技术领域
[0001] 本发明涉及大豆油体钙蛋白GmCLO1编码基因的应用，属于基因工程领域，具体地讲在大豆中过表达大豆油体钙蛋白GmCLO1基因增加对大豆花叶病毒的抗性。
相关背景技术
[0002] 大豆花叶病毒病是由大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)引起的严重病害。感染SMV的大豆，叶片表现出花叶，叶片卷曲，叶片畸型皱缩，褐斑种粒，荚畸形，单株荚数降低，株高降低，分支减少，生长延缓等症状。大豆对SMV的抗性分为抗侵染和抗扩展两种，抗侵染属于质量抗性或者垂直抗性，是一种极端抗性，病原物不能够侵染寄主。如果长期种植单一的抗性材料，经过一段时间后，抗性材料对病原物生理小种的选择压力较大，生理小种发生变异，产生越来越多的优势小种，使原本的抗性材料变成了感病材料，对新变异的小种或者株系缺乏抗性材料，造成田间抗性丧失。抗扩展属于数量抗性或水平抗性，是指病原物能够成功侵染寄主，并建立寄生关系，但是寄主能够对病原物产生防御反应，分泌抗毒素或者寄主能够抑制病原物的复制和扩散，降低病原物的繁殖，减少危害。具有数量抗性的品种不对病原物造成选择压力，不因丧失抗性而颗粒无收，在病害大爆发的情况下也能取得满意的产量。目前，发掘两种抗性机制相关的抗病基因，对提高大豆对SMV的抗性、培育抗病品种至关重要。
[0003] 前期通过分析SMV诱导的大豆转录组，发现GmCLO1强烈响应大豆花叶病毒SC7株系的诱导。GmCLO1属于大豆油体钙蛋白(caleosins)基因家族，编码的氨基酸序列中包含一个油体钙蛋白保守结构域。油体钙蛋白是一种与油体相关的蛋白质，在植物种子和营养组织中都能检测到。油体钙蛋白影响脂质代谢和油体稳定。利用RNA干扰技术降低大豆种子油体中一个24千道尔顿的油体蛋白含量，导致其他油体钙蛋白含量增加。拟南芥AtCLO1突变体种子胚胎中贮藏脂质分解延迟，液泡形态改变，液泡膜异常，液泡间相互作用减少。AtCLO3是一种钙依赖性蛋白激酶活性的叶油体钙蛋白亚型，强烈响应干旱、高盐度和ABA等非生物胁迫诱导，暗示AtCLO3可能参与了这些非生物胁迫的信号转导。水稻油体钙蛋白基因OsCLO5通过JA信号通路负调控耐寒性。GmCLO1在大豆中是否对大豆花叶病毒病具有抗性还未见报道。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
[0020] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
[0021] 实施例1GmCLO1基因响应大豆花叶病毒SC7株系的诱导表达
[0022] 种植感病品种南农1138‑2和抗病品种科丰1号，真叶期接种大豆花叶病毒SC7株系，取接种后0h、2h、8h、24h的大豆叶片组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，移至新的1.5mL EP管中，采用总RNA提取试剂盒提取叶片的总RNA(天根生化科技有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，分光光度计测定RNA含量。以大豆组成型表达的GmTubulin作为内部参照，以获得的总RNA为模板，按照日本TaKaRa公司提供的反转TM录试剂盒(TaKaRa Primer Script RT reagent kit，日本)的说明书进行反转录，得到cDNA第一链后，进行荧光定量PCR反应(Real‑time RT‑PCR)，检测GmCLO1基因在两个品种接毒处理后不同时间点的表达量变化发现，GmCLO1基因在两个品种各时间点都强烈响应大豆花叶病毒SC7株系的诱导，且在科丰1号中响应更强(图1)。GmTubulin引物序列为F：
ggagttcacagaggcagag和R：cacttacgcatcacatagc，GmCLO1基因的引物序列为F：
ttttgctgtccgttggaggt和R：tgtttgccgcgttggatatt。
[0023] 实施例2基因GmCLO1的基因工程应用
[0024] 1)大豆GmCLO1的克隆
[0025] 以Phytozome v13数据库中大豆参考基因组Wm82.a2.v1的Glyma.09g123800[0026] (GmCLO1)基因mRNA序列为模版，设计特异性引物，以上述获得的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸40秒，共35个循环，最后72℃保温5分钟。将PCR产物克隆至PUC19‑T载体中，测序后获得具有完整编码区的长度为615bp的大豆GmCLO1基因的CDS序列，其中编码区序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列见SEQ ID NO.2。扩增基因的引物序列为F：atggcttcttcaccttcctcag和R：
ctacttctctttgcctgaagagtg。
[0027] 2)植物表达载体的构建
[0028] 将GmCLO1基因序列从PUC19‑T重组载体中进行PCR扩增，利用重组法将GmCLO1连接到pBA002载体中，得到pBA002‑CLO1植物过表达载体，引物序列为F：ccgggcccaggcctacgcgtatggcttcttcaccttcctcag和R：cgatcggggaaattcgagctcctacttctctttgcctgaagagtg。植物转化载体pBA002含有2×35S强启动子，可强烈启动目的基因GmCLO1在受体中表达。然后通过冻融法将pBA002‑GmCLO1载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化法，转化大豆。
[0029] 根据网站CRISPR‑P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计了GmCLO1基因2个打靶位点的sgRNA，sgRNA1:ggagagaaacccattccact和sgRNA2:gttgcgtgaaatcgggactg。将2个sgRNA连接到pSC‑M载体上，重组载体转入大肠杆菌，涂板挑单克隆进行菌检和测序验证，得到正确的2个sgRNA序列，表明重组载体pSC‑M‑CLO1构建成功。然后通过冻融法将载体转入根癌农杆菌菌株EHA105中，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化法，转化大豆。
[0030] 3)表型鉴定
[0031] 获得两个GmCLO1过表达转基因大豆株系，命名为OE‑5和OE‑22，获得一个GmCLO1敲除株系KO2(knockout 2)。
[0032] 将GmCLO1基因过表达转基因大豆在恒温光照培养箱中种植，20天后取叶片，液氮速冻后于‑80℃保存。总RNA的提取、反转录以及荧光定量PCR反应同1)。检测GmCLO1基因在转基因大豆中表达量的变化。从图2中可以看出，GmCLO1在过表达转基因大豆中的表达量极显著高于野生型(JACK)。通过Bar试纸条检测GmCLO1基因的表达量，结果如图3所示。
[0033] 利用1)中的GmCLO1基因克隆引物，通过PCR产物测序检测GmCLO1敲除转基因大豆的阳性苗，KO2所有植株测序的结果都是单峰，说明材料是纯合体，与野生型Jack相比，KO2株系在第一个靶点处存在1个碱基的缺失，在第二个靶点处存在40个碱基的缺失(图4)。
[0034] 在第一对真叶展开后，对野生型Jack、过表达株系(OE‑5和OE‑22)和敲除KO2株系接种SMV‑SC7病毒。接种病毒21天后观察发病情况。对照植株WT叶片出现明显皱缩，过表达株系叶片出现轻微花叶症状。相较于野生型WT，KO2上接种叶片出现更严重的卷曲和花叶症状(图5)。对病毒CP基因表达量分析发现，两个过表达株系中SMV‑CP基因的表达量均显著低于野生型，KO2突变体中病毒CP基因的表达量显著高于野生型(图6)。以上结果表明，KO2突变体比野生型WT更感病，过表达GmCLO1基因降低了大豆花叶病毒的积累，提高了大豆对SMV‑SC7的抗性。CP基因引物序列为F：cagatgggcgtggttatga和R：acaatgggtttcagcggata。
