技术领域
[0001] 本发明属于视频添加剂领域，具体涉及一种紫菜蛋白鲜味肽及其筛选方法和应用。
相关背景技术
[0002] 紫菜中含有多种营养物质，既可生食也可制作成干制品食用，因其特殊的气味还可被制作成香精等已不具紫菜形态的产品，极大的提高了紫菜产品的附加值。紫菜具有的多种生物活性物质，例如多糖、多酚、藻胆蛋白等，具有开发为保健食品和天然色素的巨大潜力，还可预防肉制品脂质氧化，延长其保存期限。
[0003] 目前，市场对紫菜的利用还不够全面，市面上出售的依然是紫菜的简易干制品、紫菜调味汁等，对紫菜的研究主要集中在紫菜多糖、多肽、多酚等在抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等方面，对其生物活性功能的开发也仅限于实验室阶段。紫菜中游离的鲜味氨基酸和呈味核苷酸丰富，可媲美海带，且不具有海带的腥味，加工中不需进行脱腥处理，有作为海洋来源的鲜味调味料的潜质，但至今未见对其鲜味开发的研究报道。
具体实施方式
[0073] 为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0074] 实施例1
[0075] 1.2实验材料与仪器
[0076] 1.2.1实验材料
[0077] 干制坛紫菜，购于浙江舟山市华融水产食品有限公司，常温条件下储存备用。
[0078] 1.2.2实验试剂
[0079] 表1‑1实验试剂
[0080]
[0081] 1.2.3实验仪器
[0082] 表1‑2主要仪器和设备
[0083]
[0084] 1.3实验方法
[0085] 1.3.1紫菜预处理
[0086] 干紫菜经高速粉碎机粉碎后过60目筛，密封后置于‑20℃保存。
[0087] 1.3.2紫菜蛋白的提取
[0088] (1)紫菜的超声破碎：将20g紫菜粉末，按照料液比1:30(g:mL)，于0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中充分混匀，溶胀12h后在冰浴条件下，超声频率53kHz，功率100％超声破碎1h，搅拌均匀后继续溶胀12h；
[0089] (2)硫酸铵沉淀紫菜蛋白：将溶胀后的紫菜蛋白提取液在4000r/min条件下离心15min，收集上清液。向上清液中加入硫酸铵粉末配制成饱和度为20％的硫酸铵紫菜蛋白提取液，浸泡2h后在4000r/min条件下离心15min，收集沉淀，用一定体积的磷酸盐缓冲液复溶，沉淀出来的蛋白组分命名为20％组分；根据上清液体积加入硫酸铵粉末至饱和度为
40％，静置2h后在相同条件下离心，沉淀蛋白组分命名为40％组分；以相同的方法继续制得
60％、80％沉淀蛋白组分。
[0090] (3)紫菜蛋白透析除盐：将蛋白沉淀组分混合均匀，经硫酸铵沉淀出的蛋白质含有大量的铵盐，会影响后续的分离，需进行脱盐处理。采用分子截留量为10kDa的透析袋去除铵盐、有机酸、核苷酸等小分子物质，流水透析48h后，收集截留液，冷冻干燥后得到冻干紫菜蛋白，在‑20℃条件下保存备用。
[0091] 1.3.3紫菜蛋白酶解中蛋白酶的选择
[0092] 将冻干蛋白与超纯水按照料液比1:200(g:ml)混合后搅拌均匀，酶解条件如表1‑4所示，设置六个实验组进行酶解。酶解完成后，将酶解液升温至95℃、10min灭酶，冷却至室温后，用HCl或NaOH(1.0mol/L)调节酶解液至pH＝7.0。4000r/min，离心15min收集上清液，0.22um水滤膜过滤后得到紫菜蛋白酶解液，以各酶解液中游离氨基酸含量和电子舌鲜味强度为评价指标，筛选出制备紫菜蛋白鲜味肽的最佳工具酶。
[0093] 表1‑4不同蛋白酶的最适酶解条件
[0094]
[0095] 1.3.4酶解液的感官检测
[0096] 1.3.4.1电子眼检测
[0097] 首先使用校准白板和标准色板对电子眼设备进行颜色校准，再取10mL不同蛋白酶酶解液倒入一次性培养皿中，放入提前校准好的观测板上，记录放置顺序，用电子眼拍下高分辨率的数码照片。采用亮度L*(L*越接近于0，代表样品越暗；越接近于100，样本越亮)，红绿值a*(+a*和‑a*分别是红色、绿色)和黄蓝值b*(+b*和‑b*分别是黄色、蓝色)对酶解液之间的颜色差异进行分析，按照公式(1)计算总色差值ΔE。
[0098]
[0099] 其中，L*，a*和b*代表实验组，L0*，a0*和b0*代表对照组。
[0100] 1.3.4.2电子鼻检测
[0101] 取3mL处理后的紫菜蛋白酶解液装入顶空进样瓶中，迅速用保鲜膜密封好待测。电子鼻仪器提前预热30min，并用空气矫正。参数设定：采样时间为1s/组，传感器自清洗时间为180s，传感器归零时间为10s，样品准备时间为5s，进样流量为300mL/min，分析采样时间为60s，电子鼻分析取响应值稳定后45～59s测定数据。电子鼻有10根不同金属氧化物传感器，各传感器对应的香气类型见表1‑5。实验平行测定3‑4次，采用电子鼻自带Winmuster软件进行结果分析。
[0102] 表1‑5PEN3电子鼻传感器敏感物质
[0103]
[0104] 1.3.4.3电子舌检测
[0105] 将紫菜各蛋白酶酶解液冻干后配制成0.25mg/mL溶液，取30mL溶液倒入电子舌专用烧杯中，放入自动采样器中并记录放置顺序。测试时间为180s，检测膜电位变化，每组样品平行测定3次。电子舌系统AHS、ANS、CTS、SCS和NMS传感器的响应特征分别为酸味、甜味、咸味、苦味和鲜味。
[0106] 1.3.5超滤分级
[0107] 将筛选出的鲜味最佳蛋白酶酶解液，即胃蛋白酶酶解液过0.22um水滤膜抽滤后，分别用1、3kDa的超滤膜进行分离，分离压强小于0.5MPa。进而得到3kDa以上，1～3kDa和1kDa以下3个分子量的组份。超滤后各组分经旋蒸、真空冷冻干燥后配制成溶液进行电子舌测定，测定方法同1.3.7.3，将筛选出的鲜味最佳组分置于‑20℃下保存备用。紫菜胃蛋白酶酶解液经超滤分离后，得到三个组分：W1(MW＞3kDa)，W2(1KDa＜MW＜3kDa)，W3(MW＜1kDa)。
其中W3组分的鲜味最为突出。
[0108] 1.3.6Sephadex G‑15凝胶层析
[0109] 将超滤后得到的鲜味最佳组分用超纯水复溶，配置成20mg/mL的溶液，经0.22um水滤膜过滤后备用。Sephadex G‑15凝胶层析柱(2.5×150cm)经超纯水平衡后，上样量为10mL，以超纯水为洗脱液进行洗脱，洗脱流速为1.0mL/min，每管收集10mL洗脱液。收集结束后，紫外分光光度计在220nm波长下测定每管的吸光度值，对相同峰组分进行合并收集，经旋蒸、真空冷冻干燥后对各组分进行电子舌测定，测定方法同1.3.7.3，共获得W3‑1，W3‑2，W3‑3三个组分，将鲜味较强的W3‑3组分置于‑20℃保存备用。
[0110] 1.3.7数据处理
[0111] 每组样品均进行3次平行实验，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS22.0软件进行显著性分析，数据图由Origin 2023构建。
[0112] 1.4结果与讨论
[0113] 1.4.1不同饱和度硫酸铵对蛋白沉出量的影响
[0114] 不同饱和度硫酸铵沉淀出的蛋白质量及复溶后的蛋白溶液如图1所示。在盐析过程中，随着硫酸铵饱和度的增加，蛋白溶液颜色由暗红色变为紫色，最后变成淡黄色，说明在不同饱和度硫酸铵的处理下，沉淀出的色素结合蛋白的种类和含量存在一定差异。沉淀蛋白质量随硫酸铵饱和度的增加呈现先上升后下降的趋势，当硫酸铵饱和度为20％时，提取出的蛋白质质量为96.84±0.06mg；继续增大硫酸铵的饱和度，沉淀蛋白质量显著增加，当提取液中硫酸铵的饱和度大于60％时，沉淀蛋白质量降低。为在提取蛋白质质量相近的情况下减少试剂投入，我们选择了40％(蛋白沉淀质量为544.91±0.74mg)和60％(1006.23±0.75mg)的硫酸铵饱和度来沉淀紫菜蛋白。
[0115] 1.4.2酶解液的感官检测
[0116] 1.4.5.1电子眼检测
[0117] 如图2所示，电子眼结果表明，六种蛋白酶酶解液中，木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解液的L*值最高，颜色最亮，胃蛋白酶的L*最低，颜色最暗，胃蛋白酶酶解液的a*最高，b*值最低且为负值，表示酶解液的颜色趋向于蓝紫色。根据公式(1)对六种蛋白酶酶解液的ΔE进行了计算，结果表明不同蛋白酶酶解液的总色差存在显著性的差异，胃蛋白酶的ΔE最高，其次是木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，胰蛋白酶的ΔE值最低，不同蛋白酶酶解液的颜色差]异与其酶解的条件有关，有研究表明 藻胆蛋白在低于40℃，pH 3到10之间均能保持良好的稳定性，这可能也是胃蛋白酶酶解液最接近于紫菜蛋白溶液的颜色的原因之一。各蛋白酶酶解液的ΔE均大于5，说明在设定的酶解条件下，电子眼能够有效的区分不同蛋白酶酶解液的颜色差异。
[0118] 2.4.5.2电子鼻检测
[0119] 食品的香气也是引导消费者消费偏好的主要因素之一，对不同样品的香气特征进行表征具有重要的现实意义。如图3A所示，六种蛋白酶酶解液的气味特征相似，其中W1W、W5S、W2W、W1S和W2S对所有的蛋白酶酶解液都有显著的响应，这意味着经过蛋白酶的酶解，各酶解液中含硫化合物、醇类、芳香酯类化合物、甲烷和芳香族化合物的含量增加，尤其以氮氧化物和含硫化合物为主。
[0120] 六种不同蛋白酶酶解液的电子鼻PCA图如图3B所示。在PCA图中，PC1和PC2轴表示了在线性变换过程中得到的第一主成分和第二主成分的贡献率，累积贡献率越高，则降维后的综合指标越能反映原始指标的信息。从主成分分析(PCA)数据来看，PC1和PC2的总贡献率为90.9％，因此这两个主要成分可以用来区分样品间的差异，表明在设定的酶解条件下，电子鼻能够区分不同蛋白酶酶解液气味差异。
[0121] 2.4.5.3电子舌检测
[0122] 6种蛋白酶酶解液的电子舌滋味轮廓如图4所示，由图可知，各蛋白酶酶解液的滋味轮廓基本相似。其中胃蛋白酶酶解液的鲜味明显，苦味和甜味强度低于其他蛋白酶酶解液，可能是因为胃蛋白酶酶解液中游离的苦味氨基酸和甜味氨基酸的含量较低。由表7可知，胃蛋白酶酶解液中含有最少的鲜味氨基酸，但电子舌结果表明其鲜味强度远大于其他蛋白酶酶解液，因蛋白质在酶解前经过透析处理，所以排除呈味核苷酸、有机酸等呈味小分子物质对酶解液滋味的影响。
[0123] 1.4.6超滤组分的滋味特征分析
[0124] 紫菜胃蛋白酶酶解液经超滤分离后，得到三个组分：W1(MW＞3kDa)，W2(1KDa＜MW＜3kDa)，W3(MW＜1kDa)。对三个组分进行电子舌检测，以鲜味和咸味为主要的风味特征，探讨鲜味属性与分子量之间的关系，各组分滋味强度如图5所示。由图6可知，酶解液超滤分离组分的鲜味强度均随着分子量的减小而逐渐增大，同时苦味逐渐下降。其中W3组分的鲜味最为突出，主要原因可能是低分子量的肽是影响鲜味的重要味觉活性因子，且分子量小于1kDa的组分中含有游离的谷氨酸和天冬氨酸，进一步增加了该组分的鲜味。此外，W3组分相较于W1和W2组分具有更强的咸味和酸味，根据先前的报道可以发现咸味和鲜味的感知存在一定的正相关关系，这也可能是造成W3组分鲜味较强的原因之一。因此，富集相对分子质量小于1kDa的W3组分，冷冻干燥后做下一步的分离。
[0125] 2.4.7凝胶层析分离结果
[0126] 由超滤得到的W3(MW＜1kDa)组分，经凝胶过滤色谱分离后，如图6A(Sephadex G‑15凝胶层析)所示，在收集时间内，共获得W3‑1，W3‑2，W3‑3三个组分。分别收集各组分，冷冻干燥后进行电子舌分析。由图6B(超滤组分电子舌)可知，与W3组分相比，W3‑3组分的鲜味值略有提高，酸涩味下降。鲜味强度的排序是W3‑3＞W3‑2＞W3‑1，W3‑3的鲜味强度最强，同时其咸味强度也高于其他两个组分，因此选择W3‑3组分进行下一步的多肽序列鉴定。
[0127] 实施例2紫菜蛋白鲜味肽的筛选
[0128] 2.2实验材料与仪器
[0129] 2.2.1实验材料
[0130] 同1.2.1。
[0131] 2.2.2实验试剂
[0132] 表2‑1实验试剂
[0133]
[0134] 2.2.3实验仪器
[0135] 表2‑2主要仪器和设备
[0136]
[0137] 2.3实验方法
[0138] 2.3.1鲜味肽序列的鉴定
[0139] 2.3.1.1样品还原烷基化处理
[0140] 将凝胶分离出来的鲜味最强组分W3‑3用50mM NH4HCO3溶解后，取适量溶解后的样品，加入DTT溶液使其终浓度为10mM，于56℃水浴中还原1h。之后加入IAM溶液使其终浓度为50mM，避光反应40min。使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥发干溶剂。
[0141] 2.3.1.2质谱检测条件
[0142] 采用HPLC‑MS/MS系统进行多肽的氨基酸序列检测，分析柱为Acclaim PepMap RPLC C18,150um×15cm 流动相A为0.1％甲酸，流动相B为80％ ACN(含0.1％甲酸)，流速为600nL/min。按照线性洗脱梯度的方式洗脱：0～5min，6％B；6～20min，9％ B；21～50min，14％ B；51～58min，30％ B；59～60min，40％B；61～65min，95％ B。
[0143] 质谱参数：a.MS：扫描范围300～1800m/z，分辨率为70000，最大驻留时间40ms，动态增益控制为3e6；b.HCD‑MS/MS：分辨率为17500，最大驻留时间60ms，动态增益控制为1e5，TopN为20，归一化碎裂能量为27。
[0144] 2.3.1.3数据分析
[0145] 质谱原始文件采用DeNovo的方法进行多肽序列解析，Byonic根据原始的MS文件对蛋白质数据库进行了评估和检索，得到该组分的肽段的序列分析结果。检索参数如下：设置none酶解，酶切特异性设为：non‑specific，可变修饰包括：氧化、乙酰化；母离子质量容许误差为20ppm，碎片离子质量容许误差为0.02Da，最大漏切数为3。
[0146] 2.3.2多肽序列的虚拟筛选
[0147] 2.3.2.1理化性质预测
[0148] 借助在线的活性肽数据库，以多肽的水溶性、毒性、呈味特性、鲜味肽可能性为指标，对LC‑MS/MS鉴定出的多肽序列进行筛选。
[0149] 可溶性预测：Innovagen在线工具是一个肽性质计算器，可对多肽的可溶性进行预测(http://www.innovagen.com/proteomics‑tools)。
[0150] 毒性预测：通过在线工具ToxinPred进行多肽的毒性预测(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/multi_submit.php)。
[0151] 鲜味肽呈味活性预测：通过呈味肽和呈味氨基酸数据库BIOPEP database预测鉴定的鲜味肽的潜在的感官活性(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/virtual_data.php)。
[0152] 鲜味预测：通过UMPred‑FRL网络服务器对鲜味肽进行在线高通量鉴定(http://pmlabstack.pythonanywhere.com/UMPred‑FRL)。UMPred‑FRL是一种利用特征表示法准确预测鲜味肽的计算工具，可大规模筛选具有潜在鲜味感官特性的候选肽。
[0153] 借助UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中search功能，搜索所筛选的多肽是否是未被收录的新肽。
[0154] 2.3.2.2同源建模
[0155] 采用同源性建模构建了鲜味受体亚基T1R1/T1R3的三维(3D)结构。
[0156] 通过UniProtKB数据库(http://www.rcsb.org/)检索并下载T1R1(Q7RTX1)和T1R3(Q7RTX0)的氨基酸序列FASTA文件，利用Modeller 10.4软件对T1R1进行序列对比，并通过NCBI网站的Protein BLAST工具检索与T1R1蛋白序列相似度较高的模板，这些模板中，同源性或是覆盖率最高的序列被选为受体模板进行单模板建模。Protein Blast结果显示，Medaka‑fish味觉受体的晶体结构(PDB ID:5X2M_B)与T1R1蛋白序列的一致性为34.75％，Modeller软件在PDB数据库中获取到的激素/生长因子(PDB ID:1DP4_A)和代谢型谷氨酸受体(PDB ID:1EWK_A)与T1R1的同源性分别为25.83％和24.9％。
[0157] T1R3模板的选择过程同T1R1，其与Medaka‑fish味觉受体的晶体结构(PDBID:5X2M_B)的序列一致性为37.29％，与激素/生长因子(PDB ID:1DP4_A)和代谢型谷氨酸受体(PDB ID:1EWK_A)的同源性分别为20.69％和25.38％。因此，选择了5X2M_B作为构建T1R1和T1R3结构的模板，序列对比图如图7(A：T1R1与5X2M_B的序列对比；B：T1R3与5X2M_B的序列对比)所示。
[0158] 借助在线对接工具HDock服务器(http://hdock.phys.hust.edu.cn/)将T1R1和T1R3亚基构建的模型连接起来，形成一个完整的寡聚蛋白，将其导入Autodock Tools软件进行优化。所选择的T1R1和T1R3晶体以及构建的寡聚蛋白T1R1/T1R3晶体均使用在线工具SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)中Procheck拉氏图评估模型结构的合理性。
[0159] 2.3.2.3分子对接
[0160] 使用Chem Draw和Chem3D软件，绘制小分子配体的3D结构，并将绘制好的多肽3D结构进行MM2能量最低化处理。鲜味受体T1R1/T1R3结构如2.3.2.2准备好后对其进行加氢和施加电场的预处理，利用在线软件Protein Plus
[0161] (https://proteins.plus/)预测鲜味受体的潜在活性位点，左侧的构象是鲜味受体T1R1亚基，右侧的构象是鲜味受体T1R3亚基，T1R1的VFT含有许多配体结合位点，已被证明负责配体的识别和结合，T1R3为辅助功能区，因此选择了T1R1空腔内的口袋作为活性对接位点，设置对接盒子，使之能够完全包裹活性位点。
[0162] 2.3.3数据处理
[0163] 分子对接采用AutoDock Vina软件实现，对接后的结果利用Discovery Studio进行可视化处理。
[0164] 2.4实验结果与分析
[0165] 2.4.1序列鉴定结果
[0166] 通过LC‑MS/MS对W3‑3组分进行了多肽的氨基酸序列鉴定，得到图8的总离子流色谱图，共包含2076条肽段序列，多肽的分子量均小于1200Da。图9A为鉴定出的2076条肽段的长度的分布，氨基酸长度在4以下的占总肽段的56.89％(1181条)，5～8个氨基酸占比37.38％(776条)，9～11个氨基酸的肽段占比5.68％(118条)，大于等于12个氨基酸的肽段占比0.05％(1条)。
[0167] 对组成肽段的氨基酸性质和分布进行统计，结果如图9B所示，2076条多肽由20种氨基酸组成，出现频率相对较高的前六个氨基酸为Phe、Tyr、Leu、Ala、Gly、Val，分别占比10.75％、9.66％、9.85％、8.86％、8.55％、7.94％。Seqlogo(图9C)可以根据不同长度多肽的氨基酸分布进行直观描述，氨基酸字符越大，表明在该位置上出现的频率越高。随着肽段长度的增加，组成多肽的氨基酸种类变得更加丰富，鲜味氨基酸出现的频率降低，疏水性氨基酸出现的频率增加。
[0168] 2.4.2多肽序列筛选结果
[0169] 分别采用在线预测程序对肽段的理化性质进行筛选，选择预测呈味特性为鲜味、易溶于水、无毒性且鲜味可能性大于95％的肽段，对鲜味肽的氨基酸组成进行筛选，所筛选的多肽必须含有酸性氨基酸(E、D)且是未在Uniprot数据库收录的新肽。筛选后获得20条潜在可能的鲜味肽，肽段序列如表2‑3所示。
[0170] 表2‑3多肽序列筛选结果
[0171]
[0172]
[0173] 2.4.3鲜味受体T1R1/T1R3的同源模拟
[0174] 2.4.3.1构建T1R1、T1R3的胞外结构模型
[0175] 利用Modeller 10.4软件对T1R1及其同源模板5X2M_B进行单模板建模，运行Modeller中的model‑single，构建了5个晶体模板，根据模板的DOPE值作为判定依据，选择了T1R1的第五个模板作为其胞外结构模型，其DOPE值为‑79011.57812，DOPE值越低，代表该模型越优。T1R3单模版构建过程同T1R1，选择T1R3的第一个模板作为其胞外结构模型，其DOPE值为‑78118.70312。
[0176] 2.4.3.2T1R1与T1R3模型评估
[0177] 拉氏图的主要应用是对同源建模后的模型质量的检测，不涉及能量，只检测蛋白质构象是否合理。在拉氏图中，主要分为四个区域，最适区(红色区域)，允许区(黄色区域)，最大允许区(浅黄区域)，不允许区(空白区域)，主要看模型氨基酸在几个区的分布情况，一般来说，落在允许区和最大允许区的氨基酸残基占整个蛋白质的比例高于90％，就可以认为该模型的构象符合立体化学的规则。图10分别给出了T1R1(图10A)和T1R3(图10B)蛋白模型的拉氏图结果，其中T1R1与T1R3亚基位于最适区的氨基酸残基占比分别为70.8％和77.9％，位于扭转角禁止区域的占比为3.5％和2.5％，分别有96.5％和97.5％的氨基酸残基的二面角处于在合理范围内，符合立体化学能量规则，说明构建的这两个亚基模型可靠。
[0178] 综上可知：通过NCBI数据库中的Protein Blast分析工具检索蛋白数据库(Protein data bank,PDB)的晶体结构，获得序列一致性较高的已知蛋白结构，经Modeller模板构建后并进行优化得到的T1R1和T1R3亚基的晶体模型是合理可靠的，能够以此模板来构建T1R1/T1R3鲜味受体的蛋白模型。
[0179] 2.4.3.3鲜味受体T1R1/T1R3模型评估
[0180] 通过HDOCK将构建的两个亚基T1R1和T1R3的晶体结构进行对接，得到11个T1R1/T1R3鲜味受体模板，筛选出对接结果中置信度得分最高的模型，再次与模板5X2M_B进行对比，构建的寡聚蛋白T1R1/T1R3鲜味受体的3D模型如图11A所示，异源二聚体T1R1/T1R3的两片叶片与铰链共同形成空腔，空腔之间的结构像捕蝇草，因此也被称为胞外捕蝇草结构域(VFT)。由图11B的拉氏图可以看出，99.3％的氨基酸残基位于合理区域(其中最适区域89.4％，允许区域为9.2％，一般允许区0.7％)，位于不允许区的氨基酸残基仅占0.7％，所以，根据90％的临界评价原则，表明我们通过HDOCK所构建的T1R1/T1R3鲜味受体模型是合理的。
[0181] 该T1R1/T1R3受体共包含1662个氨基酸，左侧的T1R1亚基为闭合构像，具有较小的封闭结合腔，右侧是开放的T1R3亚基。根据现有的研究可知，T1R1亚基主要负责鲜味物质的识别和鲜味传导，T1R3则是辅助功能区，故后续在对于对接活性位点的选择上，选择了T1R1的VFT作为与配体结合的主要区域。
[0182] 2.4.4鲜味受体T1R1/T1R3的分子对接
[0183] 2.4.4.1配体的准备
[0184] 采用Chem Draw和Chem3D软件对多肽进行结构绘制，对接前对配体进行MM2最小化力场处理，20条多肽的3D结构如图12所示。
[0185] 注：A‑T：多肽AREVYRT、YFDRA、FSDYK、YSDITRPG、REYISNL、FDRAAVS、YCDRVAA、GRVVYEGL、GIAGAREVY、DRIKSFVL、EAGYKY、EYGIR、EYLGR、YRPAD、LYDL、
[0186] SRVVVNSD、KDISF、VAEGVKC、VEKLRGYF、LEFR的3D结构2.4.4.2受体的准备[0187] 利用在线软件Protein Plus预测鲜味受体的活性位点，结果显示T1R1/T1R3受体共有64个活性对接位点，选择了T1R1空腔内的位点作为活性对接口袋，位置如图3‑7红色区域所示。对接口袋坐标XYZ方向的格点数设为40×40×40，格点间距为 对接盒子中心点坐标为(178.829,189.88,264.287)，对接次数设为10次，其余参数采用默认值，根据对接能的评分来评估分子对接结果，保留并展示最佳对接位点图以及对接结果的二维图和三维图。结果显示在图13。
[0188] 2.4.4.3对接结果
[0189] 分子对接采用AutoDock Vina实现，对接后的结果利用Discovery Studio进行2D、3D可视化处理。配体与受体对接能的大小反映出配体与受体的结合程度，‑对接能越大，相互作用力越强，对接的亲和力越高。表2‑3已根据理化性质和呈味活性筛选出20条符合要求的多肽，再根据对接能筛选出亲和力较强的前10位的配体，结果如表2‑4所示。
[0190] 对接能最大的是七肽AREVYRT，其次是五肽YFDRA、FSDYK以及八肽YSDITRPG，这3条肽的对接能相等。20条多肽中，‑对接能最大的前10条肽段包含2条五肽、4条七肽、3条八肽以及1条九肽，排名后十的多肽含有2条四肽、4条五肽、1条六肽、1条7肽以及2条八肽，说明对接能的大小与肽段的长度不存在显著的相关性，可能是在相同的对接空间里，短肽与受体形成相互作用的分子较少，而长链的鲜味肽与受体之间的距离更短，所以比短肽更易与受体结合。
[0191] 表2‑4多肽与T1R1/T1R3的分子对接能
[0192]
[0193] 10条鲜味肽和鲜味受体T1R1/T1R3对接的结合位点及3D、2D图如图14(注：A‑J：鲜味肽P1至P10与T1R1受体蛋白分子对接的结果；数字1‑3分别代表鲜味肽与T1R1受体蛋白的结合位点、3D结合图和分子间作用力的2D图；残基显示为不同颜色的球，相互作用力用不同颜色的线表示)所示，由图可观察到配体与受体残基之间的结合存在着多种作用力，以离子键、氢键和范德华力为主，此外还包括盐桥、静电相互作用等，这些相互作用可以增强肽段与受体蛋白的结合能力，形成稳定的复合物。P1至P10与T1R1结合的氢键个数分别是18、15、10、12、19、13、12、18、16、16，氢键的距离从 到 这一结果表明，所有的肽均能以较强的结合力与T1R1结合，形成稳定的多肽‑T1R1/T1R3复合物。由15D图可知，配体与受体之间形成离子键的氨基酸残基主要是Asp108、Asp147、Asp218、Glu301、Glu178以及Tyr220，以上氨基酸残基均为典型的呈味氨基酸。尤其是Glu301，既与多肽P3、P4、P9通过氢键形成作用力，又与多肽P2、P10形成离子键，与多肽P1、P5、P7和P8之间同时形成离子键和氢键，据报道，Glu301是T1R1/T1R3受体与配体结合的关键残基，在鲜味肽与T1R1亚基相互作用的活性位点中发挥关键作用，这与我们的研究一致。此外，肽段中的苯环，可以与受体蛋白中的氨基酸残基产生共轭作用，也能增加肽段与受体之间的结合力。
[0194] 本次实验对鲜味受体T1R1/T1R3中与鲜味肽结合的氨基酸残基的结合位点以及结合的氢键个数进行了分析，结果如图15所示。根据筛选出的多肽与T1R1/T1R3的分子对接结果表明，Ser385、Ser107、Asn69、Ser148、Ser276、Glu301、Ser276、Arg151、Asn150、Arg277为鲜味肽与鲜味受体相互作用的关键性结合位点，以上氨基酸残基均为极性氨基酸，可以与鲜味肽形成较多的氢键，从而使鲜味肽稳定的结合在T1R1/T1R3寡聚蛋白的活性位点附近，其中Ser385在所有的结合位点中出现的频率次数最高，几乎与所有的配体形成氢键，说明Ser385可能是配体与受体之间结合的关键残基。据报道，Arg151、Arg277、Ser148、Ser276是鲜味肽与鲜味受体T1R1结合的主要氨基酸残基，这些残基可能在呈鲜机制中起重要作用，有助于味觉特性的呈现。
[0195] 2.4.4.4鲜味肽的蛋白来源
[0196] 本研究根据液质联用结果进行了肽序列来源分析，由表2‑5可知，筛选出的10条鲜味肽主要来源于紫菜的藻胆蛋白。
[0197] 表2‑5鲜味肽的来源蛋白及蛋白ID
[0198]
[0199] 2.4.4.5鲜味肽的二级质谱图
[0200] 二级质谱图就是在一级质谱的基础上进行第二轮质谱分析，通过选择一级质谱中的特殊肽段母离子再次进行破碎检测，可以得到更多的离子质谱信息，从而为多肽的结构、含量、序列等鉴定提供数据支持。通过分子对接筛选出的10条鲜味肽进行合成，其二级质谱图如下图16‑25所示。
[0201] 实施例3合成肽的呈味特性及其对胃肠道激素的影响3.2实验材料与仪器[0202] 3.2.1实验材料
[0203] 表3‑1实验试剂
[0204]
[0205] 3.2.2实验试剂
[0206] 表3‑2主要试剂
[0207]
[0208] 3.2.3实验仪器
[0209] 表4‑3主要仪器和设备
[0210]
[0211] 3.3实验方法
[0212] 3.3.1合成肽的滋味轮廓分析
[0213] 感官评价小组包括4名男性和4名女性(年龄在22至28岁之间)，小组成员均为食品专业学生，已接受感官实验培训。将合成的10条多肽样品分别溶于超纯水中，配制成0.25mg/mL的多肽溶液，经0.2um水滤膜过滤后进行感官评价。配制0.08％柠檬酸溶液(w/v)、1％蔗糖溶液(w/v)、0.08％ L‑异亮氨酸(w/v)、0.08％ L‑异亮氨酸(w/v)、0.35％食盐溶液(w/v)、0.35％味精溶液(w/v)分别作为酸、甜、苦、涩、咸、鲜的标准溶液来训练小组成员，将标准溶液作为滋味强度为10分的参照，评价小组成员每品尝一个样品前，用纯净水漱口，并休息10s，口中无余味后，开始品尝下一个样品，并根据从0～10的标度分别为10条合成肽溶液打分，最终结果取8人评定值的平均值。
[0214] 3.3.2合成肽的电子舌测定
[0215] 电子舌检测同1.3.7.3。
[0216] 3.3.3合成肽的鲜味阈值测定
[0217] 对合成肽进行味觉稀释分析(TDA)，采用三角试验评估多肽的鲜味阈值。使用超纯水作为空白溶液，将合成肽配制成4.0mg/mL的溶液，以1:1(v/v)比例逐步稀释，并进行标记，直至评价小组成员无法从一份多肽溶液及两份空白溶液中识别出多肽溶液为止。记录小组成员能够明确分辨合成肽溶液与超纯水之间区别的最高浓度，将此时的浓度作为合成肽在水中的阈值。
[0218] 3.3.4合成肽对谷氨酸钠(MSG)的协同增鲜效果
[0219] 分别以0.05％MSG溶液和0.1％的MSG溶液作为参照，将0.05％合成肽添加到0.05％的MSG溶液中，形成0.05％合成肽+0.05％MSG混合溶液，并通过感官评价对混合溶液的鲜味进行评定，以确定合成肽的增鲜效果。
[0220] 3.3.5合成肽对食盐(NaCl)的协同效果
[0221] 分别以0.05％ NaCl溶液和0.1％的NaCl溶液作为参照，将0.05％合成肽添加到0.05％的NaCl溶液中，形成0.05％合成肽+0.05％ NaCl混合溶液，并通过感官评价对混合溶液的鲜味、咸味进行评定，以确定合成肽的增鲜、增咸效果。
[0222] 3.3.6STC‑1检测合成肽的呈味强度
[0223] 3.3.6.1细胞培养
[0224] (1)复苏：将1mL冻存细胞液在37℃水浴条件下迅速解冻，时间不超过1min，解冻后的细胞液加入2mL培养基混合均匀后，1000r/min条件下离心5min，弃去上清液并加入2mL培养基吹匀。然后将细胞悬液转移到T25培养瓶中，补加4mL培养基，摇晃瓶身至细胞均匀分布，放置于37℃、5％ CO2培养箱中培养过夜，第二天检查细胞是否附着。
[0225] (2)传代：当细胞长满瓶底80％～90％时，即可进行传代培养。取出培养瓶，用移液管吸出培养液，加入2mL不含钙、镁的HBSS缓冲液清洗2‑3次，并吸走此液，随后加入2mL含EDTA的胰蛋白酶，置于培养箱中消化1min，显微镜下观察细胞消化情况，细胞大部分变圆并脱落后，迅速拿回操作台，加2mL完全培养基终止消化。1000r/min条件下离心5min后，弃去上清液，补加1～2mL培养基，轻轻吹打均匀后吸出。将细胞悬液按照1:2到1:5的比例加入到T75培养瓶中扩大培养，补加培养基至每瓶10mL，标记后放入CO2培养箱培养。
[0226] (3)培养：置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，若细胞未长满整个瓶底，但培养基颜色变黄时，更换新的培养基继续培养，细胞培养的过程中要注意环境无菌。
[0227] (4)冻存：按照传代的步骤对细胞进行消化，消化终止后对细胞进行计数，之后再6
次离心取沉淀，根据细胞数量加入相应的细胞快速冻存液，使冻存的细胞密度在1×10个/mL左右，吹打至细胞均匀分布，加入冻存管，封口、标记，置于‑80℃长期冻存。
[0228] 3.3.6.2合成肽对细胞增殖作用的影响
[0229] (1)种板：设置空白组、对照组、实验组，每组3‑5个复孔。对照组和实验组按照1×5
10个/mL的细胞密度种板，每孔加入100uL，空白组加入等体积的完全培养基，培养板在37℃、5％ CO2培养箱中培养24h；
[0230] (2)给药：细胞贴壁良好后弃去培养基，实验组每孔加入100uL多肽溶液，对照组和空白组加入100uL的培养基，培养箱中继续孵育24h；(实验组的多肽浓度分别为0.5mM、1.0mM、2.0mM、4.0mM)；
[0231] (3)加入CCK‑8：各组吸弃培养基，CCK‑8与基础培养基按照1:9的比例混匀，每孔加入100uL，将培养板放入培养箱继续孵育30min；
[0232] (4)测OD值：孵育完成后，酶标仪450nm波长处测定96孔板OD值；
[0233] (5)结果分析：通过酶标仪获得各孔的吸光度值，细胞存活率为实验孔与空白孔吸光度的差值除以对照孔与空白孔的差值。
[0234] 细胞存活率＝[(As‑Ab)/(Ac‑Ab)]×100％(2)
[0235] As：实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK‑8溶液和药物溶液)；
[0236] Ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK‑8溶液、不含药物)；
[0237] Ab：空白孔吸光度(含培养基、CCK‑8溶液、不含细胞、药物)。
[0238] 3.3.6.3胞内钙离子含量检测
[0239] (1)细胞按照3.0×105个/mL的密度接种于24孔板，每个孔加入500uL，37℃，5％CO2培养箱孵育48h，至细胞占据孔板的80％左右进行实验；
[0240] (2)吸弃培养基，每孔加入500uL不同浓度的合成肽培养基溶液分别培养15min、30min、45min、60min；
[0241] (3)去除培养基，用HBSS清洗两次，每孔加入100uL细胞裂解液，用移液枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。
[0242] (4)充分裂解后，4℃、10000r/min条件下离心5min，取上清，冰上放置待测。
[0243] (5)根据Ca2+检测试剂盒说明书进行操作，处理完毕后，酶标仪575nm处测定吸光度值，标准曲线如图26所示。
[0244] 3.3.7合成肽对胃肠道激素的影响
[0245] 细胞以0.8×105个/mL的密度接种于24孔板中，每孔500uL，在37℃，5％ CO2的培养箱中培养48h。实验前，弃去培养基，用HBSS缓冲液洗涤2‑3次后，加入由HBSS缓冲液配制不同浓度的MSG和合成肽溶液(0.25mM、0.5mM、1.0mM)代替培养基(每孔500uL)，孵育30min后，10000r/min离心5min，收集上清液。使用不同激素试剂盒测定细胞培养上清液中对应的激素浓度。每个样品平行测定3次，空白对照组加入等量的HBSS缓冲液，酶标仪测量450nm处的吸光度值。
[0246] 3.3.7.1CCK浓度测定
[0247] 根据CCK试剂盒的说明方法进行操作，CCK浓度计算的标准曲线如图27所示。3.3.7.2GLP‑1浓度测定
[0248] 根据试剂盒的说明方法进行操作，GLP‑1浓度计算的标准曲线如图28所示。
[0249] 3.3.7.3GIP浓度测定
[0250] 根据试剂盒的说明方法进行操作，GIP浓度计算的标准曲线如图29所示。
[0251] 3.3.7.4PYY浓度测定
[0252] 根据试剂盒的说明方法进行操作，PYY浓度计算的标准曲线如图30所示。
[0253] 3.3.8数据处理
[0254] 实验重复3次，每次3组平行，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS21.0软件处理数据，Origin 2023进行图像绘制。数据后标注的不同字母表示数据间的显著性差异，显著性以P＜0.001(***)、P<0.01(**)为极显著，P<0.05(*)为显著，P>0.05为不显著。
[0255] 3.4实验结果
[0256] 3.4.1合成肽的滋味特征分析
[0257] 为判断筛选出的肽段是否为鲜味肽，将其合成后采用感官评价结合电子舌的分析方法，对合成肽的滋味轮廓进行描述，并采用雷达图进行表示，结果如图31(注：A：感官评价滋味轮廓；B：电子舌滋味轮廓)所示。由图可知，在0.25mg/mL浓度下，10条合成肽均具有鲜味肽的滋味特征，滋味强度上有所差别。P5、P9的鲜味强度较强，最接近于标准物质，其次是P10、P8及P1，剩余5条多肽的鲜味强度相对较弱。感官评价中合成肽的鲜味、咸味及酸味较强，可能是所筛选的肽段除具有鲜味肽的滋味轮廓外，还具有咸味特征，又或是肽段本身具有咸味，咸味可与肽段的鲜味起到协同增鲜的效果。图31B是合成肽在0.25mg/mL的电子舌滋味轮廓图，10条多肽的滋味轮廓相似，滋味强度上不存在显著性差异，但与凝胶组分W3‑3相比，鲜味强度提高为此前的2倍，酸涩味均有所提高，酸味可能是由合成肽中羧基解离出的氢离子引起，苦涩味可能是多肽在合成过程中残留的化学试剂所致，如三氟乙酸、乙酸钠等。
[0258] 图32是合成肽的氨基酸组成分布。由图可知，合成肽序列中氨基酸占比较高的为鲜味氨基酸、苦味氨基酸及疏水性氨基酸，结合合成肽的滋味轮廓图可知，鲜味肽的鲜味强度与鲜味氨基酸的占比之间不具有明显的正相关关系，P10与P8中苦味氨基酸的占比分别为62.5％和50％，苦味氨基酸的占比较高，但并未削弱多肽的鲜味，而肽的末端大多为疏水性氨基酸，这可能也是多肽呈现苦涩味的原因之一。根据已知的多肽序列及其呈味强度，我们发现N端是亲水性氨基酸，C端是疏水性氨基酸的多肽比N端为疏水性氨基酸，C端是亲水性氨基酸的多肽具有更强的鲜味强度，电子舌评价中P10的鲜味强度与P9的鲜味强度相同，可能是因为P10中的Asp位于多肽的末端且Asp能够削弱多肽的苦味。
[0259] 3.4.2合成肽的描述性评价特征
[0260] 对10条合成肽进行味觉特征的描述性评价，结果如表3‑4所示。10条合成肽均表现出一定程度的鲜味特征，并伴有酸味、咸味及苦涩味。其中P4与P5还表现出一定的甜味特征，而P1、P8及P9则表现出明显的苦涩味。通过感官评价对10条肽在水溶液中的阈值测定，P2、P3、P6的阈值相同(0.0625mg/mL)，其余肽段均为0.125mg/mL，阈值的大小可能与肽段的长度有关，较短的肽段可能会呈现出更低的味觉阈值。
[0261] 表3‑4合成肽水溶液感官特性及鲜味阈值
[0262]
[0263] 3.4.3合成肽与MSG的协同增鲜效果
[0264] 为了进一步评价合成肽对MSG的协同增鲜效果，将合成肽分别添加到0.05％的MSG溶液中进行感官评价，结果如图33所示。添加合成肽后的溶液的鲜味强度较单纯的0.05％的MSG溶液的鲜味均有一定程度的提高，但增鲜程度不同。其中P4和P9的增鲜效果最强，其复配后的鲜味强度与0.1％的MSG溶液相当，其余多肽的增鲜效果相对较弱。因此，将鲜味肽与MSG复配应用于呈味基料的开发，可实现一定的增鲜效果。
[0265] 3.4.4合成肽与NaCl的协同效果
[0266] 为评价鲜味肽与NaCl的协同增鲜、增咸效果，将合成肽分别添加到0.05％的NaCl###，溶液中进行感官评价，结果如图34(注：A：增鲜效果；B增咸效果 P<0.01vs 0.05％NaCl***
组， P<0.001vs 0.1％ NaCl组)所示。在添加0.05％的合成肽后，NaCl溶液的鲜味强度明显提高，其中P5的增鲜作用最强。添加合成肽的NaCl溶液咸味强度较0.05％的NaCl溶液有一定的提高，其中P4的增咸效果最强，咸味强度与0.1％ NaCl溶液相当，其次是P2、P6及P7，其余多肽的增咸效果不明显，增咸的原因可能是NaCl的加入对多肽的构象产生一定的影响，使其更有利于咸味的表达。
[0267] 上述结果表明，合成的10条鲜味肽具有一定的增鲜效果，减盐效果虽不明显，但相较于同等质量浓度的NaCl溶液略有提高。因此，可利用鲜味肽代替部分钠盐，在保证口感的+同时减少Na的摄入，减少高血压等相关疾病的发生。
[0268] 3.4.5STC‑1细胞检测合成肽的呈味强度
[0269] 3.4.5.1细胞增殖实验
[0270] 结合感官评价和电子舌的检测结果，我们选择了鲜味较强的6条合成肽和MSG进行细胞实验，细胞增殖结果如图35所示。在0.5、1.0、2.0、4.0mM的浓度下，MSG及所有的肽处理组的细胞存活率均超过90％，且P3、P5、P8及P9处理后四组的细胞存活率均大于对照组，说明合成肽对细胞的生长并无毒副作用。P3处理组对细胞的存活率随浓度的增加而增加，而MSG组和P7处理组却随浓度的增加而降低，但始终大于93％，其他四组肽处理组的细胞存活率均呈现先增加后降低的趋势，说明浓度过高的多肽溶液对细胞的增长还是存在一定的抑制作用，因此，选择1.0mM以下的处理浓度进行后续的试验。
[0271] 3.4.5.2合成肽干预后对胞内Ca2+释放的影响
[0272] 当使用MSG和合成肽溶液处理STC‑1后，随着处理浓度和时间的变化，细胞内Ca2+浓度的变化如图36(注：A：15min；B：30min；C：45min；D：60min)所示。图36A表明，加入不同浓度2+
的MSG和合成肽溶液处理15min后，细胞内Ca 的浓度均显著高于空白组(0.056±0.09mM)，
2+
表明MSG和合成肽处理组在短时间内均能引起细胞响应。各组的Ca 响应浓度随处理浓度的
2+
增加均呈现先增加后降低的趋势，且在处理浓度为0.25mM时，Ca 响应浓度达到最大，说明合成肽的呈味效果并不会随着处理浓度的增加而一直增强，有可能浓度越大，呈味效果越
2+
差。此外，所有的合成肽组在各处理浓度下的Ca 响应浓度均接近但低于MSG组，推测可能是因为合成肽的呈鲜强度低于MSG，与感官评价和电子舌结果一致。
[0273] 图36B为MSG和合成肽孵育30min后STC‑1内Ca2+浓度的变化。在处理30min后，MSG和2+
合成肽处理组的Ca 浓度均大于空白组(0.054±0.003mM)，说明在一定时间内，MSG和合成
2+
肽处理会使STC‑1中Ca 的浓度在一定时间保持在较高的浓度，这可能会引起下游信号的持续传递，从而可能使得这些肽的呈味持续性较强。在0.25mM浓度处理时，STC‑1对P3、P5、P9
2+
的刺激较MSG具有更低浓度的Ca 响应，这说明在此时间处理下，P3、P5、P9呈味效果可能优
2+
于MSG，特别是P3处理组，对细胞Ca 响应浓度的峰值(0.186±0.004mM)与MSG在0.5mM时的峰值(0.189±0.07mM)相当。此外，除P7和P8处理后呈现先上升后下降的趋势，其他处理组
2+
细胞Ca 响应浓度均随着处理浓度的增大而增大。
[0274] 图36C为MSG和合成肽处理45min后STC‑1内Ca2+浓度的变化。在处理45min后，MSG和2+ 2+
合成肽处理组的Ca 浓度均大于空白组(0.062±0.009mM)，P3、P8和P9组Ca 的响应浓度随处理浓度的增加而增加。在0.25mM浓度下，STC‑1对P5(0.142±0.002mM)和P10(0.153±
2+
0.001mM)的响应浓度低于MSG(0.097±0.001mM)，MSG和其他合成肽处理组的Ca 响应浓度均随处理浓度的增加呈现先增加后降低的趋势，其中P3、P5和P10处理组几乎在各处理浓度
2+
下，细胞内Ca 的响应浓度均高于MSG，说明在此处理时间下，P3、P5和P10的呈味强度和呈味持久性可能都优于MSG。
[0275] 图36D为MSG和合成肽孵育60min后STC‑1内Ca2+浓度的变化。在处理60min后，MSG和2+
合成肽处理组的Ca 浓度均大于空白组(0.056±0.005mM)，但MSG和合成肽处理浓度的变化
2+ 2+
对Ca 浓度的影响减弱。在0.5mM处理时，P5处理组(0.133±0.011mM)为此时间下Ca 浓度
2+
的响应峰值，除P3、P7和P9处理组Ca 的响应浓度均随处理浓度的增加呈现先增加后降低的
2+
趋势，MSG和其余合成肽组Ca 的响应浓度均随处理浓度的增加而增加。
[0276] 由图36可知，随着处理时间的延长，各处理组对应的细胞内Ca2+响应浓度逐渐下降，但始终高于空白组，说明STC‑1在一定时间内可对MSG和合成肽的处理做出响应，这可能会引起下游信号的持续传递，从而使得这些肽的呈味持续性较强。但随着处理时间的延长，2+ 2+
Ca 响应浓度的变化范围减小，促进Ca 响应浓度达到峰值时所需的处理浓度也持续增大，表明STC‑1对MSG和合成肽刺激的响应具有时效性，处理时间越长，呈味效果越差。此外，P3
2+
组几乎在各处理时间内，细胞内Ca 响应浓度都高于MSG组，这可能是因为P3的肽段最短，且具有最低的呈味阈值。
[0277] 3.4.6合成肽对STC‑1中胃肠道激素的影响
[0278] 3.4.6.1MSG和合成肽对STC‑1细胞分泌CCK的影响
[0279] STC‑1暴露于不同浓度的MSG和合成肽溶液中(0.25mM、0.5mM、1.0mM)，导致CCK释放的浓度显著增加，结果如图30所示。MSG可诱导CCK的释放，但不是呈剂量依赖性。其中0.25mM的MSG组CCK的释放浓度(48.92±1.26pg/mL)较空白对照组(38.92±1.61pg/mL)增长了25.7％，其余浓度的MSG(0.5mM、1.0mM)对CCK释放的影响相同。暴露于P3、P9、P10组的STC‑1分泌的CCK浓度呈剂量依赖性增加，在1.0mM浓度下，P3(51.73±1.15pg/mL)、P9(54±
1.05pg/mL)、P10(50.9±0.43pg/mL)与空白对照组对比，CCK分泌量分别增加了32.9％、* ** ***
38.7％和30.8％。结果显示在图37(P<0.05，P<0.01， P<0.001vs Control组)。
[0280] 3.4.6.2MSG和合成肽对STC‑1细胞分泌GLP‑1的影响
[0281] MSG和合成肽处理组对STC‑1释放的GLP‑1的影响如图38(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs Control组)所示。MSG和合成肽处理在每种浓度下的GLP‑1水平显著高于空白对照组(0.28±0.03pM)，且MSG、P8及P10组呈剂量依赖性。在0.25mM浓度处理下，P5组的GLP‑1浓度最大(0.67±0.01pM)，是空白组的2.38倍；0.5mM处理下，MSG组的CCK释放量(0.69±
0.04pM)与P8组在1.0mM处理下的释放量(0.68±0.09pM)相当；1.0mM处理下，MSG组(0.74±
0.08pM)与P10组(0.76±0.08pM)的GLP‑1释放量相当。
[0282] 3.4.6.3MSG和合成肽对STC‑1细胞分泌GIP的影响
[0283] MSG与合成肽处理组对STC‑1分泌GIP的影响如图39(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs Control组)所示，P3、P5及P10组随处理浓度的增大，GIP的释放量呈现出先增加后降低的趋势，P7、P9组GIP浓度随多肽浓度的增加而降低，而MSG处理组在不同浓度处理下，GIP的释放量均低于空白对照组(150±2.5pg/mL)。在0.25mM处理下，P3(168.79±1.26pg/mL)、P7(170.58±0.44pg/mL)、P9(172.25±1.43pg/mL)及P10(169.1±1.21pg/mL)对GIP的释放具有促进作用，但促进效果不明显；0.5mM处理下，合成肽各组均能促进GIP的分泌，除P3(203.35±3.45pg/mL)的促进效果较强外，其他合成肽组的促进效果不明显。1.0mM处理下，P10组(190.51±0.31pg/mL)对GIP的释放量较空白对照组高外，其余各组在1.0mM下的GIP释放量均低于空白对照组。因此，MSG及合成肽处理对STC‑1分泌GIP无明显促进作用。
[0284] 3.4.6.4MSG和合成肽对STC‑1细胞分泌PYY的影响
[0285] MSG和合成肽处理组对STC‑1分泌PYY的影响如图40(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs Control组)所示，空白组的PYY浓度为0.59±0.01ng/mL，MSG处理后，STC‑1分泌的PYY浓度随处理浓度的增加而降低，但均高于空白组；P3、P5、P9均随处理浓度的增大呈现出先上升后下降的趋势，并在处理浓度为0.5mM时达到峰值(分别为1.31±0.01ng/mL、1.53±
0.04ng/mL、1.33±0.01ng/mL)，P7、P10组随处理浓度的增大而降低，而P8组则随处理浓度的增大而增大。各组的变化趋势虽然不同，但在各处理浓度下，都显著促进了STC‑1对PYY的分泌。
[0286] 通过感官评价结合电子舌的检测方法对合成肽的滋味轮廓进行分析，并通过体外实验论述鲜味肽的呈味特性与处理浓度和时间的关系，依据STC‑1本身是内分泌细胞的特点，验证合成肽对细胞内胃肠道激素分泌的影响。主要结论如下：
[0287] (1)合成的10条新型鲜味肽，感官评价和电子舌结果均显示具有鲜味特征，且鲜味强度接近于鲜味评价基准物质谷氨酸钠溶液，鲜味肽的滋味轮廓相似，鲜味阈值在0.0625mg/mL～0.125mg/mL，其中P5、P9的鲜味最强；
[0288] (2)将合成肽分别添加到MSG溶液和NaCl溶液中，发现在0.5％浓度下，合成肽对溶液的鲜味强度具有一定的提升，其中P4、P9的增鲜效果最明显，且P4对0.5％的NaCl溶液还具有显著的增咸作用；
[0289] (3)通过体外实验，选择MSG和6条鲜味肽进行后续实验。在分别处理15min、30min、2+
45min、60min后，测定STC‑1内Ca 的浓度变化，发现多肽的呈味强度并不会随着多肽溶液浓度的增加而一直增大，有可能浓度越大，呈味效果越差，且细胞对多肽的呈味反应具有一定的时效性，呈味强度会随处理时间的延长而降低；
[0290] (4)基于STC‑1为内分泌细胞的特征，检测合成肽对细胞内胃肠道激素分泌的影响，结果显示，合成肽对CCK、GLP‑1、PYY的分泌都具有显著的促进作用，对GIP的分泌无明显的影响，表明合成肽有开发为具有减肥功效的功能性调味品的潜质。
