发明领域 本发明总体上涉及基因表达疫苗。更具体地，本发明涉及可鼻内或经 口施用的基因表达疫苗。 发明背景 呼吸道合胞病毒(RSV)是造成婴儿和儿童下呼吸道病毒性感染最常见 的原因，全球每年约感染4百万儿童并导致约100,000人入院治疗，且仅 在美国就导致4,500例死亡。RSV感染与儿童的支气管炎、支气管阻塞和 哮喘加重的复发事件有关。RSV感染诱发的支气管炎的发病率一直在升 高。目前尚无抗RSV感染的有效预防措施。先前尝试研发的福尔马林灭活 的RSV疫苗不仅无效，而且当随后发生RSV感染时还可使疾病加重。 (Chanock等，由呼吸道合胞病毒引起的严重呼吸道疾病：改进的治疗和免 疫的前景，儿科学(Pediatrics)，1992；90：137-43)。此外，对RSV治疗 的研发由于其潜伏期短而受到限制。因此，研发RSV疫苗已在全球范围内 具有高度的重要性。 大多数RSV抗原在人和小鼠中具有免疫原性，但F和G抗原产生大 多数的抗RSV中和抗体。(Connors等，呼吸道合胞病毒(RSV)的F、G、 M2(22K)和N蛋白均诱导产生对RSV攻击的抗性，但M2和N蛋白诱 导的抗性存在时间相对较短，病毒学杂志(J Virol)，65.1634，1991；Wyatt 等，通过重组的复制缺陷型痘苗病毒MVA对呼吸道合胞病毒的初次和加 强免疫，疫苗(Vaccine)18：392，1999)。人类CTL库的分析表明N、 SH、F、M、M2和NS2蛋白为强的靶抗原。类似地，在BALB/c小鼠中， F、N且特别是M2蛋白显示为CTL活性的主要靶抗原。(Domachowske等， 呼吸道合胞病毒感染：免疫反应、免疫病理和治疗，临床微生物学综述(Clin Microbiol Rev)12：298，1999)。病毒特异的细胞毒T淋巴细胞在清除RSV 感染中起到主要作用。血清和粘膜抗体以及MHC I类限制的细胞毒T淋 巴细胞(CTLs)均介导抗RSV感染的保护。(Brandenburg等，RSV下呼吸 道感染的发病机理：对疫苗研发的启示，疫苗(Vaccine)19：2769，2001)。 先前，被动施用中和血清抗体显示可在动物模型和人中降低RSV疾病的危 险。(Groothuis等，静脉应用γ球蛋白被动免疫对呼吸道合胞病毒高危的 儿童：安全性和药物动力学。RSVIG研究组，抗微生物剂的化学治疗 (Antimicrob Agents Chemother)。1991年7月；35(7)：1469-73；Hemming 等，在预防和治疗呼吸道合胞病毒感染中的超免疫球蛋白，临床微生物述 评(Clin Microbiol Rev.)，1995年1月；8(1)：22-33.综述)。 至今为止所研究的疫苗研究包括由RSV的F、G和/或M2蛋白组成 的亚单位、肽或DNA疫苗。肌内注射编码RSV的F或G蛋白的pDNA 在小鼠中有效(Li等，通过DNA免疫保护免受呼吸道合胞病毒感染，实验 医学杂志(J Exp Med)1998年8月17日；188(4)：681-8；Li等，编码呼 吸道合胞病毒G蛋白的质粒DNA为有希望的侯选疫苗，病毒学(Virology)。 2000年3月30日；269(1)：54-65)。在棉鼠模型中，F-G疫苗诱导的中和 抗体滴度与活RSV相比低1-2个数量级。(Prince等，重组嵌合呼吸道合胞 病毒FG糖蛋白疫苗在棉鼠中的功效和安全性研究，病毒学杂志(J Virol)。 2000年11月；74(22)：10287-92)。应用可体内表达引起保护性细胞和体液 免疫反应的抗原的质粒DNA(pDNA)进行免疫，宣称该pDNA与其他疫 苗相比具有多种优势。但是，每单位体重应用的DNA量以及选择的施用 途径使这些疫苗并不适于人类应用。(Guy等，用于流感片段疫苗的阳离子 脂类佐剂的设计、特征和临床前功效，疫苗(Vaccine)19：1794，2001)。 目前，对于患RSV感染的高危婴儿的一个可获得的选择是，以一个月 的间隔被动免疫人源化的抗RSV-F抗原的抗体。尽管不方便、昂贵且部分 有效，但由于没有安全有效的抗RSV疫苗，被动免疫通常被认为是唯一的 选择。 因此，仍然需要能够产生抗RSV的粘膜免疫的DNA疫苗。由于2到 6个月的婴儿最容易感染RSV且疫苗接种优选地在一个月龄的婴儿进行， 且由于认为粘膜疫苗更适于在这些局部和全身免疫系统还不成熟的婴儿中 产生局部免疫，因此粘膜RSV疫苗成为优选。 发明概述 本发明提供了基因表达疫苗(GXV)，所述疫苗包含以脱乙酰壳多糖 纳球形式存在的编码相应RSV抗原的质粒DNA的混合物。在第一个实施 方案中，混合物包含的组合含有F、G以及含有M、M2、SH、NS1、NS2、 N和P RSV抗原中的至少一个。在一备选实施方案中，混合物为包含M2 和包含F、G、M、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原中至少一个的组合。 在另一备选实施方案中，混合物包含的组合含有F、G、M2和含有M、SH、 NS1、NS2、N、P RSV抗原中的至少一个。GXV抗RSV安全且有效，可 显著减轻RSV感染诱发的肺部炎症，且可鼻内或经口施用。不被理论所束 缚，且GXV有效性的确切细胞和分子机制仍有待研究，但认为途径、免 疫原性抗原的组合和/或与脱乙酰壳多糖的结合可能对其有效性起到作 用。 因此，在第一实施方案中，本发明涉及抗RSV感染的预防性粘膜疫苗。 在进一步的实施方案中，应用RSV基因表达文库研发疫苗，所述疫苗 以脱乙酰壳多糖纳球形式制剂以通过经鼻或经口途径进行递送。 在进一步的实施方案中，疫苗的施用并不诱发呼吸道的高反应性。 在进一步的实施方案中，提供的基因表达疫苗具有两种不同的组分： 赋予疫苗能力的pDNA混合物以及赋予佐剂活性的脱乙酰壳多糖。 在进一步的实施方案中，基因表达疫苗提供的诱导免疫与活病毒感染 所产生的免疫相当。 在进一步的实施方案中疫苗以约25μg的混合物/小鼠的单剂提供时 是有效的。 在进一步的实施方案中疫苗诱导产生对多抗原，且优选地为对9种抗 原的抗体。 在进一步的实施方案中，公开了制备GXV疫苗的方法，其中将除外L 抗原的所有RSV抗原的cDNA克隆到pVAX质粒中，且混合物与脱乙酰 壳多糖团聚以制剂成纳球。 在进一步的实施方案中，疫苗诱导特异IgG滴度、鼻的IgA滴度增加， 并提高IFN-γ在肺以及脾组织中的产量。 本领域内的技术人员从随后描述的了解中将会明晓其他的对象和优 点，所述描述参照以下说明性图表进行。 附图简述 图1(A-B)：图1A显示鼻内免疫GXV后RSV cDNA的表达；泳道Bp 为分子量标记，标为NS1、NS2、M、SH、F、M2、N、G和P的泳道指 与RSV cDNA对应的PCR产物。图1B显示鼻内免疫GXV后RSV cDNA 的表达；免疫印迹分析：泳道Kd为分子量标记；1泳道和2泳道为经和未 经RSV感染的HEp-2细胞的提取物。 图2(A-C)：图2A显示由鼻内施用PBS、裸DNA和GXV的小鼠肺中 所来源的RSV的空斑形成单位。图2B显示鼻内施用PBS、裸DNA和GXV 的小鼠肺中所来源的RSV的抗原载量，所述抗原载量通过ELISA检测。 图2C显示鼻内施用PBS、裸DNA和GXV的小鼠对乙酰甲基胆碱的反应 性，所述反应通过全身体积描记器检测。乙酰甲基胆碱反应性测量表示为 基线暂停增加(enhanced pause)百分比(Penh)。 图3(A-C)：图3A显示GXV免疫后抗RSV抗体反应。BALB/c小鼠 鼻内施用GXV疫苗(25μg)、裸DNA(25μg)或PBS。免疫后14和21天从 小鼠中收集血清，并通过ELISA测定抗RSV抗体。图3B显示免疫后RSV 中和抗体滴度的测定。RSV悬液与多种血清稀释度(0.01、0.1和1)孵育并 进行中和。图3C显示免疫后鼻洗液的IgA抗体反应。免疫14和21天后 从动物中收集鼻洗液(i.n)，并通过ELISA测定总IgA抗体水平。 图4(A-B)：图4A显示GXV免疫所诱导的RSV特异的CTL的表征。 用25μg GXV、25μg裸DNA或PBS免疫小鼠。三周后用RSV持续感染 的纤维母细胞系BCH4刺激免疫脾细胞。用未感染的BC细胞和RSV-感 染的BCH4纤维母细胞作为靶标以标准的4小时51Cr释放试验测定测定 CTL活性。图4B显示在BAL液中测定的IFN-γ水平。如上描述所免疫 的多组鼠在第16天用RSV感染。在第21天对这些鼠进行BAL，并通过 ELISA测定IFN-γ水平。图4C测定脾细胞培养物中IFN-γ水平。如上免 疫的多组小鼠在第16天感染RSV。在第21天处死小鼠并将其脾细胞体外 培养在抗CD3抗体包被的平板内，通过ELISA测定培养上清中IFN-γ的 水平。 图5：图5显示小鼠如前描述进行免疫，并在第16天感染RSV。四天 后，处死这些小鼠，移出肺，并用苏木素和伊红(HE)对组织切片进行染色。 GXV免疫的小鼠与对照相比显示出较少的上皮损伤和细胞浸润。 图6(A-B)：图6A显示鼻内免疫RGCN后RSV cDNA的表达。BALB/c 小鼠鼻内施用克隆在质粒载体pVAX内的RSV抗原(GXV)。每只小鼠吸 入总量为25μg的混合体DNA。三天后完成最后鼻内施用后处死动物并从 肺的总RNA中进行RT-PCR。七种RSV mRNA的表达得以显示。图6B 显示单独的GXV并不诱导呼吸道的高反应性。BALB/c小鼠经口施用 RGCN疫苗，并在三天后应用全身体积描记器测量呼吸道高反应性。接受 GXV的动物与接受裸DNA或仅接受PBS(对照)的动物相比呈现出对乙 酰甲基胆碱攻击类似的反应。 图7(A-B)：图7A显示gRGCN免疫后的抗RSV抗体反应。BALB/c 小鼠经口施用GXV(25μg)、仅施用裸DNA(25μg)或PBS。免疫后第14 和21天收集动物的血清，并通过ELISA测定抗RSV抗体滴度。与对照相 比，以RGCN疫苗免疫的动物呈现出显著增高的抗体滴度。图7B显示 RGCN免疫后的IgA抗体反应。BALB/c小鼠经口或鼻内施用RGCN疫苗 (25μg)、仅施用裸DNA(25μg)或PBS。免疫后第14和21天收集动物的 粪便块(经口施用)和鼻洗液(鼻内施用)，并通过ELISA测定总IgA抗体滴 度。 图8(A-B)：图8A经口和鼻内免疫小鼠的脾内IFN-γ的表达。接受经 口和鼻内RGCN免疫的小鼠在第16天感染RSV。在第21天，处死动物 并在体外培养动物的脾脏或进行BAL。α-CD3刺激的脾细胞的表达；经 口免疫的动物比鼻内组产生更多的IFN-γ。图8B显示经口和鼻内免疫小 鼠的BAL液中IFN-γ的表达。与经口免疫组相比，鼻内免疫的小鼠在其 BAL液中产生更多的IFN-γ。 图9：图9显示经口的GXV减轻鼠肺中的肺部炎症。BALB/c小鼠经 口施用GXV或裸DNA(共25μg)。动物在第16天后感染RSV并在4 天后(第21天)处死。移出肺并用苏木素和伊红(HE)染色组织切片。显 示了代表性的显微图片。与对照组相比，接受GXV的小鼠出现上皮细胞 损伤减轻和间质空间增厚。 详细描述 在pVAX质粒中构建RSV基因表达文库，且文库与脱乙酰壳多糖团 聚以制剂成纳球，此处称为RGCN疫苗。 本发明提供了这样的基因表达疫苗(GXV)，所述疫苗包含编码相应 RSV抗原的质粒DNA的混合物。该混合物包含F、G、M、M2、SH、NS1、 NS2、N和P RSV抗原的组合。该混合物可包含含有F、G和至少一种M、 M2、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的组合。备选地，该混合物可包 含含有M2和至少一种F、G、M、SH、NS1、NS2、N和P RSV抗原的 组合。另外，备选地，该混合物可包含含有F、G、M2和至少一种M、SH、 NS1、NS2、N和P RSV抗原的组合。GXV与脱乙酰壳多糖制剂成纳球形 式，可生物降解，对人类友好，且阳离子聚合物可增加疫苗的粘膜吸附而 无任何的副作用。 脱乙酰壳多糖由于其可保护基质中的DNA免受血清核酸酶降解，使 DNA的生物利用度提高，且因此具有成为粘膜基因递送体系的巨大潜力。 脱乙酰壳多糖也具有多种有益的功效，包括抗凝活性，伤口愈合特性，免 疫刺激活性，且能够调节粘膜和支气管相关淋巴样组织的免疫性。与裸 DNA对照相比，脱乙酰壳多糖纳球形式的GXV显著诱导中和IgG抗体滴 度，以及鼻IgA滴度和IFN-γ水平。脱乙酰壳多糖提高了GXV的免疫能 力。但是，脱乙酰壳多糖增强抗病毒免疫性的详细机制仍不清楚。需要指 出的是，除了非常有效外，GXV还安全，这可通过下述实验进行证明，即 与未免疫的感染组相比伴随于免疫组的总体肺炎症显著减轻且在免疫小鼠 和未免疫小鼠之间不存在对乙酰甲基胆碱反应性的改变。考虑到先前可加 重疾病的不成功的福尔马林灭活疫苗，该结果尤其令人鼓舞。 研究了疫苗引起的体液和细胞免疫。与裸DNA免疫和未免疫对照组 相比GXV可显著提高中和血清和粘膜IgA抗体的水平。尽管分泌型IgA 抗体提供的保护是免受通过粘膜途径进入的病原感染，但分泌型IgA在抗 RSV中的作用仍所知甚少。并不希望被理论所束缚，可推测由于RSV是 影响上下呼吸道的专性胞内粘膜病原，粘膜IgA可能通过阻止RSV进入 粘膜和/或通过抑制其细胞-细胞间合胞体的传播而避免罹患重症RSV疾 病。 与裸DNA和未免疫对照相比，GXV产生明显较强的CTL反应。这 些结果与其他实验性疫苗的结果一致，明确支持疫苗诱导的CTL在病毒清 除中的作用。一些研究表明，CTL抗细胞病变性病毒的保护性效果依赖于 其细胞因子如IFN-γ的产生。免疫后GXV显著促进可用于抗RSV感染的 IFN-γ的产生。IFN-γ具有直接的抗病毒作用，且在刺激天然杀伤(NK) 细胞和CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)的溶细胞活性中特别重要，前述细 胞在鼠模型和人类的控制RSV感染中起到关键作用。 除了GXV的免疫调节活性，由GXV诱导炎症的可能性通过对肺切片 的免疫组织学分析进行评估。上皮损伤以及血管周、支气管周和间质浸润 细胞的半定量分析表明，与裸DNA和未免疫小鼠相比GXV使细胞浸润和 上皮损伤显著减轻。在裸DNA和GXV间观察到的显著差异的原因仍然未 知。不希望被理论所束缚，认为与裸DNA相比，GXV作为粘膜系统的天 然组份，可能其侵染性较低。也可能由于上皮细胞对裸DNA摄入的减少 而导致裸DNA在上皮粘膜下层的积聚加剧了炎症反应。 总之，我们的数据证明，GXV代表了抗RSV感染的新型疫苗设计， 仅1mg/kg体重的单剂就能够在初次感染时将病毒滴度降低两个数量级 (100倍)。该疫苗有效性的免疫机制包括诱导产生高水平的血清IgG和 粘膜IgA抗体，产生有效的CTL反应，以及提高肺脏特异的具有抗病毒 作用的IFN-γ的产生。由于单剂的GXV疫苗非常有效，因此认为提高剂 量以及初次免疫-加强免疫的策略可进一步提高疫苗的效果。此外，GXV 显著减轻肺部炎症且并不改变呼吸道高反应性，这使得该疫苗是安全的。 材料和方法 动物 六周龄雌性BALB/c小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)并在 动物中心以无病原条件饲养。所有操作经University of South Florida和 James A Haley VA Medical Center Committee on Animal Research进行审 查并批准。 基因构建体，脱乙酰壳多糖纳球的产生和基因转移 RSV cDNA从RSV感染的小鼠肺cDNA文库中扩增，所述扩增通过 聚合酶链反应(PCR)应用Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA) 实现，并将其克隆到哺乳表达载体pVAX(Invitrogen，San Diego，CA)中。 产生的质粒在大肠杆菌DH5α细胞中增殖。应用Qiagen试剂盒(Qiagen， Chatsworth，CA)根据生产商的说明书进行大规模质粒DNA的制备。该方 法产生足够纯度的具有最少内毒素污染物的DNA。混合pDNA以产生RSV cDNA的混合物。DNA脱乙酰壳多糖纳球的产生如由以下所描述：Roy，K.， 等1999，用脱乙酰壳多糖-DNA纳球经口递送基因在花生过敏的鼠模型中 产生免疫保护，自然医药(Nat Med)5：387。在鼻内免疫的情况下，小鼠 在轻度麻醉条件下用DNA混合物脱乙酰壳多糖纳球鼻内接种三次。每只 小鼠接受在脱乙酰壳多糖纳球中复合的总量为25μg的DNA。对照小鼠接 受PBS和裸DNA。 疫苗施用 小鼠在轻度麻醉下鼻内(i.n.)施用GXV(25μg的总DNA/小鼠)。对照 小鼠接种PBS或等量的裸DNA。免疫后第16天，小鼠鼻内感染1×106pfu 的体积为50μl的人RSV A2株(ATCC，Rockville，MD)。感染后(p.i)第5 天，处死小鼠，并在无菌条件下取出鼠的肺脏和脾脏进行RT-PCR、组织 病理研究、细胞因子和病毒空斑分析。免疫后第14和21天取小鼠血以获 得血清。 动物的病毒感染以及组织、血清的收集 最后一次免疫后第16天，小鼠鼻内感染1×106pfu的体积为50μl的 人RSV A2株(ATCC，Rockville，MD)。感染后(p.i.)第5天，处死小鼠并无 菌取出肺脏和脾脏进行RT-PCR、组织病理研究、细胞因子和病毒空斑分 析。末次免疫后第14和21天收集鼠血清。 RSV滴度和肺脏中抗原的定量 为定量小鼠肺中的RSV滴度，首先取出整个肺脏称重，然后立即放入 含10％FBS的EMEM培养基中。将肺匀浆化，之后于4℃10,000转/分钟 离心10分钟。收集清澈的上清并通过0.45μm的甲基纤维素滤器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)。样本系列稀释用于空斑试验。生长在24孔中盖 玻片上的Hep-2细胞(60-70％汇片)用不同稀释度的肺匀浆覆盖并1,000转/ 分钟离心1小时。这可使病毒快速吸附入细胞。将细胞在CO2培养箱中37 ℃孵育24小时。孵育过后，吸出组织培养基并用PBS洗涤两次。用冰冷 的无水乙醇固定细胞，干燥，然后在湿盒中与FITC-标记的抗-RSV多克隆 抗体(Light Diagnostics，Tennecula，CA)孵育30分钟。用洗涤缓冲液(PBST PBS+0.05％吐温-20，pH 7.4)洗涤细胞两次并应用fluoromount G (Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)将盖玻片放置在载 玻片上。在荧光显微镜下计数RSV空斑。 RNA提取和RT-PCR分析 根据生产商的使用说明应用TRIZOL试剂(Life Technologies， Gaithersburg，MD)从肺组织中分离总细胞RNA。向50-100mg的肺组织加 入1ml的Trizol试剂并磨成匀浆。通过吹打将肺匀浆悬浮并置室温5分钟 进行裂解。每管加入氯仿(200μl)并彻底混合。5分钟后，于15-20℃以12,000 转/分钟离心15分钟沉淀细胞。将清澈的液体上清转移到新管并加入等体 积的异丙醇，充分混合，并在15-20℃以12,000转/分钟离心15分钟。用 70％的乙醇洗涤RNA沉淀，空气干燥并溶解在经焦碳酸二乙酯处理的水 中。对不同的RSV基因进行RT-PCR，如以下所描述的：Behera，A.K.等， 2001，阻断人上皮细胞细胞间的粘附分子1降低呼吸道合胞病毒感染， Biochem Biophys Res Comm 280：188。 肺功能 为评估免疫组和对照组的肺功能，用GXV免疫小鼠。三天后，用全 身体积描记器(Buxco Electronics，Troy，NY)非侵入性评价清醒、自由小鼠 的呼吸道反应性(即支气管狭窄)，按以下所描述的进行：Matsuo K.等， 2000，变态反应原致敏的小鼠中复发性呼吸道合胞病毒感染导致持续的呼 吸道感染和高反应性，J.Immunol 164：6583。用此系统，在正常呼吸周期中 发生的体积改变被记录为含动物的盒和呼吸参照盒间的压力差异。产生的 信号用于计算呼吸频率、分钟体积、潮气量和暂停增加(Penh)。Penh用于 测量支气管收缩，且由以下的公式计算：Penh＝暂停(pause)×(呼气压 的峰值/吸气压的峰值)，其中暂停为呼出至少30％潮气量所需时间与呼气 总时间的比值。将小鼠放置在体积描记器内并将容器平衡10分钟。小鼠暴 露于雾化的PBS(以建立基线)，之后暴露于逐渐加大剂量(6、12.5、25和 50mg/ml)的乙酰甲基胆碱(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)中。每一剂量 的乙酰甲基胆碱雾化5分钟，之后记录5分钟的呼吸测量值。测量期间， 每一变量的平均值来自每30次呼吸(或30秒种，不管哪一个首先发生)。 每一剂量后的最高Penh值用于测量支气管收缩的程度。 支气管肺泡灌洗(BAL)、脾细胞培养和IFN-γ试验 对免疫和对照小鼠进行支气管肺泡灌洗。感染后第5天过量注射 ((0.6g/kg)i.p)戊巴比妥(Nembutal(Abbot Laboratories，North Chicago， IL))处死小鼠，并打开胸腔。用2到3ml的冰冷盐水冲洗肺血管床。暴露 气管并插入与结核菌素注射器连接的26G针。然后用0.5ml的PBS灌洗 肺三次并收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。回收的BAL液的体积在灌注的 PBS液的75到85％之间。对照和实验组回收的BAL液的体积不存在统计 学意义上的显著差异。离心BAL后收集上清并保存于-70℃，以用于测试 细胞因子。 用于脾细胞培养时，从BALB/c小鼠的脾脏制备单细胞悬液，并在包 被以抗-CD3 Abs(1μg/ml；克隆17A2，PharMingen，San Diego，CA)的孔内 培养。应用ELISA试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)从BALF和 24-h培养上清中测试IFN-γ。 总IgA抗体试验 从鼻洗液中收集IgA抗体，按如下所述进行：Matsuo K，等2000，流 感疫苗与佐剂(霍乱毒素)联合经鼻施用诱导天然免疫，疫苗(Vaccine)， 18：2713。将注射针插入鼻咽部较晚的开口，并将总量为1ml的含0.1％牛 血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)注入开口三次；收集流出液作为鼻 洗液。离心鼻洗液以移除细胞残渣并用于Ab试验。进行总IgA抗体测试 时，将ELISA平板用200ng/孔的抗小鼠IgA抗体(02271D，Pharmingen， San Diego，CA)4℃过夜包被。洗涤三次后，加入样本并于室温孵育2小时。 再次洗涤后，加入生物素标记的抗小鼠IgA(556978，Pharmingen，San Diego，CA)抗体并将平板继续孵育2小时。三次洗涤后，加入抗生物素蛋 白过氧化物酶共轭物(1∶10,000，Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，并将平 板继续孵育1小时。加入底物四甲基联苯胺(Phariningen，San Diego，CA) 显色后，应用自动-ELISA读数仪在450nm处读取吸光度。 抗-RSV抗体试验 为定量抗RSV抗体的滴度，用纯化的RSV(200ng/孔)4℃过夜包被 ELISA平板。洗涤平板并用封闭缓冲液(含1％BSA的PBS，pH 7.4)于37 ℃封闭1小时。将样本加到平板并于37℃孵育2小时。再次洗涤平板并加 入1∶10,000稀释的抗小鼠IgG过氧化物酶共轭物(Boehringer Manheim， Germany)，并孵育1小时。三次洗涤后，加入底物，且进行20-30分钟的 显色。应用自动-ELISA读数仪在450nm处读取吸光度。 病毒中和试验 在第14天获得的不同稀释度的血清与100μl的RSV接种物混合，并 于37℃孵育1小时。混合物用于感染在48孔培养板培养的HEp-2培养物。 测定RSV滴度。 免疫印迹 将30微克的经RSV感染的HEp-2细胞的提取物在4-20％梯度的 SDS-PAGE进行分级，并转移到硝酸纤维素膜上。用封闭缓冲液(含5％w/v 脱脂奶粉的TBS-0.1％吐温20，pH 7.6)封闭膜并与从不同免疫组小鼠收集 的1∶250稀释度的血清于4℃过夜孵育。在洗涤缓冲液(TBS-0.1％吐温-20， pH 7.6)中洗涤膜四次并与抗小鼠IgG过氧化物酶共轭物于室温孵育1小 时。继续洗涤四次后，加入ECL化学发光检测试剂(0.125ml/cm2)进行印迹 染色，前述操作根据生产商的使用说明(Amersham Life Sciences，Arlington Heights，IL)进行。 组织学观察及呼吸道感染评分 气管内注射PBS后注射10％中性缓冲福尔马林溶液(Sigma Chemicals， St.Louis，MO)使肺脏膨胀，以将肺部结构保存于膨胀状态。肺脏转移到 80％乙醇溶液1小时，然后包埋在石蜡中。用苏木素和伊红对切片染色。 对肺切片中的炎性细胞进行半定量评估，所述肺切片包括肺泡间质、支气 管肺泡束和间质组织。通过形态学评估炎性浸润的部位、厚度和细胞成分。 CTL研究 在完全RPMI中孵育PBS、GXV和裸DNA免疫的小鼠脾细胞(2.5×106 细胞/mL)，所述完全RPMI含10U/mL的IL-2和2.5×106细胞/mL的RSV 持续感染的经丝裂霉素(Sigma，St Louis，MO)处理的纤维母细胞(BCH4 细胞)。在第6天向51Cr-标记的RSV-持续感染(BCH4)或未感染(BC)靶细 胞(1×104)的同源纤维母细胞中加入不同数量的效应细胞测试培养物的抗原 特异性裂解。37℃孵育5小时后，收获细胞上清，在γ计数器中测定51Cr。 特异裂解百分数按以下计算：[(实验cpm-自发cpm)/(总cpm-自发cpm)]× 100。靶细胞仅与培养基孵育或在加入2.5％Triton X-100孵育后测定的值 分别为自发释放和总释放。 结果 粘膜GXV免疫安全且有效 为测定鼻内施用质粒混合物后RSV抗原在肺脏中的表达，通过 RT-PCR在mRNA水平测定所有cDNA的表达。9个质粒中的7个可测出 mRNA的表达，包括NS1、NS2、M、SH、F、M2和N。所有mRNA均 为预期大小。不同mRNA间的表达存在数量差异。这些结果表明鼻内施用 质粒可容易地在肺细胞中表达编码抗原。 RSV疫苗的最主要的担心是炎症增强。为测试鼻内施用GXV疫苗是 否可引起呼吸道高反应性，在三组动物中测定基线暂停增加百分比(Penh)， 三组动物包括PBS对照、裸质粒混合物免疫动物或GXV疫苗免疫动物。 与接受裸DNA或仅接受PBS(对照)的动物相比，接受GXV疫苗的动物 对乙酰甲基胆碱攻击呈现出类似的反应。这些结果提示GXV疫苗并不引 起呼吸道高反应性。 为检测疫苗的效果，BALB/c小鼠鼻内施用GXV疫苗或裸DNA。动 物在第16天感染RSV且在4天后(第21天)处死。移出肺脏并将肺脏的 匀浆用于RSV空斑试验。与PBS对照和裸DNA混合物相比，GXV疫苗 免疫小鼠的RSV滴度显著降低(2到3倍)。肺脏病毒滴度的降低被认为 是评判疫苗有效性的金标准。这些结果表明脱乙酰壳多糖提高了pDNA疫 苗的功效且GXV为抗RSV感染提供了有效疫苗。 GXV降低了RSV感染诱发的肺部炎症 在接受GXV疫苗及裸质粒DNA混合物的小鼠组中检测肺部炎症，并 与用生理盐水处理的对照小鼠进行比较。与裸质粒免疫组和对照相比，接 受GXV疫苗的小鼠组上皮损伤较轻，间质和支气管血管周区的单核细胞 (MNC)和多形核白细胞(PMNC)浸润减少。PBS组与正常未感染小鼠的肺 脏组织学类似，裸DNA免疫出现上皮细胞破坏，而GXV免疫小鼠显示出 与正常小鼠相当的肺脏表型。这些结果表明GXV疫苗保护小鼠免受RSV 感染所诱发的肺部炎症。 GXV诱发抗RSV抗体反应 为确定经粘膜施用GXV疫苗是否可在小鼠中诱导产生特异抗体，测 定了施用裸质粒混合物或GXV疫苗的小鼠中RSV特异抗体滴度。用GXV 疫苗免疫的动物的抗体滴度显著高于对照动物。由于鼻是RSV的主要侵入 部位，因此认为分泌型IgA抗体对粘膜病原感染起到保护作用。测量鼻洗 液中总IgA抗体水平以证实该类抗体水平的变化是否是由于疫苗接种的结 果。用GXV疫苗免疫的动物的IgA抗体滴度显著高于对照动物。这些结 果表明GXV疫苗诱导血清中抗体特别是IgA的分泌。 GXV诱导IFN-γ在肺脏和脾脏中的表达 IFN-γ为主要的抗病毒细胞因子，因此疫苗必须诱导IFN-γ表达才能 发挥效应。为确定GXV疫苗是否诱导IFN-γ的表达，用GXV疫苗免疫小 鼠，然后在第16天感染RSV。在第21天处死动物，进行支气管肺泡灌洗 并体外培养其脾细胞。GXV免疫的小鼠在其BAL液中产生的IFN-γ显著 高于对照组。此外，用抗-CD3抗体刺激培养的脾细胞时，GXV免疫的小 鼠产生的IFN-γ多于对照组小鼠。 统计学分析 用学生t检验对两组间进行比较。p＜0.05时即认为组间差异显著。 所有检测数值以平均值±SD表述。数据在表1中显示。表1中的每一数值 代表一组(n＝4)中每只鼠的6个单独肺切片中5个视野的平均值±SD。小鼠 组的统计学分析显示，免疫小鼠的抗原载量(77％)显著低于PBS对照组， 图2B。这些结果表明，脱乙酰壳多糖提高了pDNA疫苗的功效，且GXV 提供了抗RSV感染的有效疫苗。为检测鼻内施用GXV是否引起呼吸道高 反应性，在所有的三组动物中测定％基线暂停增加(Penh)。与接受裸DNA 或仅接受PBS(对照)的动物相比，接受GXV的动物表现出类似的对乙 酰甲基胆碱攻击的反应，图2C。这些结果提示，GXV处理本身并不引起 呼吸道高反应性的任何显著变化。 血清和粘膜反应均为疫苗有效性的重要组分。由于鼻通路是RSV的主 要侵入部位，因此认为分泌型IgA抗体对粘膜病原感染起到保护作用。鼻 内施用的GXV在小鼠中诱导产生特异抗体，测定施用裸质粒混合物或 GXV的小鼠的RSV特异抗体的滴度。GXV免疫动物的血清抗体滴度显著 高于对照组动物，图3A。将RSV与从免疫小鼠获得的血清孵育可降低病 毒对HEp-2细胞的感染，表明免疫后产生了中和抗体，图3B。与接受裸 DNA的小鼠相比，GXV小鼠的中和抗体滴度显著升高，上述两组均与对 照组存在显著差异。鼻洗液中检测出的总IgA抗体的水平证实此类抗体的 变化是由于GXV免疫的结果。GXV免疫动物的IgA抗体滴度显著高于对 照动物，图3C。这些结果表明GXV使血清和鼻IgA中的中和抗体产量提 高。差异表述为：与PBS对照相比a；P＜0.05，aa；P＜0.01以及aaa；P＜0. 001；b；与裸DNA相比P＜0.05。 表1：半定量分析： 病理学 PBS 裸DNA GXV 上皮损伤 2.53±0.17 2.25±0.30 1.4±0.52aab 间质-肺泡浸润 2.66±0.21 2.36±0.33 1.76±0.35aaa 支气管血管周浸润 2.01±0.20 1.81±0.57 1.46±0.23a 鼻内施用GXV导致组成型RSV抗原的有效表达，应用RT-PCR和 western印迹分析检测小鼠的肺组织。特定GXV的肺mRNA的RT-PCR 分析结果显示，GXV编码的所有mRNA在肺组织中均可检测到，图1A。 这些mRNAs翻译并产生足够免疫原的证据通过从这些鼠收集的合并血清 (n＝4)中获得，前述血清在western印迹分析中可与RSV感染的Hep-2细 胞上清中存在的多种RSV抗原进行反应，图1B。这些结果表明GXV诱 导产生引起抗体反应的RSV抗原。 小鼠施用单剂GXV(DNA总量为25μg)或生理盐水溶解的裸DNA(对 照)。急性活病毒感染后肺病毒滴度分析显示，与PBS对照相比GXV小鼠 中的RSV滴度显著降低(100倍)，图2A。施用裸DNA的小鼠的滴度与PBS 对照类似，提示经鼻内途径施用时裸DNA并不有效。检测免疫及对照小 鼠的总RSV抗原载量，GXV免疫的小鼠用于分析脾中RSV特异的CTL 的存在，所述检测应用持续RSV感染的BCH4作为靶细胞且应用RSV阴 性的BC细胞作为对照。PBS或裸DNA对照并不引起可检测的CTL反应。 相反，用GXV免疫的小鼠产生CTL反应，图4A，且这些CTL显示为 CD8+和MHC I类限制性的(数据未显示)。IFN-γ被认为是主要的抗病毒细 胞因子。因此，有效的疫苗必须能够诱导IFN-γ的表达。从GXV免疫和 对照组小鼠的培养脾细胞和支气管肺泡灌洗(BAL)中测试IFN-γ。GXV免 疫小鼠在其BAL液中产生的IFN-γ明显多于对照小鼠，图4B。GXV免 疫小鼠的培养脾细胞用抗CD3抗体刺激后产生的IFN-γ多于对照小鼠，图 4C。 在不同组的小鼠中检测肺炎症。代表性病理特征在图5A中显示。接 受GXV疫苗组的小鼠与对照相比，其上皮损伤较轻，单核细胞(MNC)和 多形核细胞(PMNC)在间隙和支气管血管周区的浸润减少，图5。PBS组和 裸DNA组的上皮细胞出现损坏，而GXV免疫小鼠显示与正常小鼠相当的 肺表型(数据未显示)。这些结果表明，GXV疫苗保护小鼠免受RSV感染 诱发的肺部炎症。应用用于肺部炎症评分系统的半定量分析在表1中显示。 接受GXV疫苗组的小鼠上皮损伤减轻(与PBS组相比P＜0.01，且与裸DNA 组相比P＜0.05)且与裸DNA和PBS对照相比肺部炎症减弱。与PBS对照 相比，接受GXV组的小鼠间质肺泡浸润(P＜0.01)和支气管血管周浸润 (P＜0.05)减轻。用裸DNA对照组未发现统计学显著差异。这些结果显示， GXV可保护小鼠免受RSV感染诱发的肺部炎症。 在此申请中，涉及多种出版物。这些出版物全部引用作为参考并入本 申请，以更完整地描述属于本发明的领域。 以上描述的实施例仅用于示例的目的，且并不意在限定本发明的范围 或实施方案。并未特别描述的其他实施方案为领域内的普通技术人员所熟 知。由此应认为这些实施方案位于本发明的范围和精神之内。因此，本发 明仅由以下的权利要求所正确限定。 本申请要求2001年9月28日申请的美国系列号60/325,573的优先权。