[0001] 本发明涉及蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒融合前F蛋白改造抗原多肽及其应用。

[0002] 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是下呼吸道感染（Lower respiratory tract infections，LRTI）的主要病毒，常引发肺炎和细支气管炎。人类感染呼吸道合胞病毒的年龄曲线呈U型，婴幼儿和老年人的发病率最高。大多数成年人曾在幼年时期感染过RSV，但感染后的免疫保护效应不能持续、完整地维持。

[0003] RSV属于副粘病毒科，肺病毒属，病毒表面有包膜，基因组为单股负链RNA。RSV病毒粒子表面有3种蛋白，分别是小疏水蛋白(small  hydrophobic，SH)、附着糖蛋白(attachment glycoproteins，G)和融合蛋白(fusion glycoproteins，F)。G蛋白的主要功能是与宿主细胞表面受体结合，是RSV分离株中突变率最高的结构蛋白。依据RSV G蛋白序列的突变和进化将RSV分成了两个亚型，RSV A型和RSV B型。近年来，RSV A和RSV B的感染发生率趋于相近，且两者可以在同一地区共同循环。F蛋白主要介导病毒膜与细胞膜发生融合，且人和动物感染RSV后产生的中和抗体主要针对F蛋白。F蛋白是RSV疫苗的关键靶点，然而F蛋白趋于从亚稳态的融合前（prefusion，pre‑F）构象变成融合后的融合后构象（postfusion，post‑F），而针对post‑F的抗体中和活性较低。因此RSV疫苗设计的关键点在于使F蛋白能够以pre F的形式存在，并且保持pre F的稳定状态。

[0023] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0024] 以下实施例中所涉及的实验方法，若无特别提及，均为本领域常规方法，例如可参照本领域的实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0025] 以下实施例中所涉及的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0026] 以下实施例中RSV F蛋白无活性前体F0（未经突变的野生型序列，SEQ ID NO.1）全长574个氨基酸，包含两个弗林酶切位点。其在成熟过程中被切割成四个多肽，分别为信号肽（1‑25位氨基酸）、F2（26‑109位氨基酸）、p27（110‑126位氨基酸）和F1（127‑574位氨基酸）。随后，F2和FI非共价结合成F蛋白单体，3个F蛋白单体结合形成三聚体。其中，多肽F2 N端含疏水性融合肽（137‑157位氨基酸），C端含胞内区（551‑574位氨基酸）和跨膜区（530‑550位氨基酸）。

[0027] 术语“D25”是指CN101778866B中所述的抗体,其具体的氨基酸序列参考说明书中序列1‑8。单抗D25特异性结合pre F的ф表位，而不与post F结合。

[0028] 术语“Mota”或“Motavizumab”是指WO2007002543A2中所述的抗体，其具体序列参考其专利说明书中抗体A4B4L 1FR‑S28R （Motavizumab）的氨基酸序列（序列编号48和11）。Motavizumab与pre F和post F均会发生结合。

[0029] 术语“AM14”是参照CN101778866B中所述的抗体，具体序列参考该专利说明书实施例4中所述的AM14的氨基酸序列。AM14特异性结合pre F三聚体。

[0030] 实施例1RSV pre F改造抗原稳定突变位点的筛选

[0031] 1、序列模板sc‑F0结构特征：为了使RSV F可溶表达稳定的三聚体，将RSV F0前体蛋白的氨基酸序列（序列如GenBank: AAB86664.1）初步改造为sc‑F0，以此为对照模板进一步点突变筛选有利于形成稳定融合前三聚体的突变位点。sc‑F0改造方法如下：截取F0前体的1‑513位氨基酸以促进蛋白分泌表达；
用连接子（序列GS）替代F0序列中的104‑144位氨基酸序列（序列NNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGV）使F0形成可以正确折叠的单链；
在F0的513位氨基酸序列后加有利于形成三聚体的T4 fibritin基序（序列
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLL，序列来源NCBI Reference Sequence: WP_371335556.1，458G‑
480L），F0胞外区和T4 fibritin基序间加连接子（序列SAIG）；
在T4  fibritin基序C端连接Twin‑Strep‑tag  Ⅱ（序列
SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK）以便后续纯化，中间加连接子（序列GA）和肠激酶切割位点（序列DDDDK）。

[0032] 2、质粒构建与转染表达：（1）以sc‑F0为模板进行突变位点筛选，合成可溶性F蛋白突变体基因并克隆至
pEE12.4质粒上，使用CHO‑K1细胞表达系统进行蛋白表达。

[0033] （2）使用含4 mM谷氨酰胺的Ex‑Cell Advanced CHO Fed‑batch培养基悬浮培养CHO‑K1细胞，培养条件为37℃、5% CO2、70%相对湿度及120 rpm。转染前一天将细胞传代，继续培养12‑16 h后进行转染。

[0034] （3）转染时用HyCell TransFx‑C培养基将细胞密度调整为1×107viable cells/mL，先后加入质粒和PEI 40000转染试剂，迅速混匀。将细胞置于二氧化碳振荡培养箱中培养1 h后加入含4 mM谷氨酰胺的Ex‑Cell Advanced CHO Fed‑batch培养基，将细胞稀释至3×106 cells/mL继续培养。转染一天后，加入含4 mM谷氨酰胺的Ex‑Cell Advanced CHO Fed‑batch培养基继续培养细胞。转染两天后用Cell Boost 7a和Cell Boost 7b补料培养基补料培养，继续培养3天后收获细胞培养液，800×g离心10 min去细胞，获得的上清液用ELISA检测各个质粒的表达量和融合前构象稳定情况。

[0035] 3、ELISA检测：将捕获抗体Motavizumab用PBS稀释至1 μg/mL，每孔100 μL加入至96孔平底透明高吸附酶标板中，封板膜封好后4℃孵育过夜。弃去板中包被液，每孔加入300 μL PBST清洗，重复3次。每孔加入 100 μL封闭液，37℃孵育1 h 后洗板。将收获的各个上清
10倍稀释后加入酶标板中，每个样品设3个复孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h 后洗板。将检测抗体D25‑HRP、AM14‑HRP和α‑Strep tag pAb‑HRP稀释后加入酶标板中，每孔100 μL，37℃孵育1 h 后洗板。每孔加入100 μL TMB单组分显色液后，室温暗处反应5‑10 min。随后每孔加入50 μL ELISA终止液终止反应。使用酶标仪读取每孔的OD450值，取各上清样品的平均值进行比较。

[0036] 4、检测结果如表1所示，其中突变体M1（A74C, E218C）可以提高与单抗AM14的结合，同时也可以提高与单抗D2和抗体α‑Strep tag的结合，说明此突变不仅可以有效提高三聚体pre F蛋白的正确折叠效率，同时还可以提高F蛋白的总表达效率。突变体M2 （A153C, K461C）只提高了与单抗AM14的结合，大幅降低了与单抗D2和抗体α‑Strep tag的结合。突变体M4（V157C, N183C）、M8 （E487P）、M10（K75G）和M11（N496A）同时提高了与单抗D2和抗体α‑Strep tag的结合，即同时提高了pre F蛋白的正确折叠效率和F蛋白的总表达效率。后续将筛选到的有利于pre F构象稳定的突变进行组合后进一步评价。

[0037] 表1 RSV pre F蛋白改造抗原多肽稳定突变位点及表达结果

[0038] 实施例2 RSV pre F改造抗原稳定突变位点组合的筛选

[0039] 本发明将实施例1中的阳性克隆位点进行组合，构建新的表达质粒后转染CHO‑K1细胞进行表达。细胞转染后补料培养7天后收取细胞上清用ELISA进行检测。ELISA检测时，各个上清3倍连续稀释后加入酶标板中进行检测。酶标仪读取OD450值，绘制样品稀释度‑OD450值曲线。构建的RSV pre F蛋白稳定突变位点组合的质粒见表2，ELISA检测结果见图1。结果显示，组合DS2‑2表达的RSV F蛋白与D25和AM14有更强的结合，表明DS2‑2更能有效折叠成pre F的构象，后续将对DS2‑2进行进一步评价。

[0040] 表2. RSV pre F蛋白改造抗原多肽稳定突变位点组合

[0041] 实施例3 DS2‑2的相关研究验证

[0042] 1、DS2‑2的大量表达与纯化

[0043] 本发明将质粒pEE12.4‑DS2‑2转染CHO‑K1细胞进行DS2‑2的大量表达。转染两天后用Cell Boost 7a、Cell Boost 7b补料培养基和45%葡萄糖溶液进行补料分批培养。培养14天后收获细胞培养液，800×g离心10 min去细胞，上清液再次10,000×g离心10 min去细胞碎片，获得的上清液用于后续亲和层析纯化。

[0044] 将StrepTrap HP亲和层析柱安装在GE AKTA蛋白纯化仪上。使用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，将上清液经0.45μm滤膜过滤后缓慢加载至层析柱中。使用10倍柱体积的平衡缓冲液洗脱杂蛋白并再次平衡层析柱后，用6倍柱体积的洗脱液洗脱目的蛋白。将含有目的蛋白的洗脱液使用截留分子量为50 kD的超滤管进行浓缩，并将溶液替换为PBS。同时表达和纯化sc9‑10 DS‑Cav1(Joyce, Zhang et al. 2016)作为对照。使用NanoDrop对纯化得到的蛋白定量后进行SDS‑PAGE鉴定。电泳结果如图2所示，DS2‑2在还原条件下的单体F蛋白与已报道的sc9‑10 DS‑Cav1条带大小一致。

[0045] 2、DS2‑2储存稳定性研究

[0046] 本发明将DS2‑2分别于4℃、25℃和37℃条件下放置30天或者反复冻融5次，用ELISA检测与单抗D25的结合情况。

[0047] ELISA试验方法如下：将各条件处理后DS2‑2用PBS稀释至1 μg/mL，同时设置1 μg/mL和0.5 μg/mL新鲜解冻的DS2‑2分别作为稳定对照和不稳定对照。每孔100 μL加入至96孔平底透明高吸附酶标板中，封板膜封好后4℃孵育过夜。弃去板中包被液，每孔加入300 μL PBST清洗，重复3次。每孔加入 100 μL 封闭液，37℃孵育 1 h 后洗板。将单抗D25或AM14进行3倍连续稀释后加入酶标板中，每孔100 μL，37℃孵育1 h后洗板。将二抗Rabbit Anti‑Human IgG H&L (HRP)稀释后加入酶标板中，每孔100 μL，37℃孵育1 h 后洗板。每孔加入100 μL TMB单组份显色液后，室温暗处反应5‑10 min。随后每孔加入50 μL ELISA终止液终止反应。使用酶标仪读取每孔的OD450值，然后绘制单抗浓度‑OD450值抗原抗体结合曲线。

[0048] 结果如图3所示，与单抗D25的结合曲线结果中，37℃或者4℃放置30天与新鲜解冻的DS2‑2的检测得到的曲线基本重合；DS2‑2在‑80/37℃条件下反复冻融5次后，其结合曲线也与新鲜冻融的DS2‑2曲线基本重合；而室温放置30天后，其结果低于新鲜解冻的DS2‑2的结合曲线，但仍明显高于0.5 μg DS2‑2（即50%）包被检测的结合曲线。单抗AM14与D25检测的结果基本一致，DS2‑2在室温放置30天影响其与AM14的结合，其他条件均未产生影响。结果表明，DS2‑2可以在37℃或者4℃稳定储存30天以上，反复冻融5次也不会对其pre F构象产生影响，而室温放置30天，仍可保留其50%以上活性。综上，DS2‑2蛋白稳定性良好，能够使其pre F构象保持稳定。

[0049] 3、小鼠免疫评价

[0050] 本发明选择6‑周的雌性BALB/c小鼠，每组5只。将前述获得的DS2‑2和sc9‑10 DS‑Cav1分别用PBS稀释至200 μg/mL，并与等体积的MF59佐剂（艾伟拓，C01001）混合。通过肌肉注射方式免疫小鼠，每只注射100 μL（10 μg抗原，50 μL MF59），免疫时间分别为第0天和第21天。第35天采血进行小鼠，血液在室温下静置4 h，待血液分层后，8,000×g离心10 min后取上层血清进行中和抗体检测。

[0051] 中和抗体滴度检测方法如下：将Vero细胞接种在96孔板中，培养细胞长至单层细胞。血清56℃水浴锅孵育30 min灭活补体，用含2% FBS的MEM培养基梯度稀释，加入RSV strain A2或strain18537病毒液混合，将混合液放置在37℃孵育1 h。将病毒‑血清混合液加入至Vero细胞培养板中37℃培养继续48 h。将细胞培养上清弃去，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，用PBS将细胞清洗3次。每孔加50 μL 0.1% TritonX‑100破膜处理10 min，用PBS清洗3次。每孔50 μL加入5% BSA封闭1 h，用PBS清洗3次。随后，加入RSV F蛋白特异性抗体Motavizumab‑FITC室温孵育2 h，PBS清洗3次。每孔重新加入100 μL PBS，将细胞培养板避光保存。使用荧光显微镜观察并记录细胞培养板中每孔荧光情况，统计并计算结果。

[0052] 结果如表1和图4所示，RSV strain A2检测的中和抗体滴度结果中，DS2‑2诱导产生的中和抗体滴度显著高于对照的sc9‑10 DS‑Cav1，DS2‑2中和抗体几何平均滴度（GMT）是sc9‑10 DS‑Cav1的2.4倍。而在RSV strain 18537检测的中和抗体滴度结果中，DS2‑2诱导产生的中和抗体滴度也高于sc9‑10 DS‑Cav1，DS2‑2的GMT为sc9‑10 DS‑Cav1的2.4倍。小鼠体内免疫评价结果表明，DS2‑2相比于sc9‑10 DS‑Cav1能够同时诱导针对RSV strain A2和RSV strain 18537更高滴度的中和抗体水平，具有更理想的结构和免疫原性。

[0053] 表3 中和抗体滴度

[0054] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。