技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一种川木通的鉴别方法。
相关背景技术
[0002] 中药川木通为毛茛科植物小木通（Clematis armandii Franch.）或绣球藤（Clematis montana Buch.‑Ham.）的干燥藤茎，具有利尿通淋、清心除烦与通经下乳的功效。川木通主产于四川、贵州、云南和西藏等地区，野生资源丰富，是较为常用的中药。川木通具有很高的药用价值和开发价值且毒性小，但是川木通藤茎外观和木通科植物木通或白木通的藤茎外观相似度高且名称易混，导致常规鉴别困难，造成市场流通混乱，带来安全隐患。
[0003] 由于DNA是稳定的遗传物质，且不同物种的DNA差别较大，故而近年来，常常通过聚合酶链反应技术（PCR）技术扩增特定基因，并通过序列对比等手段来鉴别药材真伪。虽然PCR扩增技术已较为成熟，但是其受有机溶剂、蛋白质等多种因素的影响，所以该项技术对DNA模板的纯度和浓度要求较高。因此，急需提供一种可以解决上述问题的鉴别川木通的方法。
具体实施方式
[0026] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 本实施例提供一种改性磁珠的制备方法，包括以下步骤：B1、先使用氮气对50mL去离子水进行脱气处理20‑40min，除去溶剂中溶解的氧；然后加入5.56g FeSO4·7H2O和2.7g FeCl3·6H2O，在70℃下加热搅拌溶解，接着边搅拌边加入浓度为1mol/L的NaOH溶液，调节pH至12，溶液逐渐变为黑色，继续保持20min；最后，用磁铁进行固液分离，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，再用磁铁进行分离，即得到磁性纳米颗粒；
B2、将0.5g磁性纳米颗粒分散在1.5L Tris‑HCl缓冲溶液（pH=8.5）中得到磁性纳米颗粒分散液；向磁性纳米颗粒分散液中加入1g多巴胺，室温下搅拌6h，用磁铁进行固液分离，洗涤，得到聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒；
B3、将10g尿素和5g柠檬酸钠混合并研磨均匀，得到混合物，然后将所述混合物在
150℃下加热反应1h，反应结束后离心，透析18h，冷冻干燥，得到纯化的氮化碳量子点；
B4、将1g氮化碳量子点和1g植酸加入100mL去离子水中，搅拌均匀，升温至60℃反应1h，离心、洗涤、干燥，得到植酸改性氮化碳量子点复合物；
B5、将0.5g聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒分散在500mL去离子水中，得到分散液；将
0.45g植酸改性氮化碳量子点复合物加入400mL去离子水中，然后加入所述分散液，搅拌反应1h，用磁铁进行固液分离、洗涤、干燥，得到接枝有磷酸基团的磁珠；
B6、将300mg接枝有磷酸基团的磁珠浸没在浓度为80mmol/L的氯化铁水溶液中，反应12h，反应结束后用磁铁进行固液分离，洗涤、干燥，得到改性磁珠。
[0029] 实施例2
[0030] 本实施例提供一种改性磁珠的制备方法，包括以下步骤：B1、先使用氮气对50mL去离子水进行脱气处理20‑40min，除去溶剂中溶解的氧；然后加入5.64g FeSO4·7H2O和2.7g FeCl3·6H2O，在80℃下加热搅拌溶解，接着边搅拌边加入浓度为1mol/L的NaOH溶液，调节pH至12，溶液逐渐变为黑色，继续保持30min；最后，用磁铁进行固液分离，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，再用磁铁进行分离，即得到磁性纳米颗粒；
B2、将1g磁性纳米颗粒分散在1.7L Tris‑HCl缓冲溶液（pH=8.5）中得到磁性纳米颗粒分散液；向磁性纳米颗粒分散液中加入1.6g多巴胺，室温下搅拌8h，用磁铁进行固液分离，洗涤，得到聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒；
B3、将10g尿素和6.9g柠檬酸钠混合并研磨均匀，得到混合物，然后将所述混合物在180℃下加热反应2h，反应结束后离心，透析24h，冷冻干燥，得到纯化的氮化碳量子点；
B4、将1.1g氮化碳量子点和1.6g植酸加入110mL去离子水中，搅拌均匀，升温至75℃反应1.5h，离心、洗涤、干燥，得到植酸改性氮化碳量子点复合物；
B5、将0.5g聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒分散在500mL去离子水中，得到分散液；将
0.58g植酸改性氮化碳量子点复合物加入400mL去离子水中，然后加入所述分散液，搅拌反应3h，用磁铁进行固液分离、洗涤、干燥，得到接枝有磷酸基团的磁珠；
B6、将300mg接枝有磷酸基团的磁珠浸没在浓度为100mmol/L的氯化铁水溶液中，反应15h，反应结束后用磁铁进行固液分离，洗涤、干燥，得到改性磁珠。
[0031] 实施例3
[0032] 本实施例提供一种改性磁珠的制备方法，包括以下步骤：B1、先使用氮气对50mL去离子水进行脱气处理20‑40min，除去溶剂中溶解的氧；然后加入5.73g FeSO4·7H2O和2.7g FeCl3·6H2O，在70‑90℃下加热搅拌溶解，接着边搅拌边加入浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH至12，溶液逐渐变为黑色，继续保持40min；最后，用磁铁进行固液分离，得到黑褐色有磁性的固体，再用蒸馏水洗涤数次至中性，再用磁铁进行分离，即得到磁性纳米颗粒；
B2、将1.5g磁性纳米颗粒分散在2L Tris‑HCl缓冲溶液（pH=8.5）中得到磁性纳米颗粒分散液；向磁性纳米颗粒分散液中加入2g多巴胺，室温下搅拌10h，用磁铁进行固液分离，洗涤，得到聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒；
B3、将10g尿素和8g柠檬酸钠混合并研磨均匀，得到混合物，然后将所述混合物在
200℃下加热反应3h，反应结束后离心，透析30h，冷冻干燥，得到纯化的氮化碳量子点；
B4、将1.3g氮化碳量子点和2g植酸加入120mL去离子水中，搅拌均匀，升温至90℃反应2h，离心、洗涤、干燥，得到植酸改性氮化碳量子点复合物；
B5、将0.5g聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒分散在500mL去离子水中，得到分散液；将
0.625g植酸改性氮化碳量子点复合物加入400mL去离子水中，然后加入所述分散液，搅拌反应4h，用磁铁进行固液分离、洗涤、干燥，得到接枝有磷酸基团的磁珠；
B6、将300mg接枝有磷酸基团的磁珠浸没在浓度为120mmol/L的硫酸铁水溶液中，反应18h，反应结束后用磁铁进行固液分离，洗涤、干燥，得到改性磁珠。
[0033] 对比例1与实施例2相比，对比例1中改性磁珠表面不含氮化碳量子点，直接将植酸与聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒反应，其他步骤及原料同步实施例2。
[0034] 对比例2与实施例2相比，对比例2中改性磁珠为聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒，其他步骤及原料同步实施例2。
[0035] 实施例4
[0036] 一种川木通的鉴别方法，包括以下步骤：S1、提取待检测样品的DNA；具体操作步骤为：
A1、使用液氮研磨将待检测样品粉碎；
A2、将粉碎后的待检测样品加入裂解液中在65℃下裂解10min，离心5min，取上清液；裂解液为：0.5％CTAB，0.1mol/L Tris‑HCl pH8.0，0.01mol/L EDTA pH8.0，1mol/L氯化钾，1.5％PVP40；
A3、向上清液中加入等体积的磁珠结合液，混合均匀后室温静置1min，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；磁珠结合液的制备方法为：将实施例2制备的平均粒径为430nm改性磁珠与异丙醇、PEG8000混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中改性磁珠的终浓度为2mg/mL，异丙醇的终浓度为80％，PEG8000的终浓度为10％；
A4、将洗涤液加入步骤A3中的磁珠中清洗2遍，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；洗涤液为0.01mol/L Tris‑HCl pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，75％乙醇，用超纯水定容；
A5、加入洗脱液洗脱吸附在改性磁珠上的DNA，65℃水浴5min，间或混匀，磁分离，小心取上清液至新的离心管，获得纯化的DNA；洗脱液为：0.01mol/L Tris‑HCl pH8.0，
0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
[0037] S2、以待检测样品的DNA为模版进行PCR扩增；PCR扩增反应在PCR反应管中进行，反应总体积为25μL，包括以下试剂：2.5μL 10×PCR反应缓冲液，1.5μL浓度为2.5mM的dNTP，2.0μL浓度为25mM的MgCl2，1μL浓度为10μg/mL的上游引物，1μL浓度为10μg/mL的下游引物，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶(Takara公司，5U/μL)，1μL待检测样品DNA，无菌双蒸水补足至25μL；上游引物为：5’‑TGCCCAGCCTGCACAAGA‑3’；下游引物为：5’‑TGCCCAGCCTCAACAGTGT‑3’；
PCR反应液配置完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体进行如下反应：95℃预变性5min，95℃变性35s，58℃复性30s，72℃延伸35s，30个循环，然后在
72℃下保持6min，获得扩增产物；
S3、对扩增产物进行电泳检测，取5μL扩增产物和10×加样缓冲液，采用2％的琼脂糖凝胶（含0.005%的溴化乙锭）检测扩增结果，如果获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品为川木通；若没有获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品不是川木通。
[0038] 实施例5
[0039] 一种川木通的鉴别方法，包括以下步骤：S1、提取待检测样品的DNA；具体操作步骤为：
A1、使用液氮研磨将待检测样品粉碎；
A2、将粉碎后的待检测样品加入裂解液中在65℃下裂解20min，离心7min，取上清液；裂解液为：1％CTAB，0.1mol/L Tris‑HCl pH8.0，0.016mol/L EDTA pH8.0，1.3mol/L氯化钾，1.5％PVP40；
A3、向上清液中加入等体积的磁珠结合液，混合均匀后室温静置1‑5min，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；磁珠结合液的制备方法为：将实施例2制备的平均粒径为430nm改性磁珠与异丙醇、PEG8000混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中改性磁珠的终浓度为3.7mg/mL，异丙醇的终浓度为70％，PEG8000的终浓度为
15％；
A4、将洗涤液加入步骤A3中的磁珠中清洗2遍，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；洗涤液为0.01mol/L Tris‑HCl pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，75％乙醇，用超纯水定容；
A5、加入洗脱液洗脱吸附在改性磁珠上的DNA，65℃水浴10min，间或混匀，磁分离，小心取上清液至新的离心管，获得纯化的DNA；洗脱液为：0.015mol/L Tris‑HCl pH8.0，
0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
[0040] S2、以待检测样品的DNA为模版进行PCR扩增；PCR扩增反应在PCR反应管中进行，反应总体积为25μL，包括以下试剂：2.5μL 10×PCR反应缓冲液，1.5μL浓度为2.5mM的dNTP，2.0μL浓度为25mM的MgCl2，1μL浓度为10μg/mL的上游引物，1μL浓度为10μg/mL的下游引物，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶(Takara公司，5U/μL)，1μL待检测样品DNA，无菌双蒸水补足至25μL；上游引物为：5’‑TGCCCAGCCTGCACAAGA‑3’；下游引物为：5’‑TGCCCAGCCTCAACAGTGT‑3’；
PCR反应液配置完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体进行如下反应：95℃预变性5min，95℃变性35s，58℃复性30s，72℃延伸35s，30个循环，然后在
72℃下保持6min，获得扩增产物；
S3、对扩增产物进行电泳检测，取5μL扩增产物和10×加样缓冲液，采用2％的琼脂糖凝胶（含0.005%的溴化乙锭）检测扩增结果，如果获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品为川木通；若没有获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品不是川木通。
[0041] 实施例6
[0042] 一种川木通的鉴别方法，包括以下步骤：S1、提取待检测样品的DNA；具体操作步骤为：
A1、使用液氮研磨将待检测样品粉碎；
A2、将粉碎后的待检测样品加入裂解液中在70℃下裂解30min，离心10min，取上清液；裂解液为：1.5％CTAB，0.1mol/L Tris‑HClpH8.0，0.02mol/L EDTApH8.0，1.4mol/L氯化钾，1.2％PVP40；
A3、向上清液中加入等体积的磁珠结合液，混合均匀后室温静置5min，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；磁珠结合液的制备方法为：将实施例2制备的平均粒径为430nm改性磁珠与异丙醇、PEG8000混合，用超纯水定容，即得磁珠结合液；所述磁珠结合液中改性磁珠的终浓度为5mg/mL，异丙醇的终浓度为75％，PEG8000的终浓度为15％；
A4、将洗涤液加入步骤A3中的磁珠中清洗2遍，通过外加磁力将改性磁珠和液体分离，弃上清液；洗涤液为0.01mol/L Tris‑HCl pH8.0，0.001mol/L EDTA pH8.0，75％乙醇，用超纯水定容；
A5、加入洗脱液洗脱吸附在改性磁珠上的DNA，65℃水浴10min，间或混匀，磁分离，小心取上清液至新的离心管，获得纯化的DNA；洗脱液为：0.015mol/L Tris‑HCl pH8.0，
0.001mol/L EDTA pH8.0，用超纯水定容。
[0043] S2、以待检测样品的DNA为模版进行PCR扩增；PCR扩增反应在PCR反应管中进行，反应总体积为25μL，包括以下试剂：2.5μL 10×PCR反应缓冲液，1.5μL浓度为2.5mM的dNTP，2.0μL浓度为25mM的MgCl2，1μL浓度为10μg/mL的上游引物，1μL浓度为10μg/mL的下游引物，0.2μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶(Takara公司，5U/μL)，1μL待检测样品DNA，无菌双蒸水补足至25μL；
上游引物为：5’‑TGCCCAGCCTGCACAAGA‑3’；
下游引物为：5’‑TGCCCAGCCTCAACAGTGT‑3’；
PCR反应液配置完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体进行如下反应：95℃预变性5min，95℃变性35s，58℃复性30s，72℃延伸35s，30个循环，然后在
72℃下保持6min，获得扩增产物；
S3、对扩增产物进行电泳检测，取5μL扩增产物和10×加样缓冲液，采用2％的琼脂糖凝胶（含0.005%的溴化乙锭）检测扩增结果，如果获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品为川木通；若没有获得大小约为478bp的目的条带，则所述待测中药样品不是川木通。
[0044] 对比例3与实施例4相比，对比例3将改性磁珠替换为对比例1制备的物质，直接将植酸与，其他步骤及原料同步实施例4。
[0045] 对比例4与实施例4相比，对比例4将改性磁珠替换为对比例2制备的物质，其他步骤及原料同步实施例4。
[0046] 性能检测将实施例4‑6和对比例3‑4步骤S1提取的待检测样品的DNA进行纯度和浓度检测：
取1μL提取的DNA用NanoDrop 2000型超微量分光光度计检测其浓度、A260/A280和A260/A230的比值，以评估提取DNA的质量和杂质去除情况，结果如表1所示。
[0047] 从表1数据可以看出，本发明提供的DNA提取方法提取到的DNA浓度和纯度高。对比实施例4和对比例3的数据可以看出，氮化碳量子点的添加可以提高DNA浓度和纯度。对比实施例4和对比例4的数据可以看出，通过在聚多巴胺包覆磁性纳米颗粒表面包覆络合有金属离子的氮化碳量子点可以显著提高提取DNA的浓度和纯度。
[0048] 在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0049] 以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
