NIR荧光探针的改进合成 发明领域 [0001] 本发明涉及光学成像领域。更具体地，本发明涉及一种改进的近红外(NIR)荧光探针(称为“DA364”)的合成方法，所述探针包含用Cy5.5染料部分标记的基于氮杂-双环烷烃的环肽，且用于肿瘤和病理区域的引导手术。 [0002] 背景 [0003] DA364(参见下面的式I)是在术中成像中有效使用的NIR荧光剂，以在肿瘤的NIR荧光成像引导的治愈性手术期间提供肿瘤边缘的实时检测和分界。 [0004] [0005] DA364的合成(参见Lanzardo等，Contrast Media Mol.Imaging 2011,6,449-458)涉及琥珀酰亚氨酯(VI)(Cy5.5-NHS)与通过催化还原相应的叠氮化合物(II)得到的肽模拟物(VII)(氨基环状cRGD)的反应，其按照下列反应方案1： [0006] [0007] 然而，该方法在扩大规模、时间和成本方面存在一些缺点。特别地，Cy5.5-NHS(VI)的合成是漫长的，且最终的花青NHS酯难以纯化，导致总产率低。此外，作为活化酯，它是不稳定的并且不能成功地作为干燥固体储存，因此需要在使用前立即合成。另外，从化合物(IIa)合成氨基-环状cRGD(VII)需要若干步骤，不仅是用于氢化的步骤，还有用于脱保护和从任何副产物中经制备型HPLC对脱保护的化合物(VII)进行纯化的步骤。粗制DA364也必须经制备型HPLC纯化，以避免副产物的存在。 [0008] 申请人现在开发了一种改进的DA364合成，从Cy5.5-COOH衍生物开始代替Cy5.5-NHS，并将cRGD氨基酸上的保护基保持到偶联反应，这可以克服目前已知制备方法的一些缺点。 [0009] 通常，在现有技术中已经公开了在偶联剂存在下非活化羧酸和胺之间的直接酰胺偶联作为制备成像探针的替代方法：例如，引用于Bai M.等人,Curr.Med.Chem.2012,19(28),4742-4758中。 [0010] 用这种方法获得的缀合物的一些实例也在名称为Korean Institute of Science and Technology的US 2014/288300A1和Chevalier等人,Org.Lett.2014,16,3946-3949中公开，报道了在偶联剂如HATU或PyBOP存在下制备具有荧光团-COOH和胺的缀合物。 [0011] 然而，在背景技术中没有发现暗示提供将该方法应用于DA364的整个合成的成功预期，其目的是解决上述缺点并获得产率以及该方法的时间和成本的改进。 [0012] 定义 [0013] 在本说明书中，除非另有说明，术语“偶联剂”是指用于在羧基部分和氨基部分之间形成酰胺键的试剂。该反应由两个连续步骤组成：羧基部分的活化，然后是氨基的酰化。 偶联试剂通常至少包括鏻、铵、亚铵、二酰亚胺官能团，它们能够与各自的羧基反应，得到被氨基部分攻击的中间体。偶联剂的实例报道如下。 [0014] 表述“无水极性非质子溶剂”包括具有相对大的介电常数(例如>20)的干燥溶剂，其具有由极性键引起的偶极子但不具有可以提供给H键的H原子。无水极性非质子溶剂的实例包括，例如，N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈。 [0015] 表述“酸清除剂混合物”在其含义内包括适用于除去一些保护基团的裂解酸试剂混合物，特别是Mtr(2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基)、Pmc(2,2,5,7,8-五甲基-6-苯并二氢吡喃-磺酰基)、OtBu(叔丁基酯)、Trt(三苯基甲基)、Pbf(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢- 1-苯并呋喃-5-磺酰基)。以下报道酸清除剂混合物的实例。 [0016] 发明概述 [0017] 本发明涉及制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法 [0018] [0019] 其包括以下步骤： [0020] a)氢化式(II)的化合物 [0021] [0022] 其中Mtr是2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯-磺酰基，得到式(III)的其氨基-衍生物[0023] [0024] 其中Mtr如上所定义； [0025] b)在碱和偶联剂存在下，使式(III)化合物与式(IV)化合物反应 [0026] [0027] 得到式(V)的化合物 [0028] [0029] 其中Mtr如上所定义； [0030] c)使式(V)化合物脱保护，得到式(I)化合物。 [0031] 作为本发明目的的新合成方法提供了制备DA364的最有效方法，其最终产率提高了至少12％，并提供了几种在工业规模生产中特别有利的改进。 [0032] 实际上，选择反应性较低但更稳定的Cy5.5-COOH衍生物代替Cy5.5-NHS，可以在没有降解问题的情况下保存原料。 [0033] 此外，出乎意料地，仅在花青与cRGD肽偶联后去除氨基酸保护基团的策略被证明是有益的出于以下几个原因：例如它避免形成不希望的副产物；它避免了叠氮化合物(II)的纯化步骤，其原样使用而无需纯化；它有助于从未反应的花青中色谱分离和纯化缀合物，这还可以很容易地回收和再循环。最后，偶联可以在无水极性非质子溶剂中而不在硼酸盐缓冲剂中进行，再次提供储存中间体而不降解的机会。 [0034] 即使在没有先前的教导的情况下，也令人惊讶地获得了上述几项成就。特别地，在现有技术中没有发现关于cRGD-Cy5.5缀合物对在酸清除剂混合物存在下进行的最终脱保护步骤中所应用的强酸条件的稳定性的证据。 [0035] 然而，本发明提供了一种方法，其中即使在强酸性条件下，DA364也以良好的产率获得并且没有降解。 [0036] 此外，由于去除了不方便的例如在偶联之前的HPLC制备步骤，或快速色谱法的更容易的添加和更快的纯化，本发明方法中的纯化步骤大大简化。事实上，令人惊讶地发现，使用例如用琼脂糖基质树脂进行的阴离子交换色谱法，可以将最终的缀合物化合物与非偶联的花青分离，从而改善随后的HPLC纯化步骤， [0037] 发明详述 [0038] 本发明公开了制备式(I)的cRGD-Cy5.5缀合物的方法，其在本领域中称为DA364，如以下方案2所示： [0039] [0040] 本方法的第一个步骤涉及中间体化合物(II)的氢化以获得受保护的cRGD化合物(III)。与Lanzardo等人公开的方法不同，不除去化合物(III)的天冬氨酸和精氨酸上的保护基，以避免副产物的形成，使得不需要纯化。叠氮化合物(II)可以例如根据Manzoni等人.,Chem.Med.Chem2009,4,615-632中描述的方法合成。 [0041] 根据步骤a)，化合物(II)因此溶解在合适的溶剂中，优选醇例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、更优选甲醇或它们的混合物。通常，叠氮化物可以以3mM至7mM、优选5至5.5mM、更优选5mM的浓度溶解。 [0042] 化合物(II)的叠氮基还原为化合物(III)的氨基可以通过在氢气氛下在室温使溶液流过(例如0.2-0.8ml/min、优选0.5ml/min)金属催化剂(例简形式)来进行。金属催化剂优选为钯或铂，更优选为钯。在一个优选的实施方案中，将金属催化剂与合适的载体材料例如碳粉混合，优选的量为5-10％(重量)的金属催化剂。 [0043] 反应可在18℃至40℃、优选20℃至30℃的温度进行，甚至在室温(即约22℃)进行。 [0044] 反应可在流动反应器系统(连续模式)或分批条件下进行。 [0045] 该方法的第二个步骤包括将Cy5.5的羧酸(中间体化合物(IV))与化合物(III)的氨基偶合，得到粗制的DA364化合物。 [0046] 根据步骤b)，偶联在无水极性非质子溶剂存在下进行。溶剂优选选自干燥的N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、乙腈等，优选干燥的N,N-二甲基甲酰胺。 [0047] Cy5.5-COOH化合物(IV)可以以5至10mM、优选7至9mM、更优选8.6mM的浓度溶解在溶剂中。Cy5.5-COOH化合物(IV)是市售化合物(Lumiprobe，目录号#17390)。或者，其可以根据Mujumdar等人,Bioconjugate Chem.1996,7,356-362和CN102010614A中描述的方法从6-氨基-1,3-萘二磺酸二钠盐开始合成。与需要制备型HPLC纯化的现有技术方法相比，它可以通过快速色谱法粗略纯化，节省了大量时间。如上所述，Cy5.5-COOH化合物(IV)的反应性低于相应的酯(VI)(在已知的制备方法中使用)，并且可以储存。 [0048] 由于中间体化合物(IV)的反应性相对较低，因此必须使用偶联剂来进行化合物(IV)和化合物(III)之间的反应。偶联剂可选自N,N，N'，N'-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐(TBTU)，4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)，(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)N,N，N'，N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(HATU)，N,N，N'，N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(ΗBTU)，丙基膦酸酐优选TBTU。中间体化合物(IV)和偶联剂之间的比例可以是1:1至1:5(mol/mol)、优选1:1.5至1:3且更优选约1:2。 [0049] 通过向反应混合物中加入碱也可以促进活化。进一步使Cy5.5-COOH化合物(IV)的羧酸去质子化，碱有利地起到中和残余酸度的pH缓冲剂的作用。碱可选自N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)、三丁胺、N-甲基哌啶或N-甲基吗啉、优选N-甲基吗啉。中间体化合物(IV)与碱的比例可以为1:3至1:6(mol/mol)、优选1:3.5至1:5、更优选约1:4。 [0050] 偶联优选在搅拌下，在黑暗中和在N2气氛下进行1-8小时，优选3小时。优选在20℃至25℃的温度进行，更优选在室温进行。 [0051] 提出的DA364合成是非常特异的，因为cRGD化合物(III)上的保护基团避免了由于cRGD化合物(III)的精氨酸与Cy5.5化合物(IV)羧基反应而形成副产物。 [0052] 第三个步骤包括仍然在肽模拟部分上的叔丁酯和2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mtr)基团的脱保护，得到粗制的DA364。 [0053] 根据步骤c)，官能团脱保护反应可以根据已知技术用有效的酸清除剂混合物进行，诸如三氟乙酸/苯酚/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/水、三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/茴香醚或三氟乙酸/苯酚/水/三异丙基硅烷、优选三氟乙酸/茴香硫醚/1,2-乙二硫醇/茴香醚，其中三氟乙酸、茴香硫醚、1,2-乙二硫醇和茴香醚的比例为70:15:10:5至90:5:3:2、优选90:5:3:2。 [0054] 脱保护可在搅拌下、在室温和黑暗中进行1-8小时，优选2小时。 [0055] 根据步骤d)，通过常规技术的组合进行粗DA364的纯化。优选地，纯的DA364产物可以在两步纯化过程后获得，包括阴离子交换色谱步骤，然后是制备型HPLC。 [0056] 阴离子交换色谱步骤可以在20mM Tris-HCl缓冲液中、在7-8、优选7.5的pH下，通过0-100％1M NaCl梯度或等度洗脱进行，或者优选分别用10-30％的1M NaCl、70-100％的 1M NaCl和1M NaCl、30％异丙醇通过三步等度洗脱进行。阴离子交换色谱树脂是强阴离子或弱阴离子交换剂，优选为与固体基质、优选琼脂糖小球结合的季胺基团。 [0057] 制备型HPLC可以用在0.1％乙酸铵缓冲液中0至100％、优选2至95％的乙腈的梯度进行。或者，其可以通过用20-30％、优选20％的乙腈和70-80％、优选80％的8g/l乙酸铵等度洗脱进行。HPLC柱是二氧化硅RP柱，优选苯基键合相。 [0058] 通过这种策略，减少了纯化步骤，节省了大量时间和成本。 [0059] 以下实施例进一步说明了本发明。 [0060] 实施例1:DA364的合成 [0061] 材料和设备 [0062] 用于合成DA364的所有市售试剂无需进一步纯化即可使用。中间体化合物(II)根据Manzoni等人,Chem.Med.Chem.2009,4,615-632中所述的方法合成；除了用2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mtr)保护基团而不是2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)保护基团来保护精氨酸。根据Mujumdar等人,Bioconjugate Chem.1996,7,356-362和CN102010614A中描述的方法合成化合物(IV)，并使用Combiflash自动纯化系统在C18筒上用在0.1％甲酸水溶液中的10％至100％的乙腈梯度洗脱粗略纯化。 [0063] 氢化步骤在具有10％Pd/C筒的流动反应器上进行。 [0064] 使用MS-HPLC跟踪反应，其中吸收检测器的波长设定为220nm、254nm、677nm。 [0065] 用FPLC系统然后用制备型RP-HPLC进行最终的化合物纯化。 [0066] 在Analytic Jena，Specord 200Plus分光光度计上记录UV-Vis/NIR吸收光谱。 [0067] DA364的合成 [0068] DA364的合成根据方案2进行。 [0069] 氢化。将叠氮化合物(II)(0.39mmol)溶解在甲醇(80ml)中，在氢气氛下使溶液通过10％钯筒。两个循环后，收集所得产物，并将溶液真空浓缩。使用化合物(III)而无需进一步纯化。 [0070] 偶联。将粗制的中间体化合物(III)加入到化合物(IV)(0.43mmol)、N-甲基吗啉(1.73mmol)和TBTU(0.86mmol)在无水二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液中，得到深蓝色溶液。 将该反应混合物在黑暗中在N2气氛下搅拌3小时；在反应完成后，蒸发溶剂，并如下所述处理粗产物以除去保护基团而无需任何进一步纯化。 [0071] 脱保护。将新制备的TFA/清除剂混合物(三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、茴香醚， 90:5:3:2，总共20ml)加入到前一步骤中获得的粗产物中，并将该混合物在室温在黑暗中搅拌2小时。然后蒸发反应混合物，将蓝色油状物溶于水(100ml)中，并用乙醚或异丙醚(2× 30ml)洗涤。在双步纯化过程后获得纯DA364产物。 [0072] 纯化。该方法包括用市售的琼脂糖基质树脂(70ml)进行的阴离子交换色谱步骤，其中使用在pH为约7的包含20mM Tris-HCl的缓冲液中的线性NaCl梯度，和用YMC-Triart Phenyl制备柱(250x 50mm)进行的反相高效液相色谱法步骤，其中使用在乙酸铵缓冲液中的0至95％乙腈的线性梯度。 [0073] 纯化后，得到纯的DA364化合物，为蓝色冷冻干燥粉末，相对于叠氮化合物(II)收率为36％(0.14mmol)。 [0074] 比较实施例2：DA364的比较合成 [0075] 根据Lanzardo等人,Contrast Media Mol.Imaging 2011,6,449-458描述的方法按照方案1中报告的合成程序获得DA364。 [0076] 材料和设备 [0077] 用于合成中的所有市售试剂无需进一步纯化即可使用。中间体化合物(II)根据Manzoni等人,Chem.Med.Chem.2009,4,615-632中所述的方法合成；通过RP-HPLC纯化中间体(VII)，并将其作为冷冻干燥的粉末用于以下步骤。 [0078] 氢化步骤由具有10％Pd/C筒的H-Cube ProTM流动反应器进行。 [0079] 使用MS-HPLC跟踪偶联反应，其中吸收检测器的波长设定为220nm、254nm、677nm。 [0080] 用制备型RP-HPLC进行最终的化合物纯化。 [0081] DA364的合成 [0082] 将叠氮化合物(II)(1.43mmol)溶解在MeOH(150ml)中，使溶液在氢气氛下通过 10％钯筒。两个循环后，收集所得产物。将收集的溶液真空浓缩，加入新制备的TFA/清除剂混合物(三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、茴香醚，90:5:3:2，总共20ml)。将混合物在室温在黑暗中搅拌2小时。然后蒸发溶液，将所得油状物溶于水(100ml)中，用异丙醚(2x 30ml)洗涤。在用YMC-Triart Phenyl制备柱(250x 50mm)进行RP-HPLC纯化步骤后，得到纯化合物(VII)(0.65mmol)，其中使用在乙酸铵缓冲液中的0-95％乙腈的线性梯度。 [0083] 将作为冷冻干燥粉末的化合物3(0.65mmol)溶解在100ml硼酸钠缓冲液(pH9)中，并向该溶液中加入纯化合物(VI)(0.65mmol，参见方案1)。将该混合物在黑暗中在室温搅拌过夜。通过加入5％乙酸溶液直至pH 7淬灭反应。将粗制的深蓝色反应混合物在RP-HPLC YMC-Triart Phenyl制备柱(250x 50mm)上用0至95％的在乙酸铵缓冲液中的乙腈的线性梯度洗脱来纯化。 [0084] 纯化后，得到纯的DA364化合物，为蓝色冷冻干燥粉末，相对于叠氮化合物(II)收率为24％(0.33mmol)。