[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体及其应用。

[0002] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，以下简称RSV)广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人急性下呼吸道感染(Acute lower respiratory illness,ALRI)的重要病毒病原，目前中国国内尚无有效的RSV预防性疫苗获批上市，世界卫生组织将RSV疫苗列为当前应优先发展的疫苗之一。

[0003] RSV基因组为长约15.2kb的单股负链RNA，编码11种蛋白，其中包括3种跨膜包膜糖蛋白(F、G和小疏水蛋白SH)，RSV感染主要由糖蛋白F和G介导，虽然F蛋白与G蛋白均处在病毒包膜外，均具有多个特异性抗原决定簇，但不同亚型间F序列高度保守，以F蛋白作为抗原的疫苗有望激发机体产生更广谱的保护力，因此使得F蛋白成为RSV疫苗的重要候选抗原。

[0004] 在介导病毒包膜与宿主细胞膜融合期间，F蛋白从亚稳定的融合前构象转变为稳定的融合后构象。研究表明识别融合前构象特有抗原表位的抗体具有更有效的病毒中和活性，且大量的临床前及临床数据表明，以融合前构象RSV F为抗原的疫苗能够刺激机体产生更高水平的病毒中和抗体(Griffin,M.R.(2022)."A Challenge to Respiratory Syncytial Virus Illness in Adults."N Engl J Med 386(25):2427‑2428.)。但是融合前构象F蛋白经物理或化学应激或储存后容易转变为融合后构象(McLellan,J.S.,et al.(2013)."Structure‑based design of a fusion glycoprotein vaccine for 
respiratory syncytial virus."Science 342(6158):592‑598.)，因此将融合前F蛋白制备为能够长期稳定保存的疫苗抗原非常具有挑战。

[0005] 以美国国立卫生卫生研究院、葛兰素史克、辉瑞和强生为代表的国际研究机构或疫苗厂商在RSV F蛋白的序列设计上已开展大量工作，美国国立卫生研究院已有1篇相关授权专利(授权公告号：CN105473604B)，强生已有3篇相关授权专利(授权公告号：CN105188745B、CN105408348B和CN107847581B)，在这些专利的基础上，葛兰素史克和辉瑞的疫苗经过十年的努力，终于在2023年3月获得美国FDA上市批准，但目前国内相关疫苗的研发水平相对薄弱，尚未有同类产品上市。

[0057] 本发明公开了呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0058] 术语：

[0059] 在本申请中，术语“呼吸道合胞病毒”或“RSV”属于副黏病毒科的肺病毒属，所述病毒通常是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人急性下呼吸道感染(Acute lower respiratory illness,ALRI)的重要病毒病原，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。

[0060] 在本申请中，术语“蛋白突变体”通常可以指构成其的氨基酸序列或蛋白质结构与野生型蛋白质相比有一种或多种改变的蛋白质。所述改变可以包括：一个或多个氨基酸的删除、插入、替换、截短和/或缺失，蛋白质结构的加工或切割。在本申请中，蛋白质突变体指呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白突变体。

[0061] 在本申请中，术语“氨基酸突变”通常是指对野生型氨基酸序列中的氨基酸进行的修饰。例如，所述修饰可以包括一个或多个氨基酸的替换、插入和/或缺失。在本申请中，所述氨基酸突变可以包括在氨基酸序列的指定位置缺失或替换至少一个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述氨基酸突变能够使所述氨基酸序列构成的蛋白质的构象优化。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸突变。例如，遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR和基因合成等。

[0062] 在本申请中，术语“阿尔法螺旋结构的贯通”是指存在两个弯折的阿尔法螺旋结构在某种情况下弯折变化为一个线性的不再弯折的阿尔法螺旋结构。

[0063] 在本申请中，术语“密码子优化”通常表示通过具有不同的相对使用频率的编码相同氨基酸残基的密码子，替换亲代多肽编码核酸中的一个或一个以上密码子，以改善编码多肽的核酸的表达。在本申请中，只要氨基酸的突变与本申请相同，编码该突变氨基酸的所有可能的密码子都在本申请的保护范围内。

[0064] 在本申请中，术语“病毒样颗粒”、“virus‑like particle”或“VLP”通常是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒。所述病毒样颗粒没有病毒核酸，不能自主复制。所述病毒样颗粒可以在形态上与真正病毒粒子相同或相似。

[0065] 在本申请中，术语“三聚体”通常是指由三个同一类型或不同类型的蛋白亚单位共同组成的蛋白结构，蛋白三聚体可以通过特殊的化学结构连接在一起。在本申请中，所述蛋白三聚体可以是呼吸道合胞病毒的F蛋白。

[0066] 在本申请中，术语“构象变化”通常是指蛋白质分子的空间结构发生的改变。例如，所述构象变化可以包括蛋白质分子中化学键的改变、多肽的折叠方式发生改变。

[0067] 在本申请中，术语“信号肽”通常是指一种存在于跨膜蛋白的N末端作为跨膜时的信号的氨基酸序列。例如，所述跨膜蛋白可以包括分泌蛋白质或细胞膜蛋白。例如，所述信号肽可以以前体物质多肽的形式合成于所述跨膜蛋白的N端。

[0068] 在本申请中，术语“结构蛋白”通常是指构成病毒颗粒成分的蛋白质。所述结构蛋白可以包括呼吸道合胞病毒的结构蛋白。本申请所述结构蛋白可以包括F蛋白、G蛋白、SH蛋白。

[0069] 在本申请中，术语“融合前”通常是指病毒在感染宿主细胞前还未发生膜融合时的结构蛋白所呈现的构象。一般来讲，野生型RSV F蛋白的融合前为一种亚稳定态的蛋白质，其构象在病毒感染宿主细胞并发生膜融合后进行不连续，逐步和不可逆的构象变化成一个较低能量稳定态的构象(融合后构象)。在本申请中，对RSV F蛋白进行一系列改造，使得所述F蛋白突变体能够稳定地处于融合前体状态。

[0070] 在本申请中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+突变后的氨基酸”来表述。在本申请中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“E60L”通常指第60位谷氨酸(E)突变为亮氨酸(L)。

[0071] 在本申请中，氨基酸插入类突变的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+insert+插入的氨基酸”来表述。例如，术语“S215insertP”通常指第215位丝氨酸(S)后插入一个脯氨酸(P)。

[0072] 在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

[0073] 在申请中，术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的或者协助目的原件整合至宿主细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体、蛋白外壳或者整合酶，但不仅仅只有这些物质。

[0074] 在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的RSV F蛋白突变体、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒。

[0075] 在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂。

[0076] 在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

[0077] 本申请是在结构生物学的基础上，结合免疫学原理，设计出的安全性高、保护力广泛、制备工艺可靠的新型防护疫苗。本申请提供的重组蛋白疫苗的产量较文献报道SC‑TM相比显著提升。所述RSV F蛋白突变体能够稳定保持在融合前体状态，单独使用或辅以合适的佐剂后在动物的免疫试验中能够诱导较高的中和抗体水平。

[0078] 在本申请中，术语“佐剂”通常是指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。在本申请中，所述佐剂可以用来增强所述RSV F蛋白突变体的抗原性。在某些实施方式中，所述佐剂可以包含矿物(例如明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬浮液。在某些实施方式中，所述佐剂可以包括水包油乳剂。在某些实施方式中，所述佐剂可以包括脂质体。在某些实施方式中所述佐剂可以包括MPL、CpG、Poly:IC等免疫刺激剂。

[0079] 在本申请中，术语“疫苗”是指包含能够在个体中引发预防性或治疗性免疫应答的免疫原的药物物组合物。通常，疫苗引发针对病原体、例如病毒病原体的抗原特异性免疫应答。

[0080] 在本申请中，术语“融合前特异性抗体”是指特异性结合呈融合前构象的RSV F糖蛋白、但不结合呈融合后构象的RSV F蛋白的抗体。示例性融合前特异性抗体包括D25、AM22、5C4、MPE8和AM14抗体。

[0081] 在本申请中，在抗体结合给定靶分子的情况下，术语“特异性结合”是指抗体以高于其与测试的其它物质结合的亲和力与靶分子结合。例如，特异性结合呈融合前构象的RSV F蛋白的抗体是以高于其结合呈融合后构象的RSV F蛋白的亲和力结合呈融合前构象的RSV F蛋白的抗体。

[0082] 在本申请中，术语“SC‑TM”是指RSV F蛋白的具有文献“Krarup,A.,et al.(2015)."A highly stable prefusion RSV F vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism."Nat Commun 6:8143”中所述的氨基酸序列的形式。

[0083] 在本申请中术语“D25”是指WO 2008/147196 A2中所述的抗体，其具有包含本专利SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链可变结构域。

[0084] 不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的RSV F蛋白突变体、制备方法、质量表征和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

[0085] 本申请提供一种呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体，将呼吸道合胞病毒融合F蛋白的氨基酸序列中含菲林蛋白酶切位点的片段删除。在本申请中，删除含菲林蛋白酶切位点的片段，能够避免野生型RSV F蛋白被菲林蛋白酶酶切导致断裂，进而维持F蛋白的融合前构象。本发明中未引入任何菲林蛋白酶切位点序列的定点突变，也无需引入异源连接序列，与野生型序列相比能维持更高的序列相似度。

[0086] 在本申请中，所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体是将氨基酸序列中第100位与第147位之间28～46个氨基酸删除。例如，将氨基酸序列中第105位与第143位之间37个氨基酸删除(位置105与143间37个氨基酸的缺失)。

[0087] 在本申请中，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合F蛋白从融合前体向融合后体构象转化过程中发生阿尔法螺旋贯通的氨基酸突变为脯氨酸，或任意插入一个或多个脯氨酸，以阻断呼吸道合胞病毒融合F蛋白从融合前体向融合后体发生构象变化，使呼吸道合胞病毒融合F蛋白稳定在融合前体状态。

[0088] 例如，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白进行如下至少一种突变：

[0089] 将第210位谷氨酰胺突变为脯氨酸(Q210P)；

[0090] 将第211位丝氨酸突变为脯氨酸(S211P)；

[0091] 将第213位丝氨酸突变为脯氨酸(S213P)；

[0092] 将第214位异亮氨酸突变为脯氨酸(I214P)；

[0093] 将第217位异亮氨酸突变为脯氨酸(I217P)；

[0094] 在第210位与第217位氨基酸之间插入一个或多个脯氨酸，例如，在第215位与第216位氨基酸之间插入一个脯氨酸(S215insertP)。

[0095] 在本申请中，还包括将呼吸道合胞病毒融合F蛋白的氨基酸序列中的一个或多个带电氨基酸突变为极性氨基酸、疏水氨基酸或芳香氨基酸，以释放呼吸道合胞病毒融合F蛋白中的静电斥力，增强呼吸道合胞病毒融合F蛋白融合前体的稳定性。

[0096] 例如，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白进行如下至少一种突变：

[0097] 将第60位谷氨酸突变为丙氨酸(E60A)、甘氨酸(E60G)、丝氨酸(E60S)、苏氨酸(E60T)、亮氨酸(E60L)、蛋氨酸(E60M)或苯丙氨酸(E60F)；

[0098] 将第194位天冬氨酸突变为丙氨酸(D194A)、甘氨酸(D194G)、丝氨酸(D194S)、苏氨酸(D194T)、亮氨酸(D194L)、蛋氨酸(D194M)或苯丙氨酸(D194F)；

[0099] 将第486位天冬氨酸突变为甘氨酸(D486G)、苯丙氨酸(D486F)或半胱氨酸(D486C)；

[0100] 将第489位天冬氨酸突变为甘氨酸(D489G)、苯丙氨酸(D489F)或半胱氨酸(D489C)。

[0101] 在本申请中，将486位和/或489位天冬氨酸突变为半胱氨酸时，能在释放斥力的同时形成链间二硫键进一步提升F蛋白三聚体的稳定性。

[0102] 在本申请中，还包括将呼吸道合胞病毒融合F蛋白的氨基酸序列中的一个或多个小体积氨基酸突变为较大体积疏水氨基酸，以填充融合前体构象的呼吸道合胞病毒融合F蛋白的表面空穴，增强呼吸道合胞病毒融合F蛋白融合前体的稳定性。

[0103] 例如，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白的第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸(D67F)。

[0104] 在本申请中，还包括将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白的第509位丝氨酸突变为天冬氨酸(S509D)。

[0105] 在本申请中，还包括将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白的第512位亮氨酸突变为谷氨酰胺(S512Q)、天冬酰胺(S512N)或苯丙氨酸(S512F)。

[0106] 在本发明中，S509位和L512位氨基酸的突变，能够增加三聚体间的相互作用进而维持三聚体的稳定性。

[0107] 在本申请中，还包括将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的呼吸道合胞病毒融合F蛋白的第74位丙氨酸和第218位谷氨酸突变为半胱氨酸(A74C，E218C)。

[0108] 在本发明中，将第74位丙氨酸和第218位谷氨酸突变为半胱氨酸以形成二硫键，可增加三聚体稳定性。

[0109] 另一方面，本申请还提供一种编码所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体的核酸分子。

[0110] 本申请中，已经将该核酸分子密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。

[0111] 另一方面，本申请还提供一种载体，所述载体包含所述核酸分子。

[0112] 另一方面，本申请还提供一种细胞，所述细胞表达所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体，或包含所述核酸分子，或包含所述载体。例如，可将本申请所述的核酸分子或载体引入所述的细胞。所述细胞可以包括：原核细胞(例如，大肠杆菌细胞)和/或真核细胞(例如，HEK293T细胞、Expi293F细胞。在某些实施方式中，可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，所述方法可包括：热击转化法、瞬时转染法和/或稳定转染法。所述转染法可包括：电穿孔法、脂质体转染法和/或磷酸钙转染法等。在某些实施方式中，所述细胞可以包括通过本领域已知的方法(例如，瞬时转染)将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中使之表达(例如，瞬时表达)本申请所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体。

[0113] 另一方面，本申请还提供一种疫苗，所述疫苗包含所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体。在本申请中，所述疫苗还可以包含其他活性成分。在本申请中，所述疫苗还可以包含辅料和/或佐剂。

[0114] 另一方面，本申请还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体、所述疫苗、所述核酸分子或所述载体。

[0115] 在本申请中，所述药学上可接受的辅料包括保护剂、稳定剂、防腐剂、杀菌剂、灭活剂、佐剂和/或缓冲剂。

[0116] 另一方面，本申请还提供所述呼吸道合胞病毒融合F蛋白突变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述疫苗或所述药物组合物在制备检测、预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。

[0117] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0118] 实施例1：RSV F蛋白突变体的设计和表达量

[0119] 本发明共计评估了330余种RSV F蛋白突变体，本实施例汇总了SC‑TM阳性对照分子和20余个代表性RSV F蛋白突变体(其各自通过唯一标识符标识，诸如YK001Ag159、YK001Ag226等)的设计和表达量，代表性RSV F蛋白突变体包括未进行突变设计的野生型对照分子(YK001Ag145)和20个优选突变体，所述优选突变体包括fibritin折叠子三聚化结构域和引入的氨基酸突变。示例性RSV F突变体的设计和表达量提供于表1中。20个优选突变体各自基于SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列来设计和制备。用于表达和纯化这些示例性RSV F突变体的方法描述于实施例2和3中，用于测定RSV F突变体表达量的方法描述于实施例4中，所述RSV F突变体的表达量为本发明实施例2中所述细胞瞬转表达上清中的目的蛋白含量。与野生型对照分子相比，20个优选分子的表达量均有大幅度提升，且均达到或高于阳性对照分子的表达水平，表明位置60、67、74、210、211、213、217、218、486、489、509、512的氨基酸突变类设计，及位置105与位置143间的缺失类突变设计，及位置215与216间插入一个脯氨酸的插入类突变设计均可以提升融合前构象RSV F蛋白突变体的表达量。

[0120] 表1.示例性RSV F蛋白突变体的序列设计及表达量

[0121]

[0122]

[0123]

[0124] 实施例2：RSV F蛋白突变体的表达载体构建和小体积表达

[0125] RSV F蛋白突变体的编码核酸序列以CHO为宿主进行密码子优化和合成，使用HindIII和NotI克隆至YKVGS001载体中，抽提质粒以进行进一步转染。

[0126] 使用生长快速、细胞形态状态良好的Expi 293细胞作为转染宿主进行大体积转染，转染前调整种子细胞的活细胞密度为每毫升3百万个，每个项目使用20mL的细胞液进行转染。每个项目使用20μg质粒和100μg的PEI MAX转染试剂，分别使用600μL OPM‑293CD05培养基稀释，轻柔混匀，然后将稀释后的转染试剂轻柔滴加到稀释的质粒中，室温静置孵育8分钟以制备质粒复合物。孵育结束后将制备的质粒复合物缓慢滴入待转染的细胞液中，并将细胞液放置于37℃，8％CO2的摇床中以200rpm的转速进行培养。转染后18‑24小时后，在每瓶转染细胞中分别加入10％培养体积的BalanCD CHO Feed 4(0.8X)(V/V)，并每天监测细胞状态，通常转染周期为4天，第4天收获细胞培养液上清进行表达量的测定并转移至纯化工段进行纯化。

[0127] 实施例3：RSV F蛋白突变体的纯化

[0128] 将收获后的细胞上清，调节pH至5.0，使用一次性0.22μm无菌滤头过滤；将过滤后的上清样品，使用Binding Buffer‑1(20mM柠檬酸/柠檬酸钠，pH＝5.0)稀释以降低体系盐浓度，稀释后上清以1ml/min的流速上样至SP强阳离子交换层析柱(Binding Buffer‑1预平衡)。采用两步洗脱方式进行目的蛋白的洗脱和收集：1，15％ Elution Buffer‑1(20mM柠檬酸/柠檬酸钠，ph＝5.0，1M NaCl)，1ml/min,10min；2,100％ Elution Buffer‑1，1ml/min，20min。洗脱后的样品进行SDS‑PAGE电泳检测目的蛋白洗脱位置。根据SDS‑PAGE电泳结果，选取含目的蛋白的组分，浓缩至较小体积后使用Binding buffer‑2(20mM PB，ph＝7.0)稀释至低盐及ph～7.0，以3ml/min的流速上样至Q强阴离子交换层析柱(NmTrap 26/100,UniGel‑80Q，采用三步洗脱方式进行目的蛋白洗脱并收集：1，5％ Elution buffer‑2(20mM PB，ph＝7.0，1M NaCl)，5ml/min冲洗至纯化设备电导检测值和紫外吸收值稳定；2，35％ Elution buffer‑2,5ml/min冲洗至纯化设备电导检测值和紫外吸收值稳定；3，100％Elution buffer‑2,5ml/min冲洗至纯化设备电导检测值和紫外吸收值稳定。洗脱后的样品进行SDS‑PAGE电泳检测目的蛋白洗脱位置，选取目的片段Elution组分，使用超滤管进行超滤浓缩(30kD,4000rpm)，浓缩后使用Buffer‑3(1*PBS ph＝7.4，200mM NaCl，0.01％ TWEEN80)预平衡的HiLoadTM 16/600Superdex 200pg进行分子排阻层析纯化。选取目的片段Elution组分，使用30kD超滤管浓缩至1mg/ml用于后续目标蛋白的质量研究。

[0129] 所选代表性RSV F突变体YK001Ag228的纯化结果如图8所示，经纯化后可得到色谱峰较为单一且电泳纯度较高的目的蛋白。

[0130] 实施例4：RSV F蛋白突变体表达量和稳定性测定(用单克隆抗体D25检测RSV F蛋白突变体的目的蛋白含量)

[0131] 本发明实施例2中收获的细胞上清经一次性0.22μm无菌滤头过滤后分装，分装的样品直接检测上清目的蛋白表达量或者置于37℃恒温箱中进行高温条件下样品的稳定性TM考察，稳定性考察的取样点为0天、1天、3天、7天，使用基于生物膜光干涉原理的gator 分子互作检测仪，通过测试RSV融合前体特异性识别单克隆抗体D25与RSV F突变体的结合速率计算细胞表达上清及稳定性考察样品中目的蛋白的含量。

[0132] 具体试验参数为：proteinA探针平衡50S后，捕获D25单抗(浓度稀释至20μg/ml)至约4纳米，平衡120S后与RSV F蛋白突变体的细胞表达上清进行结合反应200S，然后进行120S解离反应，测试设计的RSV F蛋白突变体与D25单抗的结合情况。基于浓度已知的标准品建立的标准曲线计算目的蛋白的含量。

[0133] 在一些实施例中，所选RSV F蛋白突变体的表达量测定结果如表1和图2所示，稳定性考察结果如表2、图4、图5、图6所示，经本发明所述的氨基酸突变设计后，多个RSV F突变体通过与D25抗体的结合测定的表达量均高于对照分子，且多数RSV F蛋白突变体能够稳定呈现融合前体构象，经37℃放置7天后，多数RSV F蛋白突变体仍能与D25单抗维持较高的结合活性。

[0134] 表2示例性RSV F蛋白突变体的稳定性考察

[0135]

[0136]

[0137] “/”表示没有活性；“*”表示没有检测

[0138] 并且，由图4可知，对比YK001Ag180与YK001Ag171的表达量及稳定性数据可知E60L突变可以显著增加RSV F蛋白突变体的表达量及稳定性。对比YK001Ag225与YK001Ag180的表达量及稳定性数据可知S509D和L512Q突变可以显著增加RSV F蛋白突变体的表达量及稳定性。

[0139] 由图5可知，对比YK001Ag159与YK001Ag206的表达量及稳定性数据可知N67F突变可以显著增加RSV F蛋白突变体的稳定性。

[0140] 由图6可知，所选含Q210P、S211P、S213P、I214P、位置215与位置216间插入脯氨酸(简称S215InsertP)、I217P氨基酸突变的RSV F蛋白突变体均表现出较好的表达量及稳定性。

[0141] 实施例5：使用免疫印迹法分析所选RSV F蛋白突变体的目的蛋白分子量

[0142] 为了确定RSV F蛋白突变体瞬转细胞表达上清中目的蛋白的含量和分子量，对瞬转细胞表达上清进行蛋白凝胶电泳(SDS‑PAGE)和免疫印迹分析。

[0143] 样品准备：取40μl样品，按比例加入10μl 5×非还原SDS‑PAGE上样缓冲液，100℃金属浴加热15分钟。

[0144] 电泳：待样品冷却至室温后，采用4％‑20％型预制胶电泳分离蛋白样品，上样量为5μl，电压为180V，时间为40min。

[0145] 转膜：将PVDF膜在甲醇中浸泡5min，电泳后的SDS‑PAGE凝胶用去离子水漂洗。由负极到正极，按照转移衬垫、转印滤纸、SDS‑PAGE凝胶、PVDF、转印滤纸、转移衬垫组成转移三明治。在冰浴下，以电流为300mA转模40min，将蛋白转移到PVDF膜上。

[0146] 封闭：转移后的PVDF膜置于封闭液(5％脱脂奶粉‑PBST溶液)中，封闭膜上的疏水结合位点，室温摇床孵育40min。

[0147] 一抗孵育：小鼠免疫后的血清用封闭液稀释4000倍作为一抗，PVDF膜弃去封闭液后立即加入稀释后的一抗，5±3℃过夜孵育。回收一抗，PBST清洗PVDF膜除去未结合的一抗，清洗三次，每次5分钟。

[0148] 二抗孵育：山羊抗鼠的酶标IgG抗体用封闭液稀释5000倍作为二抗，PVDF膜弃去PBST后立即加入稀释后的二抗，室温摇床孵育1小时。回收二抗，PBST清洗PVDF膜除去未结合的二抗，清洗三次，每次5分钟。

[0149] DAB显色：DAB显色，室温孵育3分钟后，用蒸馏水洗涤2次终止显色反应，拍照留档。

[0150] 在一些实施例中，所选RSV F蛋白突变体的免疫印迹分析结果如图3所示，所述RSV F蛋白突变体均包含分子量符合预期的目的蛋白。

[0151] 实施例6：所选融合前RSV F突变体的颗粒大小分布分析

[0152] 为分析所设计RSV F蛋白突变体的大小分布，本实验采用SEC‑HPLC法，对经一步SP纯化的样品进行分析。具体实施方法为：色谱柱为Agilent Bio SEC‑3(3μm， 4.6*300mm)，检测波长为280nm，流动相为1×PBS，流速为0.4ml/min，进样量10μl，等度洗脱
15min。其中供试品溶液的配制如下：取50μl样品于1.5ml离心管中，10000rpm离心1min后取上清于含内插管的液相小瓶中，备用。蛋白按照待测组分的分子大小进行洗脱分离。

[0153] 本发明所述RSV F突变体单体分子量约为53KDa，如图7所示，所选RSV F突变体出峰保留时间介于分子量为158KDa的γ‑球蛋白和分子量为670KDa的甲状腺球蛋白之间，证实了本发明所述RSV F突变体为三聚体构象。

[0154] 实施例7：所选融合前RSV F蛋白突变体的结构热稳定性

[0155] 为考察所设计RSVF蛋白突变体的热力学稳定性，本实验通过Prometheus Panta评估抗原的粒径和热变性。具体实施方法为：取50μl供试品，8℃ 15000g离心10min后加载进毛细管(厂家：Nano Temper，货号：PR‑C002)，装入托盘，每个供试品3个复孔，选择设备软件中的Thermal Unfolding模块，起始温度25℃，终止温度95℃，升温速率1℃/min进行升温检测。

[0156] 代表性RSV F蛋白突变体结构热稳定性考察结果如表3所示，各突变体初始变性稳度(Tm1)均高于60℃，证明了各突变体蛋白均具有优异的结构热稳定性。

[0157] 表3示例性RSV蛋白突变体结构稳定性数据

[0158]

[0159] *表示均值，σ*表示方差

[0160] 实施例8：呈融合前构象的稳定的RSV F蛋白突变体在小鼠中免疫应答

[0161] 为了研究本发明所提供的RSV F蛋白突变体的免疫原性，本发明的发明人制成了含不同设计RSV F蛋白突变体的疫苗组合物(0.5ml/剂)，每种组合物均含有RSV F突变体蛋白和铝佐剂。组别信息具体见表4。在SPF级雌性6‑8周龄BALB/c小鼠中对各组别疫苗组合物进行免疫原性考察，每组6只小鼠，共5组。免疫方式为肌肉注射小鼠大腿内侧，注射体积为50μl/剂/只(1/10人拟用剂量)。每只小鼠共免疫2次，免疫间隔为3周。在第二次免疫后四周分别对各组小鼠进行采血，分离血清。通过ELISA检测血清中针对F蛋白的IgG抗体滴度(图
9‑A)；通过基于野生型A型和B型活病毒的中和实验检测血清中和抗体滴度(图9‑B/C)。

[0162] 表4含不同设计RSV F蛋白突变体的疫苗组合物制剂处方

[0163]

[0164] 与空白佐剂组(组别1)相比，各实验组别小鼠第二次免疫后四周的血清均能检测到高水平的针对F蛋白的结合抗体，且各试验组别小鼠血清均能高效中和A型和B型野生型活病毒在体外细胞中的复制，表明本发明所提供的RSV F蛋白突变体有优异的免疫原性，且其作为疫苗产品使用时能够诱导产生针对A/B两种毒株的交叉保护。

[0165] 以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。