技术领域
[0001] 本发明涉及天然产物提取制备技术领域，特别涉及一种石斛多糖及其制备方法和应用。
相关背景技术
[0002] 石斛(Dendrobium nobile Lindl.)，别名金钗石斛、金钗花、千年润等，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)的植物。石斛分布在中国、印度、尼泊尔等地，在中国主要分布在福建、湖南等亚热带地区。石斛性喜温暖湿润且较为阴凉的环境，常与苔藓植物伴生，适宜生长在山地林中树干上或山谷岩石上。石斛具有益胃生津，滋阴清热之功效。常用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。
[0003] 石斛含有多种化学成分，其中主要有效成分包括石斛类多糖和生物碱等。天然多糖从草本植物中提取，具有显著的生物活性，并被应用于免疫相关疾病的治疗。研究人员一直致力于多糖提取方法的开发，常见的提取方法有：(1)溶剂提取法，适用范围广，能提取多种类型的多糖，但是溶剂使用量大，可能存在环境和安全问题；(2)超声波辅助提取法，提取效率高，缩短提取时间，但是设备成本高，工业化应用难度大；(3)微波辅助提取法，提取速度快，能有效提取热敏感成分，但是高温可能导致一些成分的损失，设备成本高；(4)酶解法，选择性强，可以高效地提取目标多糖，但是酶剂成本高，反应时间长，需精确控制条件；热水提取法，操作简单，成本低，重复性好，设备维护和操作要求较低，这使得热水提取在大规模生产中更具实际可行性，但是提取效率相对较低，可能需要较长时间。因此，有必要对石斛多糖提取工艺和纯化方法进行优化，以提高石斛多糖的提取率和纯度，进一步研究其生物活性。
具体实施方式
[0023] 为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
[0024] 本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1
[0027] 一种石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0028] S1、预处理：取霍山石斛的茎和叶进行蒸汽爆破处理，设定温度为170℃，压力为1.2MPa，汽爆处理时间为90s；
[0029] S2、热水浸提：将蒸汽爆破后的混合物按30：1的mL/g的料液比加入去离子水，95摄氏度条件下提取180min，过滤后浓缩至滤液体积的1/3；
[0030] S3、醇沉：向浓缩后的滤液中加入3倍体积的95％乙醇，4摄氏度条件下静置12h，离心后收集沉淀；
[0031] S4、除去蛋白和色素：将沉淀物用超纯水复溶，离心后取上清液减压抽滤，再用五分之一体积的sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1体积比)进行除蛋白操作(重复多次至无蛋白层)，除去蛋白后的溶液通过D101大孔吸附树脂进行脱色素，减压浓缩除去sevage试剂，再用0.2um滤膜减压抽滤除去细菌；
[0032] S5、透析：将除去蛋白和色素的溶液置于截留分子量为2000Da的透析袋进行透析，用4℃蒸馏水透析48h，每隔4h换水一次，透析液冷冻干燥后得石斛多糖粗品；
[0033] S6、精制石斛多糖：将多糖粗品溶解在去离子水中，离心后取上清液上样到DEAE‑Cellulose 52柱，用0.05M NaCl溶液洗脱，用自动收集器(流速1.2m L/min)收集洗脱液，用硫酸苯酚法监测含糖组分，制作洗脱图谱，根据洗脱图谱，收集洗脱液中主要组分，透析，冻干，得到多糖组分；将多糖组分上样到Sephadex G‑75凝胶柱上，用蒸馏水洗脱(流速0.4ml/min)，收集洗脱液，冻干后得到精制石斛多糖。
[0034] 精制石斛多糖中总糖含量为92.12％，石斛多糖得率为25.11％。
[0035] 实施例2
[0036] 一种石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0037] S1、预处理：取霍山石斛的茎和叶进行蒸汽爆破处理，设定温度为160℃，压力为1.2MPa，汽爆处理时间为60s；
[0038] S2、热水浸提：将蒸汽爆破后的混合物按20：1的mL/g的料液比加入去离子水，100摄氏度条件下提取120min，过滤后浓缩至滤液体积的1/3；
[0039] S3、醇沉：向浓缩后的滤液中加入5倍体积的75％乙醇，4摄氏度条件下静置24h，离心后收集沉淀；
[0040] S4、除去蛋白和色素：将沉淀物用超纯水复溶，离心后取上清液减压抽滤，再用五分之一体积的sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1体积比)进行除蛋白操作(重复多次至无蛋白层)，除去蛋白后的溶液通过D101大孔吸附树脂进行脱色素，减压浓缩除去sevage试剂，再用0.2um滤膜减压抽滤除去细菌；
[0041] S5、透析：将除去蛋白和色素的溶液置于截留分子量为2000Da的透析袋进行透析，用4℃蒸馏水透析72h，每隔4h换水一次，透析液冷冻干燥后得石斛多糖粗品；
[0042] S6、精制石斛多糖：将多糖粗品溶解在去离子水中，离心后取上清液上样到DEAE‑Cellulose 52柱，用0.05M NaCl溶液洗脱，用自动收集器(流速1.2m L/min)收集洗脱液，用硫酸苯酚法监测含糖组分，制作洗脱图谱，根据洗脱图谱，收集洗脱液中主要组分，透析，冻干，得到多糖组分；将多糖组分上样到Sephadex G‑75凝胶柱上，用蒸馏水洗脱(流速0.4ml/min)，收集洗脱液，冻干后得到精制石斛多糖。
[0043] 精制石斛多糖中总糖含量为91.06％，石斛多糖得率为24.78％。
[0044] 实施例3
[0045] 一种石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0046] S1、预处理：取霍山石斛的茎和叶进行蒸汽爆破处理，设定温度为180℃，压力为1.0MPa，汽爆处理时间为180s；
[0047] S2、热水浸提：将蒸汽爆破后的混合物按35：1的mL/g的料液比加入去离子水，80摄氏度条件下提取180min，过滤后浓缩至滤液体积的1/3；
[0048] S3、醇沉：向浓缩后的滤液中加入5倍体积的95％乙醇，4摄氏度条件下静置12h，离心后收集沉淀；
[0049] S4、除去蛋白和色素：将沉淀物用超纯水复溶，离心后取上清液减压抽滤，再用五分之一体积的sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1体积比)进行除蛋白操作(重复多次至无蛋白层)，除去蛋白后的溶液通过D101大孔吸附树脂进行脱色素，减压浓缩除去sevage试剂，再用0.2um滤膜减压抽滤除去细菌；
[0050] S5、透析：将除去蛋白和色素的溶液置于截留分子量为2000Da的透析袋进行透析，用4℃蒸馏水透析48h，每隔4h换水一次，透析液冷冻干燥后得石斛多糖粗品；
[0051] S6、精制石斛多糖：将多糖粗品溶解在去离子水中，离心后取上清液上样到DEAE‑Cellulose 52柱，用0.05M NaCl溶液洗脱，用自动收集器(流速1.2m L/min)收集洗脱液，用硫酸苯酚法监测含糖组分，制作洗脱图谱，根据洗脱图谱，收集洗脱液中主要组分，透析，冻干，得到多糖组分；将多糖组分上样到Sephadex G‑75凝胶柱上，用蒸馏水洗脱(流速0.4ml/min)，收集洗脱液，冻干后得到精制石斛多糖。
[0052] 精制石斛多糖中总糖含量为91.34％，石斛多糖得率为24.89％。
[0053] 对比例1
[0054] 本对比例与实施例1的区别在于，石斛多糖的制备方法中没有进行蒸汽爆破预处理，取霍山石斛的茎和叶粉碎后直接用热水浸提，其余步骤及参数均与实施例1相同。
[0055] 精制石斛多糖中总糖含量为82.04％，石斛多糖得率为12.82％。
[0056] 对比例2
[0057] 本对比例与实施例1的区别在于，步骤S1蒸汽爆破处理条件不同(设定温度为170℃，压力为0.8MPa，汽爆处理时间为240s)，其余步骤均相同。
[0058] 精制石斛多糖中总糖含量为88.34％，石斛多糖得率为18.26％。
[0059] 对比例3
[0060] 本对比例与实施例1的区别在于，步骤S1热水浸提条件不同(将蒸汽爆破后的混合物按30：1的mL/g的料液比加入去离子水，70摄氏度条件下提取240min)，其余步骤均相同。
[0061] 精制石斛多糖中总糖含量为89.45％，石斛多糖得率为19.97％。
[0062] 试验例1石斛多糖体外抗氧化活性测定
[0063] DPPH自由基的清除能力实验：将实施例1所得石斛多糖配置为100、200、400、600、800、1000mg/L的水溶液，保存备用。
[0064] 取不同浓度的石斛多糖溶液各0.5mL，分别与0.5mL 0.1mmol/L的DPPH溶液混合均匀，避光静置30min，以去离子水为空白对照，Vc(抗坏血酸)为阳性对照，在517nm处测定吸光度值，然后，根据如下公式计算：DPPH自由基清除率(％)＝[1‑(A‑A0)/A1]×100；其中A为石斛多糖溶液与DPPH溶液混合物的吸光度值，A0为石斛多糖溶液与无水乙醇(与DPPH溶液体积相同)的吸光度值，A1为去离子水与DPPH溶液混合物的吸光度值。
[0065] 结果如表1所示，石斛多糖清除DPPH自由基能力呈浓度依赖性逐渐增强，在体外表现出显著的抗氧化能力，可以作为药物和护肤品中的抗氧化剂应用。
[0066] 表1石斛多糖抗氧化活性能力测试
[0067]
[0068]
[0069] 将本发明实施例1所得多糖与对比例1‑3所得石斛多糖分别配置为1000mg/L的水溶液，根据专利CN113880960A中实施例1处理1公开的石斛多糖的制备方法提取铁皮石斛多糖也配置为1000mg/L的水溶液；按照上述方法检测其DPPH自由基的清除能力，结果如表2所示。表2结果表明本发明的制备方法所得石斛多糖在抗氧化效果上显著高于其他石斛多糖。
[0070] 表2不同石斛多糖抗氧化活性能力比较
[0071]
[0072] 试验例2石斛多糖的抗肿瘤活性测试
[0073] 采用MTT法，以VX‑680为阳性对照，测试了本发明实施例1制得的石斛多糖对人肝癌细胞系(HePG2)、人胃癌细胞系(BGC‑823)、人结肠癌细胞(LoVo)、人肺癌细胞系(A‑549)和人甲状腺癌细胞系(CAL‑62)的抗肿瘤活性，结果如表3所示(所有结果均以平均值表示±SD，每组的n＝3)。
[0074] 表3石斛多糖对肿瘤细胞增殖抑制活性
[0075]
[0076] 结果表明，石斛多糖对所检测的HePG2、BGC‑823、LoVo、A‑549和CAL‑62细胞株都表现出一定的细胞毒性，尤其对人肝癌细胞系(HePG2)、人结肠癌细胞(LoVo)和人甲状腺癌细胞系(CAL‑62)具有较强的抑制癌细胞增殖活性。
[0077] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
