[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种长链扣手探针的生物合成方法。

[0002] 扣手探针(Padlock probes)又称为开环探针(Open circle probes)，其与生物芯片技术结合，现在已发展出一种高通量的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms：SNP)分型技术。SNP是人类遗传多样性中最广泛存在的多样性，这些分子遗传上的变化与人类的健康和疾病密切相关。

[0003] 开环探针就是没有闭合的环形探针，是一条5’末端被磷酸化的寡聚核苷酸，其5’末端和3’末端各有长度为15-20nt(核苷酸)的序列与模板序列互补配对，3’末端带有一个等位基因特异的碱基，当与互补序列完美配对后，在T4DNA连接酶的作用下，其5’末端与3’末端被连接形成环形的分子，不能与互补序列完美配对的开环探针不能环化，依然保持开环状态。

[0004] 目前，扣手探针的合成主要有两种方法：一种是化学合成，另一种是基于PCR(Polymerase chain reaction)的酶法合成。基于扣手探针与生物芯片的SNP分型技术要求高质量的扣手探针，这种扣手探针除了序列没有错误之外，还要求完整的5’末端与3’末端，并且扣手探针长度在100nt以上。化学合成5’端磷酸化的长链扣手探针所面临的障碍主要是：第一，化学合成的质量与产量随着扣手探针的长度的增加而降低，在化学合成中，每一步的合成效率大约是99％，因此，对于含有150个核苷酸的扣手探针，总的合成
149
效率大约是0.99 ＝0.22；第二，随着扣手探针长度的增加，其纯化的难度也上升。现有的PAGE与HPLC纯化方法是根据寡核苷酸的长度来纯化的，随着寡核苷酸长度的增加，全长寡核苷酸与缺失1-2个核苷酸的非全长的寡核苷酸通过PAGE或者HPLC纯化方法很难完全分开，同时也不能区分出现合成错误的全长的寡核苷；第三，随着扣手探针长度的增加，其出现的二级结构可能性也加大，而二级结构也降低PAGE和HPLC的纯化效率；第四，化学合成长链扣手探针的成本很高。而基于PCR法合成的扣手探针，其主要缺点是合成量小，大量合成成本极高，同时，部分探针的3’末端不完整。因此，寻求新的合成长链扣手探针是一种必然。

[0064] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0065] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0066] 实施例1、长链扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G的获得[0067] 1、扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G的结构与设计

[0068] BKN000007897 为 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana)(genbank accession number AF069298中第55730位核苷酸的多态性)的一个SNP，位于第4号染色体的1055234-1055234bp，其中Columbia(Col)野生型的纯合子基因型为AA，Landsberg erecta(Ler)野生型的纯合子基因型为GG，其旁侧序列分别为：

[0069] 左侧序列5’-CCTAAGCCAGAACGAGAAAGACT-3’

[0070] 右侧序列5’-G(A)GAGCGGAAAGCTGTGAAAGG-3’

[0071] 扣手探针BKN000007897A特异识别等位基因A，扣手探针BKN000007897G特异识别等位基因G，两条扣手探针的长度均为146nt，且5’末端磷酸化，设计序列和结构说明见表1。

[0072] 表1.扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G的设计序列与结构说明[0073]

[0074] 所述与待测基因5’端互补的左侧寡核苷酸为序列表中序列1自5’末端的第1-23位寡核苷酸或序列2自5’末端的第1-23位寡核苷酸；

[0075] 所述与待测基因3’端互补的右侧寡核苷酸1为序列表中序列1自5’末端的第126-146位寡核苷酸；

[0076] 所述与待测基因3’端互补的右侧寡核苷酸2为序列表中序列2自5’末端的第126-146位寡核苷酸；

[0077] 2、扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G的生物合成

[0078] ①生物合成扣手探针前体的结构与设计

[0079] 设计扣手探针前体BKN000007897A_ds和BKN000007897G_ds，这两个序列与BKN000007897A和BKN000007897G的不同之处是其左右两端各添加了一个酶切位点，其结构说明见表2。

[0080] 表2.BKN000007897A_ds和BKN000007897G_ds的设计序列与结构说明[0081]

[0082]

[0083] ②BKN000007897A和BKN000007897G主体序列的构建

[0084] 化学合成寡核苷酸Asp1_Com、Link_Asp1、Tag_7897、Asp2_Com、Link_Asp2(序列具体见表3所示)；

[0085] 将上述得到的Asp1_Com、Link_Asp1及Tag_7897在T4DNA连接酶的作用下连接，具体连接反应体系为：1ul 10×T4 ligase缓冲液、0.5ul 10uM Asp1_Com、0.5ul 10uMLink_Asp1、0.5ul 10uM Tag_7897、0.1ul 100mM ATP、0.5ul T4 DNA ligase(400,000U/ul)，加灭菌双蒸水至10ul，在24℃过夜后，65℃加热10分钟使酶失去活性，得到连接产物(Asp1_Com与Tag_7897连接形成主体互补序列，Asp1_Com与Tag_7897的部分序列连接分别Link_Asp1反向互补，通过Link_Asp1将Asp1_Com与Tag_7897连接。)，送去测序，结果为表3中的BKN000007897A的主体序列，命名为Asp1_Tag_7897A。

[0086] 采用上述同样的方法将Asp2_Com、Link_Asp2及Tag_7897连接，得到送去测序，结果为表3中的BKN000007897G的主体序列，命名为Asp2_Tag_7897G。

[0087] 表3.寡聚核苷酸与PCR引物

[0088]

[0089]

[0090] 所述的BKN000007897A主体序列为表1中序列1自5’末端的第24-125位寡核苷酸；

[0091] 所述的BKN000007897G主体序列为表1中序列2自5’末端的第24-125位寡核苷酸；

[0092] ③PCR法合成扣手探针前体BKN000007897A_ds与BKN000007897G_ds[0093] 设计扣手探针前体BKN000007897A_ds与BKN000007897G_ds的PCR合成使用5条引物7897A_F1、7897A_F2、7897A_R1、7897A_R2、7897G_R2(具体序列见表3)，[0094] 将上述步骤②得到的Asp1_Tag_7897A和Asp2_Tag_7897G稀释10,000倍后分别作为模板，进行两轮PCR。

[0095] 具体如下：

[0096] 1)第一轮PCR，正向引物为7897A_F1，反向引物为7897A_R1，上述稀释10,000倍的Asp1_Tag_7897A作为第一轮PCR的DNA模板，反应体系为：2ul 10x PCR缓冲液、1.6ul2.5mM dNTP、0.5ul 10uM正向引物7897A_F1、0.5ul 10uM反向引物7897A_R1、1ul DNA模板、0.1ul rTaq(5U/ul)，加灭菌双蒸水至20ul。第一轮PCR的产物稀释10,000倍后作为下一轮PCR的DNA模板。第二轮PCR的正向引物为7897A_F2，反向引物为7897A_R2。
两轮PCR的反应条件一致，反应条件均为：先95℃5分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃15秒，共25个循环；最后72℃10分钟，得到PCR产物1。

[0097] 2)第一轮PCR，以稀释10,000倍的Asp2_Tag_7897G作为第一轮PCR的DNA模板，反应体系与上述1)相同，不同的是第一轮PCR的引物为7897A_F1与7897A_R1，第二轮PCR的引物为7897A_F2与7897G_R2，得到PCR产物2。

[0098] ④构建质粒pGEM-7897A与pGEM-7897G

[0099] 将上述PCR产物1和PCR产物2纯化后分别与pGEM-T easy载体(购自Promega公司)连接，连接体系为：2.5ul 2x快速连接缓冲液、0.4ul pGEM-T Easy Vector(50ng/ul)、0.2ul第二轮PCR产物(10ng/ul)、0.3ul ul T4DNA Ligase(3U/ul)，加灭菌双蒸水至5ul，24℃温育1小时。分别取2ul连接产物分别转化大肠杆菌DH5α菌株。经蓝白斑筛选得到的克隆。

[0100] 提取转入PCR产物1的克隆的质粒作为模板，以M13正向引物和7897A_F2进行PCR，含有146bp的片段的质粒送去测序，结果为该质粒含有的PCR产物1具有序列表中的序列3所示的DNA分子，将该PCR产物命名为前体BKN000007897A_ds，该质粒为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入pGEM-T easy中得到的载体，将该质粒命名为pGEM-7897A。该质粒的结构示意图如图1所示。

[0101] 提取转入PCR产物2的克隆的质粒作为模板，以M13正向引物和7897A_R2进行PCR，含有146bp的片段的质粒送去测序，结果为该质粒含有的PCR产物2具有序列表中的序列4所示的DNA分子，将该PCR产物命名为前体BKN000007897G_ds，该质粒为将序列表中的序列4所示的DNA分子插入pGEM-T easy中得到的载体，将该质粒命名为pGEM-7897G。

[0102] 上述转化DH5α菌株的方法如下：从-80℃冰箱取出保存的感受态DH5α菌液，放在冰上约5分钟使其自然融化，将50ul菌液与2ul连接产物放入置于冰上的离心管，轻轻转动离心管混匀，冰上放置20分钟后，于42℃热处理45-50秒，再置于冰上2分钟，然后加入950ulSOC培养基，在37℃摇床于约150rpm摇1小时30分钟，最后取50-100ul转化的SOC培养基涂布在LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板，氨苄青霉素的含量为100ug/ml。

[0103] 从上述含有pGEM-7897A的大肠杆菌DH5α菌株与pGEM-7897G大肠杆菌DH5α菌株中提取pGEM-7897A与pGEM-7897G质粒的方法如下：分别带有pGEM-7897A与pGEM-7897G质粒的大肠杆菌DH5α菌株在1ml LB培养基37℃230rpm过夜，取500ul在25ml LB培养基37℃230rpm过夜，按照中量质粒提取方法提取质粒，最后加200ulTE和RNA酶37℃保温3小时，得到pGEM-7897A与pGEM-7897G。

[0104] ⑤制备扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G

[0105] 质粒pGEM-7897A与pGEM-7897G分别双酶切，双酶切的酶为MlyI(NEW ENGLAND BioLabs，切割双链)和Nb.Bts I(NEW ENGLAND BioLabs，切割单链)，双酶切的体系为：2ul10×NEB缓冲液4、0.2ul 100×BSA、0.4ul MlyI(10U/ul)、0.6ul Nb.Bts I(10U/ul)、5ul质粒DNA(200ng/ul)，加灭菌双蒸水至20ul，37℃温育2小时后，80℃加热20分钟使酶失活，得到的酶切产物分别在5％PAGE电泳，结果如图2所示，1为质粒pGEM-7897A的酶切产物，说明得到大小为146nt的条带探针，命名为BKN000007897A；质粒pGEM-7897G的酶切产物的结果与图2无显著差异，说明得到大小为146nt的条带探针，命名为BKN000007897G。

[0106] 经过测序结果如下：扣手探针BKN000007897A具有序列表中序列1自5’末端第1-146位核苷酸。序列表中序列1自5’末端第24-125位核苷酸为主体片段，与表3中Asp1_Tag_7897A的序列一致。

[0107] 扣手探针BKN000007897G具有序列表中序列2自5’末端第1-146位核苷酸，且序列表中序列2自5’末端第24-125位核苷酸为主体片段，与表3中Asp2_Tag_7897G的序列一致。

[0108] ⑥扣手探针纯化的专用载体pOCP

[0109] 由于上述获得的质粒pGEM-7897A与pGEM-7897G，使用的载体是pGEM-T EasyVector，其带有多个MlyI与Nb.BtsI的酶切位点，导致探针的纯化较困难，为便于探针的纯化构建了一个新的载体pOCP(该载体的核苷酸序列为序列表中的序列3所示，全长2456bp)，该载体除在pUC复制起点(序列5的自5’末端第765-1438bp)中含一个MlyI的酶切位点(序列5的自5’末端第1063-1067位核苷酸)外，全部序列中不含Nb.Bts I的酶切位点，带有一个卡那霉素抗性标记(序列5的自5’末端第1635-2429bp)，BstBI酶切位点为序列5的自5’末端第108-113位核苷酸，和序列5的自5’末端第1486-1491位核苷酸，MluI酶切位点为序列5的自5’末端第544-549位核苷酸，EcoRI酶切位点为序列5的自5’末端第50-55位。pOCP的载体图如图3所示。

[0110] ⑦构建pOCP-7897A与pOCP-7897G

[0111] 质粒pOCP(1个EcoRI位点)、pGEM-7897A(2个EcoRI位点)和pGEM-7897G(2个EcoRI位点)分别用EcoRI酶切，酶切的体系为：2ul 10×H缓冲液，1ul EcoRI(15U/ul)(TaKaRa)，5ul质粒DNA(200ng/ul)，加灭菌双蒸水至20ul，37℃温育2小时后，65℃加热20分钟使酶失活。

[0112] pGEM-7897A酶切后回收182bp的片段作为酶切产物，

[0113] pGEM-7897G酶切后回收182bp的片段作为酶切产物，

[0114] 质粒pOCP用EcoRI酶切后，再用CIAP(Cloned Alkaline Phosphatase，Calf intestine)(TaKaRa)处理，去除载体DNA片段5’末端的磷酸基。CIAP去磷酸的反应体系：

[0115] 5ul 10×Alkaline Phosphatase缓冲液，40ul质粒pOCP酶切产物(300ng/ul)，2ul CIAP(15U/ul)(TaKaRa)，加灭菌双蒸水至50ul，37℃温育30分钟后回收去磷酸化的载体pOCP，方法如下：苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次；氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次；添加5ul的3M NaOAC；添加125ul的(2.5倍体积)冷乙醇，在-20℃下保冷60分钟；离心分离回收沉淀，用200ul的70％冷乙醇清洗，室温干燥10分钟；用20ul的TE缓冲液溶解沉淀，得到线性化的pOCP。

[0116] 质粒pGEM-7897A与pGEM-7897G的酶切产物分别与线性化的pOCP连接，得到连接产物1和连接产物2，连接体系为：2.5ul 2x快速连接缓冲液、0.5ul pOCP Vector(20ng/ul)、0.5ul pGEM-7897A双酶切产物(50ng/ul)、0.3ul ul T4 DNA Ligase(3U/ul)，加灭菌双蒸水至5ul，24℃温育1小时。

[0117] 分别取2ul连接产物1和连接产物2转化大肠杆菌DH5α菌株，得到转化子1和转化子2。

[0118] 提取转化子1的质粒作为模板，用引物7897A_F2和7897A_R2进行PCR鉴定，得到大小为146bp片段的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列3所示的DNA分子插入pOCP的EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pOCP-7897A(质粒结构图谱见图4所示)。

[0119] 提取转化子2的质粒作为模板，用引物7897A_F2和7897G_R2进行PCR鉴定，得到大小为146bp片段的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列4所示的DNA分子插入pOCP的EcoRI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pOCP-7897G。

[0120] 转化DH5α菌株的方法如前述，转化的SOC培养基涂布在LB/卡那平板，卡那霉素的含量为50ug/ml。

[0121] 将上述获得的质粒pOCP-7897A与pOCP-7897G分别双酶切，双酶切的酶为MlyI(NEW ENGLAND BioLabs)和Nb.Bts I(NEW ENGLAND BioLabs)，双酶切的体系为：2ul10x NEB缓冲液4、0.2ul 100x BSA、0.4ul MlyI(10U/ul)、0.6ul Nb.BtsI(10U/ul)、5ul质粒DNA(200ng/ul)，加灭菌双蒸水至20ul，37℃温育2小时后，80℃加热20分钟使酶失活，得到的酶切产物分别在5％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、250伏电压下电泳1小时，结果如图5所示，1-10分别为质粒pOCP-7897用不同酶量的酶切产物(1为0.6ul Mly I和
0.6ul Nb.BtsI、2为0.6ul MlyI和0.4ul Nb.BtsI、3为0.6ul Mly I和0.2ul Nb.BtsI、4为0.4ul Mly I和0.6ul Nb.Bts I、5为0.4ul Mly I和0.4ul Nb.Bts I、6为0.4ul Mly I和0.2ul Nb.Bts I、7为0.2ul MlyI和0.6ul Nb.Bts I、8为0.2ul Mly I和0.4ul Nb.Bts I、9为0.2ul Mly I和0.2ulNb.Bts I、10为0.5ul Mly I和0ul Nb.Bts I)，可以看到大小均为146nt，即为得到扣手探针BKN000007897A；

[0122] pOCP-7897G的酶切结果与图5无显著差异，说明得到大小为146nt的扣手探针BKN000007897G。

[0123] 3、扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G的分离与纯化

[0124] 1)分离：

[0125] 将上述酶切获得的带有目的DNA的条带PAGE胶，将凝胶切片移入等体积的寡核苷酸洗脱缓冲液，37℃摇床于250rpm摇3小时后，扣手探针就溶于洗脱缓冲液中，从而分别得到扣手探针BKN000007897A溶液和BKN000007897G溶液。

[0126] 寡核苷酸洗脱缓冲液由乙酸铵、乙酸镁和水组成，乙酸铵在寡核苷酸洗脱缓冲液中的浓度为10mM。

[0127] 2)扣手探针的纯化

[0128] 上述1)得到的扣手探针BKN000007897A溶液和BKN000007897G溶液，用1毫升的Sep-Pak C18柱反相层析纯化回收的扣手探针，该柱中装填10毫克C18反相层析硅胶。

[0129] 用Sep-Pak C18反相层析柱纯化扣手探针的步骤如下：

[0130] 1毫升己腈通过相层柱；

[0131] 2毫升灭菌双蒸水通过相层柱；

[0132] 1毫升10mM乙酸铵溶液(配方：将77.1克乙酸铵溶于100毫升去离子水中，乙酸铵在乙酸铵溶液中的浓度为10mM。)通过相层柱；

[0133] 回收的扣手探针BKN000007897A溶液通过相层柱；

[0134] 200微升25mM碳酸氢铵通过相层柱；

[0135] 3000rpm离心2分钟；

[0136] 用3毫升30％己腈溶液(溶液的配方：将30ml己腈和70ml去离子水混合得到。)将结合于Sep-Pak C18反相层析柱(美国Waters公司，WAT020805)上的扣手探针洗脱下来，合并洗脱液，置于-20℃冻结，冻干离心机冻干脱水，用50微升灭菌双蒸水溶解，得到纯化的扣手探针BKN000007897A。

[0137] 5％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶检测纯化的产物，结果如图6所示，其中第1、2、3道分别为化学合成的56nt、102nt、94nt的寡聚核苷酸，第4道为上述得到的纯化的扣手探针BKN000007897A。

[0138] 采用同样的方法纯化BKN000007897G溶液，得到纯化的扣手探针BKN000007897G。

[0139] 实施例2、BKN000007897扣手探针的SNP分型

[0140] 1、不对称PCR扩增目的DNA

[0141] SNP(BKN000007897)所在位点的DNA片段用正向引物BKN000007897F(见表3)与反向引物BKN000007897R(见表3)进行不对称PCR扩增，分别扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0 和 Ler-1(Meinke D，Scholl R.The preservation of plant genetic resources.Experiences with Arabidopsis.Plant Physiol.2003Nov；133(3)：1046-50.公众可从中国科学院植物研究所获得。)的基因组DNA，扩增得到PCR产物(Col-0)和PCR产物(Ler-1)，片段长度均为321bp。

[0142] PCR反应体系为：

[0143] 2uL 10×PCR缓冲液

[0144] 1.6uL 2.5mmol/L dNTP

[0145] 0.45uL 10umol/L正向引物BKN000007897F

[0146] 0.05uL 10umol/L反向引物BKN000007897R

[0147] 1uL DNA模板(50ng/uL)

[0148] 0.1uL rTaq(5U/uL)(TaKaRa)

[0149] 加灭菌双蒸水至20uL。

[0150] PCR反应条件：先95℃5分钟；再94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，共35个循环；最后72℃10分钟。

[0151] 2、扣手探针的连接

[0152] 取1uL上述获得的PCR产物(Col-0)和由实施例1得到的纯化的扣手探针BKN000007897A进行连接，得到连接产物7897A(C)；

[0153] 取1uL上述获得的PCR产物(Col-0)和由实施例1得到的纯化的扣手探针BKN000007897G进行连接，得到连接产物7897G(C)；

[0154] 取1uL上述获得的PCR产物(Ler-1)和由实施例1得到的纯化的扣手探针BKN000007897A进行连接，得到连接产物7897A(L)；

[0155] 取1uL上述获得的PCR产物(Ler-1)和由实施例1得到的纯化的扣手探针BKN000007897G进行连接，得到连接产物7897G(L)；

[0156] 扣手探针的连接反应体系：

[0157] 2uL 缓冲液

[0158] 1uL NAD(10mmol/L)

[0159] 10uL扣手探针(1umol/L)

[0160] 0.4uL 热稳定的DNA连接酶(5U/uL)

[0161] 1uL PCR产物

[0162] 加灭菌双蒸水至20uL

[0163] 扣手探针的连接反应条件：先95℃5分钟；再94℃30秒，55℃5分钟，15个循环。

[0164] 3、DNA外切酶酶切反应

[0165] 分别取12uL上述扣手探针连接产物7897A(C)、7897G(C)、7897A(L)、7897G(L)进行DNA外切酶酶切反应。Exonuclease III(TaKaRa)具有双链DNA外切酶活性，只切线性片段，不切环状片段；Exonuclease I(NEB)具有单链DNA外切酶活性，只切线性片段，不切环状片段。以不加入Exonuclease III和Exonuclease I进行酶切的体系为对照。

[0166] DNA外切酶酶切反应体系：

[0167] 2uL 10×Exonuclease III缓冲液(TaKaRa)

[0168] 0.4uL Exonuclease III(200U/uL)(TaKaRa)

[0169] 2uL Exonuclease I(20000U/uL)(NEB)

[0170] 12uL扣手探针的连接产物

[0171] 加灭菌双蒸水至20uL。

[0172] DNA外切酶酶切反应条件：37℃温育3小时后，95℃加热10分钟使DNA外切酶失活。

[0173] 10×Exonuclease III缓冲液：

[0174] 500mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)

[0175] 50mmol/L MgCl2

[0176] 100mmol/L 2-巯基乙醇

[0177] 通过5％尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察，结果如图4所示。

[0178] 图7中，M1为94nt的化学合成的寡核苷酸(94nt，小箭头所指)，M2为102nt的化学合成的寡核苷酸(102nt，小箭头所指)，P为扣手探针PROBE_BKN000007897A(146nt，小箭头所指)，C表示Col-0，L表示Ler。7897A、7897G分别表示连接反应中的扣手探针BKN000007897A与扣手探针BKN000007897G。“-”表示连接产物没有用DNA外切酶酶切，“+”表示连接产物经过DNA外切酶处理。大箭头所指为扣手探针的环化产物。

[0179] 从图7中可以看出，扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G具有连接的特异性，BKN000007897A特异识别Col-0的A基因型，在Col-0的PCR产物存在时可以被连接，形成环化的扣手探针(泳道4)，该环化产物不能被DNA外切酶降解(泳道8)。BKN000007897G特异识别Ler的G基因型，形成环化的扣手探针(泳道6)，其环化产物也不能被DNA外切酶所降解(泳道11)。当没有扣手探针的目的DNA存在时，扣手探针不能形成环化产物。

[0180] 4、RCA反应

[0181] 分别取1uL上述扣手探针连接产物7897A(C)、7897G(C)、7897A(L)、7897G(L)进行RCA反应。

[0182] (1)样品加热变性及引物与环化的扣手探针退火反应

[0183] 4.3uL灭菌双蒸水

[0184] 1uL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲液

[0185] 1uL 10umol/L引物Commn_pri_F(见表3)

[0186] 1uL扣手探针的连接产物

[0187] 95℃加热3分钟，然后置于冰上15分钟。

[0188] (2)在上述反应液中加入

[0189] 2uL 2.5mmol/L dNTP

[0190] 0.2uL 100×RSA

[0191] 0.5uL phi29 DNA聚合酶(10U/uL)(NEB)

[0192] 37℃温育3小时。

[0193] (3)65℃加热10分钟，使phi29 DNA聚合酶失活。

[0194] 扣手探针形成的环化产物可以通过RCA反应扩增，用一条引物进行RCA反应，其产物为长的DNA单链，用0.6％琼脂糖电泳后，RCA反应产物仍然在点样孔附近。

[0195] 结果见图8所示，其中C表示Col-0，L表示Ler。7897A、7897G分别表示连接反应中的扣手探针BKN000007897A与扣手探针BKN000007897G。M为D2000 DNA Marker，箭头所指为RCA反应的产物。

[0196] 从图中可以看出，条带太大(一般长度在10000nt以上)，都是在点样孔的边上，只能从量来判断，量大的为PCR出长的DNA单链。扣手探针BKN000007897A和BKN000007897G具有连接的特异性，BKN000007897A特异识别Col-0的A基因型，形成环化的扣手探针，并且用一条引物进行RCA反应，可以得到长的DNA单链(泳道2)，不能识别Ler的G基因型，还是线性片段(泳道3)。

[0197] BKN000007897G特异识别Ler的G基因型，形成环化的扣手探针，并且用一条引物进行RCA反应，可以得到长的DNA单链(泳道5)，不能识别Col-0的A基因型，还是线性片段(泳道4)。

[0198] 可以看出，RCA反应的结果与上述5％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果一致，因此可以通过RCA反应与DNA外切酶酶切反应来进行SNP分型，而不必进行烦琐的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴别SNP。