[0001] 本发明属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种用于特异性检测H2S的荧光探针及合成方法。

[0002] 硫化氢(H2S)被认为是一种带有恶臭的有毒气体，过量的吸入可能导致心功能障碍、心肌损伤，甚至危及生命，然而就其信号传导能力和内源性H2S生成酶的生物分布而言，H2S是一种与一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)类似的气体递质，参与了重要的生理和病理过程。近年来的研究表明，H2S会影响人体内多种生理功能，参与了神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和炎症等多种疾病的调节。遗憾的是，在生物系统中对H2S的追踪和准确量化仍然很困难，H2S的调控机制也尚不清楚。因此，有必要开发一种高选择性检测生物体内的内源性H2S的方法。

[0003] 随着科学研究的发展和进步，现如今已经发展出多种检测H2S的方法，如亚甲基蓝法、H2S离子选择电极法、气相色谱法等。但是，这些方法都有一定方面的缺陷。例如，亚甲基蓝方法的检测灵敏度比较低，不适用于检测微量物质(在微摩尔范围内)，由于硫化物易从酸不稳定的容器中逸出，其浓度可能会被错误估计。而H2S离子选择电极法需要较长时间，气相色谱法也对设备的密闭性有所要求。为了更灵敏、方便地检测复杂生物系统中的H2S，小分子荧光探针进入研究者们的视线，其成本低、生物相容性高、反应灵敏、易于合成和高选择性等优点受到了广泛的关注。

[0038] 实施例：合成荧光探针DSNP

[0039] 合成步骤如图1所示，具体涉及以下步骤：

[0040] S1、合成1,4‑二甲基吡啶(I)

[0041] 将0.5‑2mmol 4‑甲基吡啶(M＝93.13，CAS：108‑89‑4，北京百灵威科技有限公司，货号：P815734‑100ml)、1‑3mmol碘甲烷(M＝141.95，CAS：74‑88‑4，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：I573480‑25ml)以及3‑6mL乙腈加入烧瓶中，在77‑86℃下反应11‑14h，冷却至室温后使用乙醇重结晶，减压过滤，滤渣用少量乙醇洗涤，烘干后得到产物1,4‑二甲基吡啶(M＝108.16)。

[0042] 具体的，产物为白色粉末状固体。

[0043] 在本发明的一个具体的实施例中，4‑甲基吡啶的投入量是0.1863mg(2mmol)，碘甲烷的投入量是0.4258g(3mmol)，乙腈5mL，反应条件是在85℃下反应12h，最终得到的1,4‑二甲基吡啶(I)的产率为94％。

[0044] S2、合成4‑(2‑(6‑羟基‑2‑萘基)乙基)1‑甲基吡啶(Hnmp‑1，II)

[0045] 将0.7‑2mmol 1,4‑二甲基吡啶(M＝108.16)、1‑3.5mmol 6‑羟基‑2‑萘醛(M＝108.16，CAS：78119‑82‑1，北京百灵威科技有限公司，货号：H834750‑5g)、哌啶催化剂0.3‑
0.8mL以及4‑8mL甲醇加入烧瓶中，在45‑55℃下反应1‑1.5h。冷却至室温后使用水萃取三次，减压蒸馏得到产物4‑(2‑(6‑羟基‑2‑萘基)乙基)1‑甲基吡啶(II)。产物为红褐色粉末状固体。

[0046] 在本发明一个具体的实施例中，1,4‑二甲基吡啶的投入量是0.2163mg(2mmol)，6‑羟基‑2‑萘醛的投入量是0.3444g(2mmol)，哌啶的体积为0.5mL，甲醇的体积为5mL。获得Hnmp‑1(II)的产率为60％。表征图如图3A和图3B所示：

[0047] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.79(d,J＝6.3Hz,2H),8.17(d,J＝6.2Hz,2H),8.04(d,J＝13.4Hz,2H),7.78(d,J＝8.8Hz,2H),7.73–7.54(m,2H),7.48(d,J＝16.2Hz,1H),7.15–13
7.08(m,2H),4.23(s,3H). C NMR(101MHz,DMSO)δ159.91,153.22,145.23,141.85,136.62,
130.77,130.75,129.37,127.20,127.13,124.14,123.47,121.62,121.02,109.70,47.23.[0048] S3、合成荧光探针(III)

[0049] 在N2环境下，将0.5‑1.8mmol Hnmp‑1(M＝262)、0.5‑3.2mmol 2，4‑二氟苯磺酰氯(M＝212.6，CAS：13918‑92‑8,北京百灵威科技有限公司，货号：D829371‑25g)、0.5‑3mLN，N‑二甲基甲酰胺(M＝73.09，CAS：68‑12‑2,北京百灵威科技有限公司，N807505)，0.5‑3mL三乙胺(M＝101.19，CAS：121‑44‑8,北京百灵威科技有限公司，货号：T818774)以及3‑7mL二氯甲烷在室温下混合搅拌2‑6h。使用旋转蒸发器将溶剂蒸发后，用硅胶柱层析(200目)，洗脱剂CH2Cl2/MeOH(体积比＝50‑20：1)纯化，得到淡黄色粉末状固体(III)，即为荧光探针(Z)‑4‑(2‑(6‑(((2，4‑二氟苯基)磺酰基)氧基)萘‑2‑基)乙烯基)‑1‑甲基吡啶盐(DSNP)。

[0050] 在本发明一个具体的实施例中，具体在N2环境下，将0.2623mg(1mmol)的Hnmp‑1、0.3189g(1.5mmol)2，4‑二氟苯磺酰氯，0.5mLN，N‑二甲基甲酰胺，0.5mL三乙胺以及5mL二氯甲烷在室温下混合搅拌3h。Hnmp‑1和2，4‑二氟苯磺酰氯的摩尔比为1:1.5。N，N‑二甲基甲酰胺，三乙胺以及二氯甲烷的摩尔比为1:1:10。

[0051] 使用旋转蒸发器将溶剂蒸发后，用200目硅胶柱层析，洗脱剂CH2Cl2/MeOH(体积比＝49：1)至CH2Cl2/MeOH(体积比＝19:1)纯化，得到淡黄色粉末状固体(III)，即为荧光探针(Z)‑4‑(2‑(6‑(((2,4‑二氟苯基)磺酰基)氧基)萘‑2‑基)乙烯基)‑1‑甲基吡啶盐(DSNP)，产率为46％。N，N‑二甲基甲酰胺，三乙胺以及二氯甲烷的摩尔比为1:1:10。

[0052] 实施例1‑5

[0053] 实施例1‑5的合成方法的主要区别如下表1所示：

[0054] 表1：实施例1‑5的主要区别

[0055]

[0056]

[0057] 实施例1提供的荧光探针DSNP的具体合成路线如图1所示。

[0058] 表征如图2A和图2B所示：

[0059] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.89(d,J＝6.3Hz,2H),8.25(d,J＝5.8Hz,2H),8.15(d,J＝16.3Hz,1H),8.10–8.00(m,3H),7.98–7.92(m,1H),7.81(d,J＝2.5Hz,1H),7.68(d,J＝16.3Hz,1H),7.44(t,J＝8.9Hz,2H),7.34(dd,J＝9.0,2.3Hz,1H),7.04–6.83(m,1H),4.28(s,3H).

[0060] 13C NMR(101MHz,DMSO)δ152.66,147.60,145.67,140.43,134.30,134.17,133.97,133.85,132.15,131.63,129.78,129.33,125.46,124.90,124.18,121.90,120.10,113.81,
113.62,113.58,107.78,107.53,104.75,63.25.

[0061] 通过比较上述合成方法可知，采用实施例5的方法合成得到的荧光探针DSNP的产率最高，为46.44％(86％×72％×75％)。

[0062] 荧光光谱实验

[0063] 1、实验方法

[0064] 用于荧光测量的水溶液均由去离子水配制。溶液配制步骤为：取固体DSNP用DMSO/PBS(2:8)配制浓度为2mmol/L的原液，再用PBS稀释至20μmol/L，得到用于光谱测定的溶液。靶点溶液均使用去离子水稀释至对应浓度。光学测量时，每次将0.35mL的DSNP和0.35mL的靶点溶液混合倒入石英光池中，记录荧光发射光谱。

[0065] 将浓度为0.02mmol/L浓度的DSNP溶液分别与浓度为0.2mmol/L的Arg，His，Cys，Na+ + 2+ 2+ 2+ + 3‑ ‑ 2‑ ‑ 2‑ 2‑ 2‑ ‑，Ag，Cu ，Ca ，Mg ，NH4，PO4 ，I，NO ，HCO3 ，CO3 ，SO4 ，SO3 ，HSO3，NH3，HAC和H2S溶液各取350μL混合，60℃反应1h后，测定混合溶液的荧光发射光谱。

[0066] 2、实验结果

[0067] 对DSNP对干扰物的荧光响应的选择性实验表明传统的阴离子、阳离子和生物硫+ + 2+ 2+ 2+ + 3‑ ‑ 2‑ ‑ 2‑ 2‑ 2‑醇，包括Arg，His，Cys，Na，Ag ，Cu ，Ca ，Mg ，NH4，PO4 ,，I ，NO ，HCO3，CO3 ，SO4 ，SO3 ，‑
HSO3，NH3，HAC和H2S，实验结果如图4所示，在相当高的水平下(10eqv)都不会造成明显的干扰，而H2S可以与DSNP响应，在568nm处发出强烈荧光。

[0068] 时间控制实验

[0069] 1、实验方法

[0070] 将浓度为20μmol/L的DSNP溶液与同浓度的H2S溶液各取350μL混合，并保持在60℃下反应，分别测定混合溶液在30s，1min，2min，5min，10min，30min，1h，1.5h，2h荧光发射光谱。对照组中使用PBS溶液替换H2S溶液并在30s，1min，2min，5min，10min，30min，1h，1.5h，2h荧光发射光谱。

[0071] 2、实验结果

[0072] 如图5所示，随着反应时间的增加，溶液在568nm处的荧光强度逐渐增加，并且在45min后达到稳定。

[0073] pH控制实验

[0074] 1、实验方法

[0075] 使用0.1mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节PBS溶液pH分别至3‑12。将浓度为2mmol/L的DSNP原液用不同pH的PBS溶液稀释至20μmol/L。

[0076] 实验组：浓度为20μmol/L浓度的DSNP溶液与同浓度的H2S溶液各取350μL混合。

[0077] 对照组：浓度为20μmol/L浓度的DSNP溶液与350μL的PBS溶液混合。混合液60℃反应1h后，分别测定混合溶液的荧光发射光谱。

[0078] 2、实验结果

[0079] 实验结果如图6所示，在不同pH环境下的荧光发射光谱表明：DSNP‑H2S混合液在酸性环境下568nm处荧光强度较低，而在中性、碱性环境下可以发出较强的荧光，而人体内环境pH约为7.4，因此该探针适用于生理pH。

[0080] 浓度梯度实验

[0081] 1、实验方法

[0082] 配制浓度为0‑10μmol/L的H2S溶液，取浓度为20μmol/L浓度的DSNP溶液与各浓度H2S溶液350μL混合均匀，60℃反应1h后，测定混合溶液的荧光发射光谱。

[0083] 2、实验结果

[0084] 实验结果如图7所示，随着H2S的浓度(1‑10μmol/L)的增加，探针DSNP(20μmol/L)与各浓度H2S混合溶液在568nm处的荧光强度呈线性增加。此外，荧光强度与H2S浓度呈线性关系。经计算探针DSNP对H2S的检测限仅为30.7nm。

[0085] 细胞毒性实验

[0086] 为了调查探针DSNP的细胞毒性，本发明进行了MTT试验。步骤如下：首先，将T24细胞置于含有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的湿润培养箱中，通入5％CO2的气体，37℃下孵育24h；然后，细胞分别用不同浓度的DSNP(10μM、20μM、30μM、40μM、50μM)处理24小时。接‑1下来，向每个孔中加入25μL甲硫唑基四唑(MTT)(5mgmL )，并孵育4小时，并使用MTT进行了细胞毒性测试，具体步骤如下：

[0087] 弃去MTT溶液，加入150μL DMSO振摇15min后于酶标仪490nm下测量OD值。MOCP的毒性计算公式如下。

[0088] The cell viability(％)＝(A‑B)/(B‑C)×100％

[0089] A表示用不同浓度的探针孵育的细胞，B表示没有探针的细胞，C表示只含有培养基的孔。

[0090] 由于DSNP对H2S具有高度选择性，因此可以探索其在细胞内H2S成像中的应用。在进行细胞成像之前，MTT试验对于评估DSNP的细胞毒性至关重要。

[0091] 实验结果如图8所示，在实验条件下(20μM)，超过85％的细胞可存活，显示了DSNP的低细胞毒性，因此可以推断DSNP可以用于活细胞内成像。

[0092] 细胞成像

[0093] 1、实验方法

[0094] 在玻璃培养皿中培养T24细胞(武汉尚恩生物技术有限公司)，并在37℃含5％CO2的潮湿气氛中培养24‑36h。

[0095] 实验组使用的H2S(10μM)预处理，然后用DSNP(10μM)培育1h。

[0096] 对照组直接使用DSNP(10μM)培育1h。培育完成后使用PBS洗涤细胞3次，再使用荧光倒置显微镜进对实验组(DSNP+H2S)与对照组(DSNP)细胞成像。

[0097] 2、实验结果

[0098] 实验结果如图9所示，实验组细胞在暗场显示出黄色荧光，而对照组在暗场下显示出蓝色荧光，因此可以判断出探针DSNP可以应用于细胞成像。

[0099] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。