[0001] 本发明涉及植物提取物开发技术领域，具体涉及一种榛蘑多糖酶解产物及其制备方法和应用。

[0002] 榛蘑(Corylus avellana)是一种广泛分布于全球的食用菌，因其丰富的营养成分和独特的风味而受到人们的喜爱。近年来，榛蘑的研究逐渐扩展到其生物活性成分的提取与利用，尤其是多糖的功能性研究。榛蘑多糖不仅具有良好的营养价值，还有助于增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。因此，榛蘑多糖的提取成为了目前研究的焦点。

[0003] 目前，榛蘑多糖的提取主要采用水提取、醇沉淀等传统技术。这些方法虽然能有效提取多糖，但存在提取效率低、操作复杂、时间长等缺点。同时，传统的提取方法往往难以保证多糖的活性和纯度，导致最终产品的生物活性降低，并且在传统的提取过程中会采用有机试剂对多糖进行脱蛋白处理导致环境的污染，因此，亟需对现有榛蘑多糖的提取方法进行改进。

[0031] 本发明的描述中，除非另有明确的限定，加热、清洗、称取等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

[0032] 本发明的描述中，参考术语“一些实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体方法、材料包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体方法、材料可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0033] 下面将结合具体实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但不构成对本发明保护范围的限制。

[0034] 以下实施例中所用的实验原料和设备如1.1所述；实施例中以榛蘑多糖(AMP)的抗氧化能力以及抗酪氨酸酶活性为衡量指标，具体如1.2所示，实施例中所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。

[0035] 1.1试验材料

[0036] 1.1.1试验材料

[0037] 榛蘑采出自中国东北大兴安岭，经过自然的风干晾晒成干燥的榛蘑子实体。

[0038] 1.1.2试剂与仪器

[0039] 试剂：丙酮，无水乙醇，氯仿，正丁醇等分析试剂来自西陇化工股份有限公司；酶解用风味蛋白酶来自源叶；ABTS自由基清除能力检测试剂盒(BC4775)。

[0040] 仪器：烘箱、超声波清洗机、旋转蒸发仪器、冻干机、酶标仪。

[0041] 1.2酶解后榛蘑多糖的活性的评价方法

[0042] 抗氧化活性通过DPPH清除自由基能力、ABTS自由基清除力两种方法进行测量。酶解后的多糖被提前溶于水中，配置成浓度为1mg/ml的溶液以抗氧化活性测定比较不同条件下的榛蘑多糖。所有抗氧化实验都设有三个生物学重复。

[0043] 1.2.1清除DPPH自由基的能力测定

[0044] 利用DPPH溶液的特征紫红色吸收峰，加入抗氧化剂或多糖溶液后吸光值的下降表示其对自由基的清除能力。DPPH(0.7mg)用甲醇配制成0.2mmol·L‑1，取0.1mL此溶液与0.1mL多糖(1mg/m1)溶液暗室中反应30min。以Vc(抗坏血酸)，熊果苷，奎诺二甲基丙烯酸酯【(S)‑(2)‑6‑hydroxy‑2,5,7,8‑tetramethyl‑chroman‑2‑carboxylic acid，trolox】，即水溶性的维生素E的类似物为阳性对照，517nm下测定其吸光值。

[0045] 清除率计算公式：

[0046] 清除率(％)＝[1‑(Ai‑Aj)/A0]×100％    (1)

[0047] 式中：A0为加入0.1mL DPPH和0.1mL甲醇测得的吸光值；Ai为加入0.1mLDPPH和0.1mL多糖溶液测得的吸光值；Ai为加入0.1mL多糖溶液和0.1mL甲醇测得的吸光值。

[0048] 1.2.2清除ABTS自由基的能力测试

[0049] 清除ABRS自由基能力测试使用试剂盒进行检测以Vc(抗坏血酸)，熊果苷，奎诺二甲基丙烯酸酯【(S)‑(2)‑6‑hydroxy‑2,5,7,8‑tetramethyl‑chroman‑2‑carboxylic acid，trolox】，即水溶性的维生素E的类似物为阳性对照。每个样平行测定3次。根据计算公式(1)计算样品对ABTS自由基的清除率。

[0050] 实施例1榛蘑多糖酶解产物的制备

[0051] 参考图1，具体包括如下步骤：

[0052] (1)将新鲜榛蘑干燥粉碎处理。

[0053] 具体地，将采集的榛蘑子实体经过风干干燥后，用研磨机打碎过筛100目放入50℃烘箱中再次进行干燥至恒重。

[0054] (2)榛蘑粉进行脱脂后水提，然后再醇沉得到粗多糖。

[0055] 脱脂：用丙酮将称量干燥的榛蘑菌粉按料液比1：15在25℃条件超声辅助浸提三次，每次3小时，旋转蒸发丙酮取沉淀。

[0056] 水提：将dd水加入沉淀中按料液比1：15条件下进行沸水浴，离心后过进行分级过筛，去除沉淀，收集上清液，旋转蒸发至原液三分之一。

[0057] 醇沉：将旋蒸后的残液与乙醇按照1：5的体积混合，在4℃条件下进行过夜使多糖沉淀。离心分离后获得沉淀。

[0058] 冻干：将沉淀溶解在水中，利用冻干法对多糖提取物进行冻干，得到榛蘑粗多糖粉末(Crude Polysaccharide，CPS)。

[0059] (3)在步骤(2)得到的粗多糖中加入蛋白酶酶解，离心旋蒸得到所述的榛蘑多糖酶解产物。

[0060] 称量冷冻干燥的榛蘑多糖按照料液比1：20加入超纯水进行溶解后，配置成榛蘑多糖粗溶液。

[0061] 设置风味蛋白酶加酶量为12500U/g并以盐酸和氢氧化钠调节pH值至4.5‑8.5，按1‑3h的酶解时间在40‑80℃条件下进行酶解反应，反应结束后，立即升温至100℃进行灭酶
10min，彻底使酶失活，得到的溶液进行旋蒸至原体积的三分之一，加入其旋蒸后5倍体积的乙醇进行过夜醇沉。

[0062] 将过夜醇沉的多糖溶液4℃进行离心获得的沉淀利用冻干法进行冻干，得到酶解后的多糖。

[0063] 为了得到最佳的酶解条件，以下分别以上述步骤为基准，调整单因素进行分析。

[0064] 实施例1.1不同酶解时间下对榛蘑多糖酶解效果的影响

[0065] 设置风味蛋白酶加酶量为12500U/g并以盐酸和氢氧化钠调节ph值至4.5，酶解温度40℃，设置不同的酶解时间(1h 1.5h 2h 2.5h 3h)，其他实验条件不变的情况下，研究不同酶解时间下榛蘑多糖的抗氧化效果的影响。

[0066] 具体评价结果如图2所示，发现在酶解时间为1h时酶解后清除率最高，分别达到73.55％和88％，进一步延长酶解时间，对清除率贡献不大，这可能是由于酶解时间过长导致部分多糖分解，同时酶的催化活性降低，无法继续提高多糖得率。此外，酶解过程中可能会产生一些中间产物，这些中间产物可能具有较高的抗氧化活性，但随着酶解的继续，这些中间产物可能会进一步分解，导致抗氧化活性降低。后续选取最佳酶解时间为1h。

[0067] 实施例1.2不同pH值条件下对榛蘑多糖酶解效果的影响

[0068] 在实施例1.1的基础上，设置风味蛋白酶加酶量为12500U/g，酶解温度40℃，酶解时间1h，并以盐酸和氢氧化钠调节pH值，设置不同的pH值(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)，其他实验条件不变的情况下，研究不同酶解pH值条件下榛蘑多糖的抗氧化效果的影响。

[0069] 具体评价结果如图3所示，当pH值为5.5时清除ABTS自由基以及DPPH自由基清除率最高，分别达到了72.45％和73.85％，但随着pH值的不断增加清除率反之降低。后续选取最佳酶解pH值5.5作为后续实验条件之一。

[0070] 实施例1.3不同酶解温度下对榛蘑多糖酶解效果的影响

[0071] 设置风味蛋白酶加酶量为12500U/g并以盐酸和氢氧化钠调节pH值至5.5，酶解时间1h，设置不同的酶解温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)，其他实验条件不变的情况下，研究不同酶解温度条件下榛蘑多糖的抗氧化效果的影响。

[0072] 具体评价结果如图4所示，发现在酶解温度为40度条件下ABTS以及DPPH自由基清除率最高，分别达到58％和85.49％，后续随着温度的增加清除率反而略有递减，故后续实验条件选取温度为40℃。

[0073] 实施例1.4不同酶添加量条件下对榛蘑多糖酶解效果的影响

[0074] 以盐酸和氢氧化钠调节pH值至5.5，酶解时间1h，酶解温度40℃，设置不同的风味蛋白酶添加量(5000u/g、7500u/g、10000u/g、12500u/g、15000u/g)，其他实验条件不变的情况下，研究不同酶添加量条件下榛蘑多糖的抗氧化效果的影响。

[0075] 具体评价结果如图5所示，发现在酶的添加量不同也会导致清除率有所变化，当酶解添加量达到12500u/g时酶解的效率达到最高ABTS以及DPPH清除率达到最高，分别为73.28％和75.98％，进一步再增加添加酶的量清除率反而降低，因此后续选取最佳酶添加量12500u/g作为实验条件。

[0076] 实施例1.5不同种类的酶对榛蘑多糖酶解效果的影响

[0077] 以盐酸和氢氧化钠调节pH值至5.5，酶解时间1h，酶解温度40℃，设置酶添加量12500u/g，分别添加不同的酶(木瓜蛋白酶，风味蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶)，其他实验条件不变的情况下，研究不同酶对榛蘑多糖提取效果。同时和与传统使用sevage试剂脱蛋白处理进行对比。采用苯酚‑硫酸法检测测试不同酶及传统使用sevage试剂脱蛋白处理后的多糖含量，从而筛选合适的蛋白酶。

[0078] 结果如图6所示，可以看出，未酶解前，榛蘑多糖含量为0.3269mg/ml，相比于其他酶，风味蛋白酶能将原含糖提升至0.5679mg/ml，能够更大幅度提升多糖含量。而且传统使用sevage试剂脱蛋白技术的多糖浓度为0.5309mg/mL，也低于风味蛋白酶处理后的多糖浓度。这可能是因为蛋白酶通过切断蛋白肽键使得多糖溶出，这种方法不破坏多糖结构，提取效率高，能够有效去除与多糖相连的肽链，从而代替脱蛋白步骤有助于多糖的溶出或生成。

[0079] 综上，可以得出，最佳酶解条件为：风味蛋白酶添加量12500u/g，酶解pH值为5.5，酶解时间1h，酶解温度40℃。

[0080] 实施例2酶解多糖提取物的应用评价

[0081] 将实施例1最佳酶解条件下得到的酶解多糖提取物引入精华乳中，添加量为0.1wt％，通过斑马鱼功效测试进行功效性评价。

[0082] 斑马鱼尾鰭再生分为创面愈合、芽基形成、再生结局三个过程，以芽基形成最为核心鰭再生的细胞有多个来源，包括表皮细胞、纤维母细胞、成骨细胞在内的多种细胞类型均促进尾鰭的再生，且这些细胞具有高度的谱系限制性。斑马鱼尼鳍的再生与人类皮肤骨路、血管等修复作用机制相似。斑马鱼尼鰭因结构简单、易于手术操作、术后不影响结生存和便手观察等特点，成为研究组织再生过程的重要模型。因此，通过手术刀沿与躯干垂直方向切断尾鰭，斑马鱼再生的尾鳍面积定量结果可评价样品是否具有修护功效。

[0083] 具体步骤如下：

[0084] (1)采用手术刀切断尾鳍的方法建立斑马鱼组织再生模型，挑选尾鳍损伤程度一致的斑马鱼随机分组于六孔板，每孔20尾。

[0085] (2)融合给予样品，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。

[0086] (3)28.5℃条件下避光孵育48h。

[0087] (4)每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于体视显微镜下拍照，用高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾鳍面积(A)，根据计算公式计算样品的修护效果，判断其是否具有修护功效。

[0088] 修护功效(％)＝A(样品组)‑A(模型对照组)/A(正常对照组)‑A(模型对照组)*100％

[0089] 功效性评价结果如表1和图7所示，图6中*表示在0.05水平有显著差异，**表示在0.01水平有显著差异，***表示在0.001水平有显著差异。结果显示加入浓度为0.1％的榛蘑酶解后的多糖产物斑马鱼的尾鳍面积与模型对照组对比，显著增加，说明了添加榛蘑酶解后多糖产物的样品具有修护功效。

[0090] 表1模型对照组和样品组斑马鱼尾鳍面积的差异性分析

[0091]

[0092] 综上，本发明通过改进传统的制备方法，将脱脂、水提、醇沉得到的榛蘑粗多糖经过合适的酶解后，无需经过脱蛋白等步骤，得到的酶解产物中既具有多糖也含有蛋白酶水解形成的小分子肽段和氨基酸等，具有良好的自由基清除能力，可直接用于具有修复功效的护肤品等产品中。

[0093] 以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，注意的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。