[0001] 本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种呼吸道合胞病毒重构多肽、由其形成的呼吸道合胞病毒重组抗原、包含其的免疫原性组合物及其制备方法和用途。

[0002] 人类呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴儿和早产儿中下呼吸道感染的主要原因之一。目前，全球对安全有效的RSV疫苗的需求日益迫切。

[0003] RSV融合蛋白（F蛋白）是RSV病毒粒子与宿主细胞融合的关键介质，其在病毒粒子与宿主细胞融合前的状态中表现出极高的免疫原性，被认为是RSV疫苗研发的理想靶标。已经鉴定出融合前构象中稳定的RSV F蛋白产生比融合后构象中的RSV F蛋白观察到更强的中和免疫应答。

[0004] 目前已经有大量关于RSV F蛋白融合前构象稳定性的研究，但大部分研究侧重于对RSV F蛋白特定位点的氨基酸进行突变或在F蛋白C端引入三聚化域。在过往研究中，在F蛋白C端引入三聚化域的方法是将F蛋白的跨膜域（TM）用三聚化域进行替换。然而，在引入三聚化域后，跨膜域的删除对于疫苗保护力的影响并没有得到深入研究。

[0051] 为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

[0052] 术语“多肽”是指不论长度或翻译后修饰（例如，糖基化或磷酸化）的任何氨基酸链。“多肽”适用于氨基酸聚合物，包括天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如，相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端（N端）末端和羧基端（C端）末端。“多肽”可与肽或蛋白质互换使用，并且在本文中用于指氨基酸残基的聚合物。

[0053] 术语“F蛋白”或“F多肽”是指具有RSV F蛋白的整个或部分氨基酸序列的蛋白质或多肽。

[0054] RSV F蛋白，即Fusion蛋白或融合蛋白，是一种能够促进RSV病毒膜和宿主细胞膜的融合的RSV包膜糖蛋白，在呼吸道合胞病毒感染过程种起着至关重要的作用。在自然界中，RSV F蛋白最初合成为长度为约574个氨基酸的单个多肽前体，命名为F0。F0包括N端信号肽，其指导定位于内质网，其中信号肽（大约F0的前25个残基）被蛋白水解切割。剩余的F0残基通过寡聚化形成三聚体，并在两个保守的共有弗林蛋白酶切割序列（大约位于F0的第109和136位；例如，RARR109（F0的第106‑109位氨基酸残基）和RKRR136（F0的第133‑136位氨基酸残基）处通过细胞蛋白酶进行蛋白水解加工，产生两个二硫键连接的片段F1和F2。这些片段中较小的F2来源于F0前体的N端部分，并且包括大约F0的第26‑109位氨基酸残基。这些片段中较大的F1包括F0前体的C端部分（大约F0的第137‑574位氨基酸残基），包括细胞外/腔区（约第137‑529位氨基酸残基）、跨膜结构域（约第525‑550位氨基酸残基）和C端的胞质尾（约第551‑574位氨基酸残基）。RSV F蛋白的细胞外部分是RSV F胞外域，其包括F2蛋白和F1胞外域。

[0055] RSV F蛋白在RSV亚型中表现出显著的序列保守性。例如，在F0前体分子中，RSV亚型A和B具有90%的序列相同性，并且RSV亚型A和B各自与牛RSV F蛋白具有81%的序列相同性。在RSV亚型内，F0序列相同性甚至更高；例如，在RSV A、B和牛亚型中的每一个亚型内，RSV F0前体蛋白具有约98%的序列相同性。几乎所有鉴定的RSV F0前体蛋白长度为约574个氨基酸，长度上的微小差异通常是由于C端胞质尾的长度。鉴于RSV F序列的保守性，本领域普通技术人员可以容易地比较不同天然RSV F序列之间的氨基酸位置，以鉴定不同RSV病毒株和亚型之间的相应RSV F氨基酸位置。因此，跨病毒株和亚型的RSV F蛋白质序列的保守性允许使用参考RSV F序列来比较RSV F蛋白质中特定位置的氨基酸。除非上下文另有说明，否则本文公开的氨基酸取代的编号是参考SEQ ID NO：1‑4所示的RSV F0多肽序列进行的。

[0056] 三个F2‑F1原聚体在成熟F蛋白中寡聚化，其采用亚稳的融合前构象，在与靶细胞膜接触时被触发经历构象变化至融合后构象。这种构象变化暴露出疏水序列，称为融合肽，其位于F1胞外域的N端，并与宿主细胞膜结合并促进病毒或感染细胞的膜与靶细胞膜的融合。

[0057] 多肽或蛋白质的“域”或“结构域”是指多肽或蛋白质内结构限定的元件，例如，“三聚化域”是指多肽内促进多肽装配成三聚体的氨基酸序列。例如，三聚化域能促进经由与（具有相同或不同氨基酸序列的其他多肽的）其他三聚化域的联合而装配成三聚体；“跨膜域”是指能插入脂质双层（例如细胞或病毒或病毒样颗粒的脂质双层）或将抗原锚定到膜上的氨基酸序列。该术语也用于指编码此类肽或多肽的多核苷酸。本发明所述RSV F蛋白重构多肽中的上述各结构域之间可以直接连接，也可以通过天然的或人工的连接子、接头、间隔序列（Spacer）连接。

[0058] 术语“连接子”或“接头”或“Spacer”或“间隔序列”是可用于将两个分子连接成一个连续分子的天然的或人工的双功能分子。肽连接子的非限制性实例包括甘氨酸‑丝氨酸肽接头和RSV F蛋白514‑524号氨基酸之间任意长度的片段。除非上下文另有说明，否则提及“连接”第一多肽和第二多肽，或将两个多肽“连接”在一起，或与第二多肽具有“连接”的第一多肽，是指通过肽键（例如通过肽接头）的共价连接，使得第一和第二多肽形成连续的多肽链。如果涉及肽接头，那么第一和第二多肽的共价连接可以是连接至肽接头的N端和C端。术语“突变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。氨基酸序列变体与天然或参考序列相比可在氨基酸序列内的特定位置具备取代、删除和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具备至少50%同源性。在一些实施方案中，变体与天然或参考序列共有至少80%或至少90%同源性。

[0059] 术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子（例如DNA分子和/或RNA分子）和/或多肽分子之间的总体相关性。共有通过匹配残基的比对所测定的临界水平的类似性或同一性的聚合分子（例如核酸分子（例如DNA分子和/或RNA分子）和/或多肽分子）被称为同源。同源性为描述分子之间的关系的定性术语且可基于定量的类似性或同一性。类似性或同一性为定义两种比较序列之间的序列匹配程度的定量术语。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或类似，则认为其彼此“同源”。术语“同源”必定是指至少两种序列（多核苷酸或多肽序列）之间的比较。如果两种多核苷酸序列编码的多肽对于至少一个具有至少20个氨基酸的延伸段而言至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%一致，则认为两种序列同源。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列由编码具有至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力表征。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列而言，同源性由编码具有至少4至5个独特规定氨基酸的延伸段的能力来测定。如果两种蛋白对于至少一个具有至少20个氨基酸的延伸段而言至少50%、60%、70%、80%或90%一致，则认为两种蛋白序列同源。术语“多核苷酸”和“核酸序列”指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的经修饰形式。核酸的5’和3’方向通过参照各个核苷酸单元的连接性来限定，并依照脱氧核糖（或核糖）糖环的碳位置来指派。以5’至3’方向阅读多核苷酸序列的信息（编码）内容。

[0060] 术语“重构多肽”，即“重组多肽”，指具有非天然存在序列或者具有通过人工组合两个或多个在其他情况中分开的序列区段生成的序列的多肽，所述序列区段可以是在同一个蛋白质中，也可以在不同的蛋白质中。

[0061] 在一些实施方案中，本公开的核苷酸疫苗包含至少一种核糖核酸（RNA）多核苷酸，其具有编码至少一种呼吸道合胞病毒（RSV）抗原性多肽的开放阅读框，其中所述RNA包含至少一个化学修饰。

[0062] 术语“化学修饰”和“经化学修饰”是指关于腺苷（A）、鸟苷（G）、尿苷（U）、胸苷（T）或胞苷（C）核糖核苷或脱氧核糖核苷对其位置、模式、百分比或群体中至少一者的修饰。通常，这些术语并非指天然存在的5’末端mRNA帽部分的核糖核苷酸修饰。多核苷酸的修饰包括但不限于本文所述的那些修饰，且包括（但不明确限于）包含化学修饰的那些修饰。多核苷酸（例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸）可包含天然存在、非天然存在的修饰或多核苷酸可包含天然存在的修饰与非天然存在的修饰的组合。多核苷酸可包括对例如糖、核碱基或核苷间键联（例如，对连接磷酸酯，对磷酸二酯键联或对磷酸二酯主链）的任何适用的修饰。

[0063] 术语“异源的”就核酸、多肽或其它细胞成分而言指明存在如下成分，其在自然界中通常找不到和/或其源自不同来源或物种。

[0064] “抗原”指能在动物中刺激抗体生成和/或T细胞应答的化合物、组合物、或物质，包括注射、吸附、或别的方式导入动物中的组合物。术语“抗原”包括所有相关抗原性表位。术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原上由B和/或T细胞应答的位点。“优势抗原性表位”或“优势表位”指针对其产生功能上显著的宿主免疫应答（例如抗体应答或T细胞应答）的那些表位。如此，关于针对病原体的保护性免疫应答，优势抗原性表位指在被宿主免疫系统识别时产生保护免于由该病原体引起的疾病的那些抗原性模块。术语“T细胞表位”指在与合适的MHC分子结合时被T细胞特异性结合（经由T细胞受体）的表位。“B细胞表位”指被抗体（或B细胞受体分子）特异性结合的表位。

[0065] “疫苗”指能够刺激免疫应答的免疫原性物质制剂，其被施用以用于预防、改善或治疗感染性疾病或其它类型的疾病。免疫原性物质可以包括减毒或杀死的微生物（例如细菌或病毒），或来源于它们的抗原蛋白、肽或DNA。疫苗可以包括公开的免疫原（例如重组RSV F胞外域三聚体或编码其的核酸分子）、病毒、细胞或一种或多种细胞成分。疫苗可以引发防治性（预防性或保护性）和治疗性应答。施用方法根据疫苗而不同，但可以包括接种、摄取、吸入或其它形式的施用。疫苗可以与佐剂一起施用以加强免疫应答。在一个具体的非限制性实例中，与对照相比，疫苗预防和/或降低与RSV感染相关的症状的严重性和/或降低病毒载量。

[0066] “载体”或“赋形剂”是指药学上可接受的辅料，指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。“药学上可接受的辅料”除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。按照作用和用途，药用辅料可分为溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。

[0067] “重组”是具有非天然存在的序列的分子，例如包括一个或多个核酸取代、缺失或插入，和/或具有通过两个以其它方式分离的序列区段的人工组合制备的序列。这种人工组合可以通过化学合成或更常见地通过人工操作分离的核酸区段（例如通过基因工程技术）来完成。重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有通过两个以其它方式分离的序列区段的人工组合制备的序列的蛋白质。在若干实施方案中，重组蛋白由异源（例如重组）核酸编码，所述核酸已引入宿主细胞（例如细菌或真核细胞），或引入重组病毒的基因组。

[0068] “表达调控元件”是指调节与其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和（适当的）翻译时，表达控制序列可操作地连接于核酸序列。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子（ATG）、内含子的剪接信号（维持基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译）和终止密码子。术语“调控元件”旨在至少包括其存在可影响表达的组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达调控元件可以包括启动子。

[0069] “启动子”是足以指导转录的最小序列。包括T7启动子，还包括那些足以使启动子依赖性基因表达关于细胞类型特异性、组织特异性可控制或可由外部信号或试剂诱导的启动子元件；这类元件可以位于基因的5’或3’。包括组成型和诱导型启动子（参见例如Bitter等人，Methodsin Enzymology 153：516‑544，1987）。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac（ptrp‑lac杂合启动子）等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子（如金属硫蛋白启动子）或衍生自哺乳动物病毒的启动子（如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子）。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。

[0070] “5’UTR”是指直接位于起始密码子（即，由核糖体翻译的mRNA转录物的第一密码子）上游（即，5’）的不编码多肽的mRNA区域。“3’UTR”是指直接位于终止密码子（即，传导翻译终止信号的mRNA转录物的密码子）下游（即，3’）的不编码多肽的mRNA区域。

[0071] “编码序列CDS”为以起始密码子（例如，蛋氨酸（AUG））开始且以终止密码子（例如，UAA、UAG或UGA）结束并编码多肽的RNA的连续延伸段。

[0072] “polyA尾”或“多聚腺苷酸尾”，位于mRNA中3’UTR下游区域，含有多个连续单磷酸腺苷。polyA尾可含有10至300个单磷酸腺苷。举例来说，polyA尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、
260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，polyA尾含有50至250个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，polyA尾中含有非腺苷的核苷酸将连续单磷酸腺苷分段。在相关生物学情境中（例如，在细胞中、体内），poly（A）尾用以保护mRNA以免酶促降解，例如在细胞质中，且有助于转录终止和/或mRNA从细胞核输出和翻译。

[0073] “宿主细胞”指载体可以在细胞中增殖并表达载体核酸的细胞。细胞可以是原核或真核的。所述术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能与亲本细胞不同，因为在复制过程中可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类后代。

[0074] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0075] 另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

[0076] 除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

[0077] 实施例1：重构多肽的结构设计本实施例中分别设计了以下本发明重构多肽及其对照多肽。

[0078] 本发明重构多肽：PreF1‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：24所示）、PreF2‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：27所示）、PreF3‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：30所示）、PreF4‑T4‑F/TMB（其序列如SEQ ID NO：33所示）、PreF1‑MTQ‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：35所示）、PreF1‑IZ‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：37所示）、PreF1‑T4‑gP160/TM（其序列如SEQ ID NO：38所示）、PreF1‑T4‑HA/TM（其序列如SEQ ID NO：39所示）、PreF1‑T4‑S/TM（其序列如SEQ ID NO：40所示）、PreF1‑T4‑F/TMA525‑550（其序列如SEQ ID NO：74所示）。

[0079] 对照多肽：PreF1‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：22所示）、PreF1‑T4（其序列如SEQ ID NO：23所示）、PreF2‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：25所示）、PreF2‑T4（其序列如SEQ ID NO：26所示）、PreF3‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：28所示）、PreF3‑T4（其序列如SEQ ID NO：29所示）、PreF4‑F/TMB（其序列如SEQ ID NO：31所示）、PreF4‑T4（其序列如SEQ ID NO：32所示）、PreF1‑MTQ（其序列如SEQ ID NO：34所示）、PreF1‑IZ（其序列如SEQ ID NO：36所示）。

[0080] 上述各多肽的序列均为不包含其内源信号肽的序列，它们所用的内源信号肽序列如SEQ ID NO：66或67所示；其中，PreF1‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：22所示）、PreF1‑T4（其序列如SEQ ID NO：23所示）、PreF1‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：24所示）、PreF2‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：25所示）、PreF2‑T4（其序列如SEQ ID NO：26所示）、PreF2‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：27所示）、PreF3‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：28所示）、PreF3‑T4（其序列如SEQ ID NO：29所示）、PreF3‑T4‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：30所示）、PreF1‑MTQ（其序列如SEQ ID NO：34所示）、PreF1‑MTQ‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：35所示）、PreF1‑IZ（其序列如SEQ ID NO：36所示）、PreF1‑IZ‑F/TMA（其序列如SEQ ID NO：37所示）、PreF1‑T4‑gP160/TM（其序列如SEQ ID NO：38所示）、PreF1‑T4‑HA/TM（其序列如SEQ ID NO：39所示）、PreF1‑T4‑S/TM（其序列如SEQ ID NO：40所示）、PreF1‑T4‑F/TMA525‑550（其序列如SEQ ID NO：74所示）的内源信号肽序列如SEQ ID NO：66所示，其余多肽的内源信号肽序列如SEQ ID NO：67所示。

[0081] 上述各多肽的结构示意图如图1所示。

[0082] 实施例2：重构多肽的mRNA的制备及脂质纳米颗粒（LNP）的包装构建包含T7启动子（SEQ ID NO：68）、5’UTR（SEQ ID NO：69）、各重构多肽的编码序列（CDS）、3’UTR（SEQ ID NO：70）、多聚腺苷酸尾（SEQ ID NO：71）、限制性内切酶位点（序列为GAAGAGC）的pUC57质粒（构建服务由南京金斯瑞生物科技有限公司提供），将其进行酶切线性化和纯化，获得高质量的线性化质粒作为体外转录模板。将线性化质粒模板在T7 RNA聚合酶、3’‑OMe‑GAG帽类似物、优化的转录体系和条件下，完成体外转录，获得加帽的mRNA。
该加帽的mRNA通过寡聚dT亲和纯化，并进行无菌过滤。所得mRNA的浓度和完整性通过分光光度法（NanoDrop One，Thermo Scientific）和毛细管电泳（Agilent 5200）进行分析。mRNA的加帽率和多聚腺苷酸尾情况通过液相色谱联用质谱（LC‑MS）进行分析。mRNA溶液的pH值、残留DNA、蛋白质和双链RNA杂质也进行了分析。图2展示了mRNA的组成示意图。

[0083] mRNA使用由来自专利CN118084714B的化合物5、DSPC、胆固醇和DMG‑PEG2000配制而成的LNP进行包封。使用Quant‑iTTM RiboGreenTM RNA Assay Kit（Invitrogen）‑酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Scientific）、毛细管电泳（Agilent 5200）、光散射仪（Zetasizer Ultra）分析mRNA‑LNP样品的mRNA浓度、包封率、mRNA完整性、LNP粒径和Zeta电位。mRNA‑LNP样品的pH值、内毒素和生物负荷也进行了分析，确保适合临床前阶段的研究。

[0084] 采用上述程序，制备了各重构多肽的mRNA‑LNP，作为mRNA疫苗。

[0085] 实施例3：编码重构多肽的mRNA‑LNP在HEK293细胞中的表达情况

[0086] 使用流式细胞术或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测编码重构多肽的mRNA‑LNP在HEK293细胞中表达的情况。流式细胞术检测方法：HEK293细胞铺入培养皿中，待细胞长至80％覆盖时，加入mRNA‑LNP，转染24h后，收集细胞，用识别F蛋白Ⅳ表位和PreF蛋白Φ表位的荧光抗体分别标记细胞表面的F蛋白（不转染mRNA的空白细胞作为阴性对照），孵育后清洗细胞，再用流式细胞仪检测荧光强度。ELISA检测方法：HEK293细胞铺入培养皿中，待细胞长至80％覆盖时，加入mRNA‑LNP，转染48h后，收集培养上清，去除沉淀，用10kDa分子量截留的超滤管浓缩15倍，然后用ELISA试剂盒检测上清浓缩液中PreF蛋白的浓度，用特异性识别结合RSV PreF ø表位的捕获单克隆抗体和识别Ⅱ/Ⅲ表位的检测单克隆抗体‑辣根过氧化物酶（HRP）基于双抗体夹心法对PreF含量进行检测。

[0087] 图3展示了编码不含跨膜域的重构多肽的代表性ELISA检测结果，图中转染编码PreF1‑T4、PreF2‑T4、PreF3‑T4、PreF4‑T4、PreF1‑IZ、PreF1‑MTQ重构多肽的mRNA‑LNP的细胞，细胞培养上清中都表达了PreF蛋白。图4展示了含有跨膜域的重构多肽用PreF ø表位抗体标记的代表性流式细胞检测结果，图中显示细胞转染编码PreF1‑F/TMA、PreF1‑T4‑F/TMA、PreF2‑F/TMA、PreF2‑T4‑F/TMA、PreF3‑F/TMA、PreF3‑T4‑F/TMA、PreF1‑IZ‑F/TMA、PreF1‑MTQ‑F/TMA、PreF1‑T4‑HA/TM重构多肽的mRNA‑LNP，细胞PreF蛋白阳性率都在98%以上。图5展示了含有跨膜域的重构多肽用F蛋白Ⅳ表位抗体标记的代表性流式细胞检测结果，图中显示细胞转染编码PreF1‑T4‑F/TMA525‑550、PreF4‑F/TMB、PreF4‑T4‑F/TMB、PreF1‑T4‑gp160/TM、PreF1‑T4‑S/TM重构多肽的mRNA‑LNP，细胞PreF蛋白阳性率在17.4‑99.3%之间。其中PreF1‑T4‑gp160/TM、PreF1‑T4‑S/TM重构多肽的细胞F蛋白阳性率和平均荧光强度（MFI）虽然低于其他重构多肽，但明显优于未转染mRNA‑LNP的阴性对照组。未转染mRNA‑LNP的阴性对照组细胞F蛋白阳性率是0.12%。PreF1‑T4‑gp160/TM、PreF1‑T4‑S/TM重构多肽的MFI是阴性对照组的2倍左右。

[0088] 需要说明的是，本实施例中流式细胞试验中仅检测了细胞表面的F蛋白，ELISA试验仅检测了分泌在细胞外的蛋白，因此检测值并不代表总蛋白表达的情况，仅仅证明所有mRNA‑LNP都能表达产生F蛋白。

[0089] 综上，上述结果说明本发明重构多肽都能在细胞中表达。

[0090] 实施例4：实验动物免疫和样品采集6‑8周龄BALB/c雌鼠进行随机分组，6只每组，每轮实验除了实验组都还包含一组
空白对照。第0天，在小鼠右后腿外侧进行肌肉注射将mRNA‑LNP疫苗注入小鼠体内，注射剂量为5μg/只，注射体积为50μL/只。空白对照组仅注射相同体积的生理盐水。第14天，以相同方式进行加强免疫，剂量相同。期间监控小鼠体重，避免发生异常情况。第28天，进行摘眼球取全血，分离血清。

[0091] 实施例5：蚀斑减少中和实验（FRNT）检测免疫小鼠血清中的中和抗体滴度

[0092] 利用灶斑减少中和实验（FRNT）检测血清中和抗体滴度NT50。疫苗的F蛋白序列来源于A型毒株用RSV‑A2‑GFP病毒检测中和抗体，来源于B型毒株用RSV‑B1‑GFP病毒检测中和抗体。

[0093] HEP‑2细胞铺入96孔细胞培养板中，当细胞长至95%覆盖时，开始后续实验。血清补体灭活：血清用前置于56℃水浴灭活补体30min。血清梯度稀释：血清用稀释液（DMEM培养基+10�S）进行稀释，起始稀释倍数为40倍，然后以3倍倍比稀释，共8个稀释梯度。病毒稀释：疫苗的F蛋白序列来源于A型毒株（PreF1、PreF2、PreF3相关重构多肽）用RSV‑A2‑GFP病毒检测中和抗体，来源于B型毒株（PreF4相关重构多肽）用RSV‑B1‑GFP病毒检测中和抗体。将病
4
毒原液稀释为10 pfu/mL。病毒中和：将血清稀释液和病毒稀释液分别取220μL混合均匀，置于37℃培养箱孵育1h。血清‑病毒混合物加入HEP‑2细胞96孔板：细胞培养上清移去，每孔加入200μL中和结束的血清‑病毒混合物，每个血清稀释度做两个复孔，细胞培养板置于37℃培养箱培养48h。荧光斑点读取：移去培养基，用PBS清洗细胞表面2次，拍干液体后使用酶联斑点分析仪读出病灶斑点计数结果，最后再结合病毒滴度和血清稀释倍数算出RSV中和抗体滴度。

[0094] 结果及分析如下：

[0095] 1）基于不同RSV F蛋白的本发明重构多肽的mRNA疫苗所诱导的中和抗体滴度图6中的A‑D分别展示了基于PreF1、PreF2、PreF3、PreF4的本发明重构多肽的mRNA
疫苗所诱导的中和抗体滴度水平，其显示，同时含有三聚化域T4 foldon和跨膜域F/TM的各PreF抗原（即，本发明重构多肽）诱导的中和抗体水平均高于只含有T4或只含有F/TM的抗原（即，对照多肽）。PreF1‑T4‑F/TMA诱导的中和抗体几何平均滴度（GMT）分别是PreF1‑F/TMA、PreF1‑T4的2.88、2.70倍。PreF2‑T4‑F/TMA诱导的中和抗体GMT分别是PreF2‑F/TMA、PreF2‑T4的1.77、1.14倍。PreF3‑T4‑F/TMA诱导的中和抗体GMT分别是PreF3‑F/TMA、PreF3‑T4的
6.91、1.71倍。PreF4‑T4‑F/TMB诱导的中和抗体GMT分别是PreF4‑F/TMB、PreF4‑T4的2.04、
1.43倍。这说明：本发明重构多肽诱导中和抗体的能力均显著优于对照多肽。这说明，将跨膜域连接在三聚化域C端，可显著提高其免疫原性。

[0096] 2）基于不同三聚化域的本发明重构多肽的mRNA疫苗所诱导的中和抗体滴度图7展示了基于IZ或MTQ的本发明重构多肽的mRNA疫苗所诱导的中和抗体滴度水
平，其显示，含有三聚化域IZ或MTQ的本发明重构多肽的mRNA疫苗均诱导了较高水平的中和抗体滴度，这说明：含有不同三聚化域IZ或MTQ的本发明重构多肽均诱导了较高的中和抗体滴度；并且，它们均高于仅含三聚化域而不含跨膜域的对照mRNA疫苗，PreF1‑IZ‑F/TMA诱导的中和抗体GMT是PreF1‑IZ的6.77倍，PreF1‑MTQ‑F/TMA诱导的中和抗体GMT是PreF1‑MTQ的
1.66倍，这说明：通过将跨膜域连接在三聚化域C端，可显著提高其免疫原性。

[0097] 3）基于不同跨膜域的本发明重构多肽的mRNA疫苗所诱导的中和抗体滴度图8展示了采用不同跨膜域（同源或异源）的本发明重构多肽的mRNA疫苗所诱导的
中和抗体滴度，其显示，含有不同跨膜域的本发明重构多肽的mRNA疫苗均诱导了较高水平的中和抗体滴度，它们均高于仅含三聚化域或仅含F蛋白自身跨膜域F/TM的相应的对照mRNA疫苗。PreF1‑T4‑HA/TM、PreF1‑T4‑S/TM、PreF1‑T4‑gp160/TM、PreF1‑T4‑F/TMA、PreF1‑T4‑F/TMA525‑550诱导的中和抗体GMT，分别是PreF1‑T4的5.05、2.43、1.71、2.70、3.66倍，分别是PreF1‑F/TMA的5.39、2.60、1.82、2.88、3.91倍。这说明：通过将同源或异源跨膜域连接在三聚化域C端，可显著提高其免疫原性。

[0098] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。