的新发作的DM与由T3cDM引起的新发作的DM。鉴别患有T3cDM(包括PDAC和CP两者)的个体将选择极大地富含PDAC的亚群(图6)。反过来，鉴别患有PDAC诊断的最高风险的那些人将使使用现有模态(EUS、CT/MRI扫描、生物化学组)的(此亚群的)未来筛查是可行的(图6)。我们的测试还将选择患有CP的患者。

[0119] 实例2

[0120] 使用Luminex分析(表2)在尿液中成功地检测到了脂联素，其中浓度可根据所产生的校准曲线测量(图7和图8)。尿液的最优稀释为(1:1)和(1:2)，因为这些样本位于标准曲线的线性区段之间。对于使用和不使用蛋白酶抑制剂处理的尿液，观察到脂联素浓度存在极小差异。可在尿液中测量脂联素水平。因此，尿液适合于测量脂联素和IL‑1RA。

[0121] 表2：表格显示在含有和不含有蛋白酶抑制剂的情况下患者尿液样本中的平均脂联素浓度以及其对应CV值。

[0122]

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