技术领域
[0001] 本发明属于肝病的治疗技术领域，具体涉及一种单环刺螠改造多肽在制备治疗酒精肝损伤药物中的应用。
相关背景技术
[0002] 酒精(乙醇)是一种水溶性小分子，通过胃和近端小肠进入血液，然后分布到全身。它首先进入门静脉，门静脉直接排入肝脏。肝脏是接触酒精最多的地方，消除了90％酒精，其他直接通过尿液、汗液和呼吸排出。酒精性肝损伤(ALD)是一种由长期或过度饮酒引起的全球流行慢性肝病，其临床病变包括脂肪变性、纤维化、酒精性肝炎、肝硬化和肝癌等。酗酒是世界第三大疾病和残疾风险因素；它是60种疾病和伤害的起因，也是至少200种其他疾病和伤害的并发原因。肝脏是负责代谢乙醇的主要器官，因此长期以来一直被认为是使用酒精的主要受害者。乙醇及其生物活性产物乙醛‑乙酸酯、脂肪酸乙醇酯、乙醇‑蛋白质加合物等被认为是直接或间接对肝脏产生毒性作用的肝毒素。据估计，使用酒精每年导致大约250万人死亡，其中大部分由于酒精性肝损伤。自2011年起，乙型肝炎、丙型肝炎患病人数均有所减少，而酒精性脂肪性肝病患者人数逐年增加。与其他终末期肝病一样，肝移植被认为是ALD的最终治疗方法。但此方法风险高、成本高、配型困难，术后免疫排斥强烈且需要长时间服用抗排斥药物。因此，寻找新型ALD的治疗药物极为迫切。
具体实施方式
[0038] 为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0039] 实施例1单环刺螠改造多肽对HepG2细胞酒精性肝损伤保护作用研究
[0040] 1.1实验材料与仪器
[0041] 1.1.1实验细胞
[0042] HepG2细胞(人肝癌细胞)，来源于中国科学院上海细胞库。
[0043] 1.1.2实验药品
[0044] 单环刺螠(Urechisuninctus)改造多肽委托上海楚肽生物科技有限公司进行合成，纯度≥95％。
[0045] 表1‑1：单环刺螠(Urechisuninctus)改造多肽的肽链序列(N‑‑C)和分子量
[0046]
[0047] 1.1.3实验试剂
[0048] 表1‑2：实验试剂
[0049]
[0050] 1.1.4主要仪器
[0051] 表1‑3：实验仪器
[0052]
[0053]
[0054] 1.2实验方法
[0055] 1.2.1 ADH激活率测试
[0056] 乙醇脱氢酶(ADH)被认为是限制体内酒精代谢的限速步骤，ADH活力与酒精代谢速率之间呈现良好的相关性。因此，采用体外激活ADH活性来反应样品在体内酒精代谢的能力。表1‑1中8条单环刺螠多肽样品，采用改良的试剂盒进行检测，检测方法基于如下方程式：
[0057] CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+
[0058] NADH在340nm下有最大吸收峰，具体操作如下：将50μL样品(0.1mg/mL)溶液与150μ+L检测试剂(包含缓冲液、NAD和乙醇)混合，在37℃下平衡5min后，添加50μL ADH(0.2U/mL)引发反应。使用酶标仪检测340nm下吸光度值，每15s记录一次，持续10min。蒸馏水代替样品作为阴性对照。拟合反应动力学曲线，求得曲线在0min时的一阶导数，即为初始反应速率。
初始反应速率可表征ADH相对酶活力。样品的初始反应速率记录为Vs，而阴性对照的记录为V0。根据以下方程即可求得样品的ADH激活率：
[0059] ADH激活率(％)＝(VS‑V0)/V0*100％
[0060] 测试结果显示在图1，注：a‑d相同字母之间无显著性差异(P＞0.05)。
[0061] 1.2.2单环刺螠改造多肽对细胞酒精性肝损伤保护作用
[0062] 1.2.2.1 HepG2细胞培养
[0063] 细胞复苏：将冻存的细胞从超低温冰箱中取出，快速用37℃水浴锅融化，转移至放10ml EP管中，EP管中放5ml完全培养基，以减轻DMSO的损伤。将离心管放至低速离心机中，
1000r/min离心5分钟，弃去上清。加入普诺赛的HepG2专用培养基，反复吹打将细胞吹成单细胞悬液，放至37℃、5％ CO2孵育箱中培养12h后换液。继续培养至细胞密度为90％，用含EDTA的0.25％的胰蛋白酶进行消化传代。细胞复苏后两代不适宜进行实验，待细胞长至3代后进行实验操作。期间注重无菌操作。
[0064] 1.2.2.2酒精诱导的HepG2细胞损伤模型的建立
[0065] 细胞密度长至90％时，消化传代，吹成单细胞悬液。使用细胞计数板进行计数，制4
备成8×10个/孔的细胞悬液，每个孔加入180μL细胞悬液。将96孔板置于37℃、5％ CO2的细胞恒温培养箱中孵育24h。分别以梯度浓度200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM(终浓度)的无水乙醇损伤24h。空白对照组无添加。将96孔板中所有的溶液吸出，向每孔中加入
10％的CCK‑8溶液100μL，培养1h后在酶标仪450nm处测定吸光度。计算公式为：
[0066] 细胞存活率(％)＝(OD实验组/OD空白对照组)×100％。
[0067] 结果显示在图2，a‑f相同字母之间无显著性差异(P＞0.05)。
[0068] 1.2.2.3单环刺螠改造多肽的浓度对HepG2细胞损伤的保护作用
[0069] 取HepG2细胞，消化、离心、重悬，将细胞接种于96孔板中。将HepG2细胞调整为8×4
10个/孔的细胞悬液，每个孔加入160μL细胞悬液。将孔板放置于37℃、5％ CO2的孵育箱中培养24h后，空白孔中加入20μL纯水为空白组。参考1.2.2.2及空白组细胞样品的制备，建立无水乙醇损伤模型，用500mM的无水乙醇损伤HepG2细胞24h，模型组加入20μL纯水，阳性对照孔中加入20μL终浓度为3mM的N‑乙酰‑L‑半胱氨酸(NAC)，给药孔中加入20μL终浓度为200μM、300μM、400μM的单环刺螠改造多肽F2‑1(溶于水)，将孔板放置于37℃、5％CO2的孵育箱中培养24h加入造模液24h。将96孔板放置于37℃、含5％CO2的细胞孵育箱中孵育24h，将96孔板中所有的溶液吸出，向每孔中加入10％的CCK‑8溶液100μL，培养1h后在酶标仪450nm处测定吸光度。计算公式为：
[0070] 细胞存活率(％)＝(OD实验组/OD空白对照组)×100％。
[0071] 结果见图3，Vs control：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；Vs model：###P<0.001，##P<#0.01，P<0.05。
[0072] 1.2.3单环刺螠改造多肽对HepG2细胞酒精性肝损伤的功能性保护
[0073] 1.2.3.1细胞样品制备
[0074] 取HepG2细胞，消化、离心、重悬，将细胞接种于6孔板中。将HepG2细胞调整为1×6
10个/孔的细胞悬液，每个孔加入1.6mL细胞悬液。将6孔板放置于37℃、5％ CO2的孵育箱中培养24h后，空白孔中加入200μL纯水为空白组。参考1.2.2.2及空白组细胞样品的制备，建立无水乙醇损伤模型，用500mM的无水乙醇损伤HepG2细胞24h，模型组加入200μL纯水，阳性对照孔中加入200μL终浓度为3mM的N‑乙酰‑L‑半胱氨酸(NAC)，给药孔中加入200μL终浓度为200μM、300μM、400μM的单环刺螠改造多肽F2‑1(溶于水)，将孔板放置于37℃、5％CO2的孵育箱中培养24h后加入造模液，继续在37℃、5％CO2的孵育箱中培养24h。将6孔板拿出置于冰上，弃去板内所有的液体，用提前预冷过的PBS洗涤三次，加入高效RIPA裂解液，在冰上裂解30min，冷冻离心12000r/min离心10分钟，弃去白色沉淀物。
[0075] 1.2.3.2细胞生化指标的测定
[0076] 从南京建成生物有限公司购买试剂盒，使用酶标仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL‑C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)等生化指标。
[0077] 单环刺螠改造多肽F2‑1对ALT含量的影响显示在图4，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；单环刺螠改造多肽F2‑1对AST含量*** ** * ### ##
的影响显示在图5，Vs control： P<0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<#
0.01，P<0.05。
[0078] 以HepG2细胞内胆固醇(T‑CHO)和甘油三酯(TG)的含量判断不同浓度下，单环刺螠改造多肽F2‑1对酒精性肝损伤的保护作用，这两个指标是评价血脂是否异常的重要指标。*** ** *
单环刺螠改造多肽F2‑1对TC含量的影响显示在图6，Vs control： P<0.001，P<0.01，P<### ## #
0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0079] 单环刺螠改造多肽F2‑1对TG含量的影响显示在图7，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05。
[0080] 以HepG2细胞内高密度脂蛋白(HDL‑C)和低密度脂蛋白(LDL‑C)的含量判断不同浓度下，单环刺螠改造多肽F2‑1对酒精性肝损伤的保护作用，这两个指标是评价血脂是否异***常的重要指标。单环刺螠改造多肽F2‑1对HDL‑C含量的影响显示在图8，Vs control： P<** * ### ## #
0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；单环刺螠改造多肽F2‑1*** ** * ###
对LDL‑C含量的影响显示在图9，Vs control： P<0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<## #
0.001，P<0.01，P<0.05。
[0081] 1.2.3.3细胞ELISA指标的测定
[0082] 从杭州乐毅生物科技有限公司购买试剂盒，使用酶标仪检测白介素1β(IL‑1β)ELISA试剂盒，白介素6(IL‑6)ELISA试剂盒，细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)ELISA试剂盒等指标的测定。
[0083] 以HepG2细胞内CYP2E1的含量判断不同浓度下，单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞的保护作用。CYP2E1是一种在内质网(ER)和肝细胞线粒体中发现的酶，可在氧气存在下将酒精代谢为乙醛。乙醛直接上调甾醇调节元件结合蛋白‑1c(SREBP‑1c)的表达，促进甘油三酯的合成，造成肝脏脂质代谢紊乱。单环刺螠改造多肽F2‑1对CYP2E1活性的影响显示在*** ** * ### ## #图10，Vs control： P<0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05。
[0084] 以HepG2细胞内IL‑1β的含量判断不同浓度下，单环刺螠改造多肽F2‑1的抗炎效*** **果。单环刺螠改造多肽F2‑1对IL‑1β活性的影响显示在图11，Vs control： P<0.001，P<* ### ## #
0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05。
[0085] 以HepG2细胞内IL‑6的含量判断不同浓度下，单环刺螠改造多肽F2‑1的抗炎效果。*** ** *
单环刺螠改造多肽F2‑1对IL‑6活性的影响显示在图12，Vs control： P<0.001，P<0.01，### ## #
P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05。
[0086] 1.3数据统计
[0087] 所有数据以(x±SD)表示，采用spss软件统计分析，用独立样本的单因素方差统计分析进行差异显著性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
[0088] 1.4实验结果
[0089] 1.4.1ADH激活率测试
[0090] 参阅图1，ADH的活力与酒精在体内被代谢的速率之间呈现正相关，因此本发明选择测量ADH激活率去评价单环刺螠改造多肽对酒精的清除速率。结果如图1所示，表1‑1中8条单环刺螠改造多肽均有激活ADH活性的作用，其中，F2‑1的ADH激活率最高，表明F2‑1具有能清除酒精的最佳能力。
[0091] 2.4.2无水乙醇诱导的HepG2细胞酒精性肝损伤模型的建立
[0092] 参阅图2，随着无水乙醇浓度的升高，与空白组相比较，会对HepG2细胞存活率造成显著性差异(P<0.05)。从图2分析可以看出，细胞存活率随着无水乙醇浓度增加而下降。在200mM时，细胞存活率受无水乙醇有显著性差异；在500、600、700mM时，细胞存活率受无水乙醇作用时间影响更为显著。根据相关文献，损伤模型条件以细胞存活率为50％时最佳。参照图2可知，当无水乙醇浓度为500mM，损伤时间为24h时，HepG2的存活率为56.83±1.00％，与空白组对照，具有统计学意义。因此，本发明选择500mM无水乙醇作用于HepG2细胞24h，建立细胞损伤模型。
[0093] 1.4.3不同浓度单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞酒精损伤的保护作用
[0094] 结果如图3所示，与空白组相比，模型组细胞存活率为54.69±1.99％，在统计学意义上是极显著的。一般认为，模型在损伤50％左右时认为模型建立成功，因此，认为此酒精性肝损伤模型建立成功。给药组与模型组相比，给药组中细胞存活率随着多肽F2‑1浓度的增加而呈现上涨趋势，低剂量使细胞存活率达到80.65±5.67％(P<0.05)，中剂量达到85.39±9.61％(P<0.01)，高剂量组达到94.58±4.22％(P<0.001)，说明多肽F2‑1浓度与细胞存活率呈剂量依赖性。
[0095] 1.4.4单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中中生化指标的影响
[0096] 1.4.4.1单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中ALT和AST含量的影响
[0097] 参阅图4和图5，表达的是单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中AST、ALT含量的影响。模型组与空白组相比AST和ALT极显著上升(P<0.001)，表明HepG2细胞酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比，NAC能使ALT、AST含量分别从24.07±2.09U/L、22.19±0.52U/L下降至7.93±0.14U/L、8.26±0.30U/L，接近正常水平(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量效果一般，对AST有效(P<0.001)，下降至16.29±0.34U/L。中剂量可以极显著的降低AST和ALT的含量(P<0.001)，使ALT下降至16.28±0.89U/L，AST下降至11.78±0.73U/L。高剂量效果最好，极显著的降低AST和ALT的含量(P<0.001)，使ALT下降至8.15±0.81U/L，AST下降至9.45±0.35U/L。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽F2‑1均能降低HepG2细胞中ALT及AST的含量，且有剂量依赖性。
[0098] 1.4.4.2单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中TC和TG含量的影响
[0099] 参阅图6和图7，表达的是单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中TC、TG含量的影响。模型组与空白组相比TC显著上升(P<0.01)，TG极显著上升(P<0.001)，表明HepG2细胞酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比，NAC能使TC、TG含量分别从0.12±0.02(mmol/L)、0.59±0.02(mmol/L)下降至0.06±0.02(mmol/L)、0.49±0.00(mmol/L)，接近正常水平(P<
0.001)。给药组与模型组相比，低剂量效果一般，在统计学上无意义。中剂量可以显著的降低TC、TG的含量，使TC、TG分别下降至0.07±0.01(mmol/L)、0.50±0.01(mmol/L)。高剂量效果最好，极显著的降低TC和TG的含量(P<0.001)，分别下降至0.06±0.00(mmol/L)、0.46±
0.01(mmol/L)。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽F2‑1均能降低HepG2细胞中TC及TG的含量，且有剂量依赖性。
[0100] 1.4.4.3单环刺螠改造多肽F2‑1对HepG2细胞中HDL‑C和LDL‑C含量的影响
[0101] 参阅图8和图9，表达的是单环刺螠改造多肽F2‑1对HDL‑C、LDL‑C含量的影响。模型组与空白组相比HDL‑C含量显著下降(P<0.001)，LDL‑C含量显著上升(P<0.001)表明HepG2细胞酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比，NAC能使HDL‑C含量从0.04±0.00(mmol/L)上升至0.12±0.02(mmol/L)(P<0.001)，使LDL‑C含量极显著从0.02±0.00(mmol/L)下降至0.01±0.00(mmol/L)(P<0.01)。给药组与模型组相比，低剂量只对HDL‑C有效果(P<0.05)，使HDL‑C含量上升至0.08±0.00(mmol/L)。中剂量可以显著的提高HDL‑C的含量(P<
0.01)，使之提升至0.10±0.02(mmol/L)。高剂量效果最好，使HDL‑C上升至0.12±0.02(mmol/L)，可以显著提高HDL‑C的含量(P<0.001)，也可以显著的降低LDL‑C的含量(P<
0.01)，使之降低至0.01±0.01(mmol/L)。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽能提高HepG2细胞中HDL‑C的含量，高剂量能降低HepG2细胞中LDL‑C的含量，且有剂量依赖性。
[0102] 综上所述：ALD总是伴随着由过量酒精引起的脂质代谢失衡引起的肝脏脂肪变性。F2‑1可以降低HepG2细胞中ALT、AST、TC、TG、LDL‑C的含量，说明它能减少肝细胞中的脂质积累和随后的脂肪变性，对肝脏具有保护作用。
[0103] 1.4.6细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)含量测定
[0104] 参阅图10，与空白组相比较，模型组HepG2细胞中含量CYP2E1显著上升(P<0.01)，证明模型建立成功。NAC组与模型组相比，NAC使CYP2E1含量极显著的从10.05±0.19(U/mgprot)下降至7.80±0.96(U/mgprot)(P<0.01)。给药组与模型组相比，低剂量、中剂量使CYP2E1下降不明显，在统计学上无意义。高剂量使CYP2E1含量显著下降至7.97±0.78(U/mgprot)(P<0.01)。
[0105] 结果表明随着单环刺螠改造多肽浓度的增加，HepG2细胞内CYP2E1含量逐渐下降，即HepG2细胞中CYP2E1的含量与单环刺螠改造多肽F2‑1存在浓度依赖性。
[0106] 1.4.7单环刺螠改造多肽对HepG2细胞培养液中炎症因子含量的影响
[0107] 1.4.7.1白介素1β(IL‑1β)含量测定
[0108] 参阅图11，与空白组相比较，模型组HepG2细胞中含量IL‑1β显著上升(P<0.001)，证明模型建立成功。NAC组与模型组相比，NAC使IL‑1β含量极显著的从145.94±3.24(pg/mL)下降至123.36±1.67(pg/mL)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量使CYP2E1下降不明显，在统计学上无意义。中剂量使IL‑1β含量显著下降至129.62±0.50(pg/mL)(P<0.01)，高剂量使IL‑1β含量极显著下降至121.33±3.20(pg/mL)(P<0.001)。
[0109] 结果表明随着单环刺螠改造多肽浓度的增加，HepG2细胞内IL‑1β含量逐渐下降，即HepG2细胞中白介素1β含量与单环刺螠改造多肽F2‑1存在浓度依赖性。
[0110] 1.4.7.2白介素6(IL‑6)含量测定
[0111] 参阅图12，与空白组相比较，模型组HepG2细胞中含量IL‑6显著上升(P<0.001)，证明模型建立成功。NAC组与模型组相比，NAC使IL‑6含量极显著的从121.52±5.30(pg/mL)下降至87.25±5.30(pg/mL)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量使IL‑6显著下降至109.01±3.96(pg/mL)(P<0.01)。中剂量和高剂量使IL‑6含量分别极显著下降至96.60±
0.57(pg/mL)、92.27±1.02(pg/mL)(P<0.001)。结果表明随着单环刺螠改造多肽浓度的增加，HepG2细胞内IL‑6含量逐渐下降，即HepG2细胞中白介素6含量与单环刺螠改造多肽F2‑1存在浓度依赖性。
[0112] 综上所述：F2‑1处理后，HepG2细胞中TNF‑α、IL‑6的表达显著降低，表明F2‑1可能通过下调促炎细胞因子来抑制炎症。
[0113] 实施例1用无水乙醇(500mM)作用于健康状况良好的HepG2细胞24h，建立酒精性肝损伤细胞模型。从无水乙醇诱导的HepG2脂质代谢及抗炎等方面探讨单环刺螠改造多肽F2‑1对酒精性肝损伤的体外保护作用及机制。
[0114] 本发明选用F2‑1的浓度为200μM、300μM、400μM进行后续实验。观察F2‑1对无水乙醇诱导损伤的HepG2细胞的保护作用。结果表明，F2‑1对无水乙醇建立的HepG2细胞酒精性损伤模型显示良好的保护作用。在脂质代谢层面，不同浓度的F2‑1均可以降低体内ALT、AST、TC、TG、LDL‑C的含量，同时提高HDL‑C的含量。其中ALT和AST是评价肝脏是否健康的重要指标，F2‑1对其均有一定程度的改善，说明F2‑1可以调节肝脏脂肪代谢，减少脂肪堆积，对肝脏具有一定程度的保护作用。
[0115] 综上所述，以F2‑1为代表的单环刺螠改造多肽对无水乙醇造成的酒精性肝损伤的HepG2细胞具有一定的保护作用，作用机制可能与提高脂质代谢及降低炎症反应有关，为后续的体内酒精性肝损伤实验奠定了基础。
[0116] 实施例2单环刺螠改造多肽对小鼠酒精性肝损伤的保护作用
[0117] 2.1实验材料与仪器
[0118] 表2‑1实验试剂
[0119]
[0120]
[0121] 2.1.1实验材料
[0122] 单环刺螠(Urechisuninctus)改造多肽委托上海楚肽生物科技有限公司进行合成，纯度≥95％
[0123] 2.1.2实验动物
[0124] 实验动物：SPF级48只雄性C57BL/6小鼠，每只体重在18g至22g之间，购自杭州子源实验动物科技有限公司。生产许可证号：SCXK(浙)2019‑0004。所有动物实验程序均符合实验动物伦理委员的指导方针，使用许可证号为SYXK(浙)2019‑0031。
[0125] 2.1.3主要仪器
[0126] 表2‑2实验仪器
[0127]
[0128]
[0129] 2.2实验方法
[0130] 2.2.1NIAAA小鼠模型的建立及给药方法
[0131] 从杭州子源实验动物科技有限公司购入雄性C57BL/6小鼠48只，体重为20±2g，随机分组，每组8只，4只一笼，共12笼。让小鼠在动物房适应七天，期间室温25±2℃，相对湿度50±5％，12h/12h光照黑暗周期。实验分组为为空白组、模型组、阳性对照组、单环刺螠改造多肽低、中、高剂量组。实验建模分为四个阶段，第一阶段为给药阶段，模型组灌胃等体积的蒸馏水，其余各组按照给药浓度进行给药，此阶段持续10天。第二阶段为过渡阶段，让小鼠的饲料从固体饲料转为液体饲料，此阶段持续5天。第三阶段为造模阶段，正常组继续使用Lieber‑Decarli液体饲料(不含酒精)，保持小鼠每天的热量摄入与模型组一致，其余各组均给予5％(v/v)酒精液体饲料造模10天。第四阶段为一次灌胃阶段，在建模第11天早上8点给予31.5％(v/v)酒精灌胃一次(0.02mL/g)，9h后处死小鼠，此时AST、ALT浓度最高。给药浓度：阳性对照组为200mg/kg的水飞蓟宾，低、中、高剂量组分别为50、100、150mg/kg的单环刺螠(Urechisuninctus)改造多肽F2‑1，给药持续全过程。
[0132] 2.2.2标本的采集与处理
[0133] 肝脏组织制成10％组织匀浆。
[0134] 2.2.3观察组织病理变化
[0135] H&E染色肝脏组织切片标本、H&E染色肾脏组织切片标本组织切片，观察组织病理变化，结果显示在图13和图14。图13，A：空白组；B：模型组；C：阳性对照组；D：低剂量组；E：中剂量组；F：高剂量组。图14，A：空白组；B：模型组；C：阳性对照组；D：低剂量组；E：中剂量组；F：高剂量组。
[0136] 2.2.4小鼠血清指标的测定
[0137] 同1.2.3.2。
[0138] 单环刺螠改造多肽F2‑1对ALT含量的影响显示在图15，Vs control：***P<0.001，**P* ### ## #<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0139] 单环刺螠改造多肽F2‑1对AST含量的影响显示在图16，Vs control：***P<0.001，**P* ### ## #<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0140] 为单环刺螠改造多肽F2‑1对TC含量的影响显示在图17，Vs control：***P<0.001，*** ### ## #P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0141] 单环刺螠改造多肽F2‑1对TG含量的影响显示在图18，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0142] 单环刺螠改造多肽F2‑1对HDL‑C含量的影响显示在图19，Vs control：***P<** * ### ## #0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0143] 单环刺螠改造多肽F2‑1对LDL‑C含量的影响显示在图20，Vs control：***P<0.001，[0144] **P<0.01，*P<0.05；Vs model：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。
[0145] 2.2.6小鼠ELISA指标的测定
[0146] 同1.2.3.3。
[0147] 单环刺螠改造多肽F2‑1对CYP2E1活性的影响显示在图21，Vs control：***P<** * ### ## #0.001，P<0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0148] 单环刺螠改造多肽对TNF‑α含量的影响显示在图22，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0149] 单环刺螠改造多肽对IL‑6含量的影响显示在图23，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05；
[0150] 单环刺螠改造多肽对iNOS含量的影响显示在图24，Vs control：***P<0.001，**P<* ### ## #0.01，P<0.05；Vs model： P<0.001，P<0.01，P<0.05。
[0151] 2.3数据统计
[0152] 所有数据以(x±SD)表示，采用spss软件统计分析，用独立样本的单因素方差统计分析进行差异显著性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
[0153] 2.4实验结果
[0154] 2.4.1染色结果
[0155] 2.4.1.1小鼠肝脏H&E染色
[0156] 参阅图13，小鼠肝脏组织H&E染色切片结果如图，所示，图A为正常组，其中肝细胞排列整齐且细胞核完整，肝索围绕中央静脉呈现放射状；图B为模型组，肝细胞体积显著增大，肝索结构紊乱，出现明显的炎症细胞浸润现象，且从显微镜下观察出现了大量的脂质空泡，以上现象表明模型建立成功；与模型组相比较，低剂量、中剂量、高剂量组肝索排列逐渐变得整齐，炎症浸润情况也逐渐得到了改善。尤其是高剂量组可以看出肝索排列整齐围绕中央静脉呈现放射状，脂质空泡相较于模型组明显减少，基本无没有炎症细胞聚集情况，接近正常肝细胞的状态。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽F2‑1能在不同程度上降低酒精性肝损伤对小鼠的伤害。酒精暴露会很大程度上影响肝细胞的脂质代谢，并在ALD的发展过程中导致肝损伤。
[0157] 2.4.1.2小鼠肾脏H&E染色
[0158] 参阅图14，小鼠肝脏组织H&E染色切片结果如图，所示，图A为正常组，正常组小鼠肾小球大小形态正常，边界清晰。肾小管内部刷状缘结构完整。图B为模型组，与空白组相比，肾小体出现固缩，边界变得不清晰，肾小管结构紊乱，这证明酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比较，低剂量、中剂量、高剂量组都有了明显的改善。尤其是高剂量组可以看出肾小球大小形态正常，边界清晰。肾小管内部刷状缘结构完整，接近正常肾脏细胞的状态。结果表明：各剂量单环刺螠改造多肽F2‑1均能在不同程度上降低酒精性肝损伤对小鼠肾脏的损害，且呈剂量依赖性。
[0159] 2.4.2单环刺螠改造多肽F2‑1对小鼠血清指标的影响
[0160] 2.4.2.1单环刺螠改造多肽F2‑1对小鼠血清中ALT和AST含量的影响
[0161] 参阅图15和图16，表达的是单环刺螠改造多肽对ALT、AST含量的影响。模型组与空白组相比ALT、AST极显著上升(P<0.001)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使ALT、AST含量分别从24.07±2.85(U/L)、47.57±2.63(U/L)下降至7.93±0.90(U/L)、34.32±4.97(U/L)。给药组与模型组相比，低剂量效果一般，只对AST有效(P<0.05)，使之下降至36.35±3.91(U/L)。中剂量可以极显著的降低ALT、AST的含量(P<0.001)，分别下降至16.28±1.08(U/L)、29.19±2.75(U/L)。高剂量效果最好，极显著的降低ALT、AST的含量(P<0.001)，分别下降至8.15±0.99(U/L)、28.97±1.94(U/L)。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽均能降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT及AST的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0162] 2.4.2.2单环刺螠改造多肽F2‑1对小鼠血清中TC和TG含量的影响
[0163] 参阅图17和图18，如图所示，图3‑5表达的是单环刺螠改造多肽对TC、TG含量的影响。过度饮酒会导致肝细胞内TC、TG过度积累，从而干扰肝脏代谢功能。模型组与空白组相比TC和TG极显著上升(P<0.001)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使TC和TG含量极显著下降接近正常水平(P<0.001)。水飞蓟素能使TC、TG含量从9.10±0.12(mmol/L)、1.10±0.10(mmol/L)下降至3.91±0.25(mmol/L)、0.57±0.04(mmol/L)。给药组与模型组相比，低剂量对TC没有明显效果，使TG极显著的下降至0.80±0.01(mmol/L)(P<0.001)。中剂量可以极显著的降低TC和TG的含量(P<
0.001)，使之分别下降至5.25±0.09(mmol/L)、0.61±0.03(mmol/L)。高剂量效果最好，极显著的降低TC和TG的含量(P<0.001)，分别下降至3.69±0.21(mmol/L)、0.51±0.04(mmol/L)。
[0164] 结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽均能降低酒精性肝损伤小鼠血清中TC及TG的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0165] 2.4.2.3单环刺螠改造多肽F2‑1对小鼠血清中HDL‑C和LDL‑C含量的影响
[0166] 参阅图19和图20，表达的是单环刺螠改造多肽对HDL‑C、LDL‑C含量的影响。模型组与空白组相比HDL‑C显著下降(P<0.001)，LDL‑C极显著上升(P<0.001)表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使HDL‑C含量从2.22±0.16(mmol/L)上升至3.13±0.31(mmol/L)，接近至正常水平(P<0.01)，使LDL‑C含量极显著的从1.06±0.04(mmol/L)下降至0.67±0.12(mmol/L)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量对HDL‑C和LDL‑C没有效果，在统计学上没有意义。中剂量可以降低LDL‑C的含量(P<0.05)，使之下降到0.75±0.09(mmol/L)。高剂量效果最好，使HDL‑C上升至3.13±0.30(mmol/L)(P<0.05)，也可以显著的降低LDL‑C的含量(P<0.01)，使之降低至0.65±0.13(mmol/L)。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽均能提高酒精性肝损伤小鼠血清中HDL‑C的含量，也同时能降低血清中LDL‑C的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0167] 综上所述：ALD总是伴随着由过量酒精引起的脂质代谢失衡引起的肝脏脂肪变性。F2‑1可以降低NIAAA小鼠中ALT、AST、TC、TG、LDL‑C的含量，提高HDL‑C的含量说明它能减少肝细胞中的脂质积累和随后的脂肪变性，对肝脏具有保护作用。
[0168] 2.4.3细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)含量测定
[0169] 参阅图21，表达的是单环刺螠改造多肽对CYP2E1活性的影响。模型组与空白组相比CYP2E1活性有一点上升(P<0.05)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素、低剂量、中剂量的保护作用很小，在统计学上无意义。高剂量有显著的保护作用，使CYP2E1活性从10.94±0.11(U/mgprot)下降至9.90±0.60(U/mgprot)(P<0.05)。长期大量饮酒会激活肝脏CYP2E1的表达并引发氧化应激，导致组织炎症和损伤。
[0170] 结果表明：单环刺螠改造多肽F2‑1能提高酒精性肝损伤小鼠组织中CYP2E1的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0171] 2.4.4单环刺螠改造多肽F2‑1对小鼠肝脏组织中炎症因子含量的影响
[0172] 2.4.4.1肿瘤坏死因子(TNF‑α)含量测定
[0173] 参阅图22，表达的是单环刺螠改造多肽对TNF‑α含量的影响。模型组与空白组相比TNF‑α含量极显著上升(P<0.001)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使TNF‑α极显著的从483.77±5.13(pg/mL)下降至420±14.09(pg/mL)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量对酒精引起的酒精性肝损伤保护作用很小，在统计学上无意义。中剂量和高剂量可以显著的降低TNF‑α的含量(P<0.01)分别使之下降至446.087±18.44(pg/mL)、439.56±7.74(pg/mL)。
[0174] 结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽均能降低酒精性肝损伤小鼠组织中TNF‑α的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤
[0175] 2.4.4.2白介素6(IL‑6)含量测定
[0176] 参阅图23，表达的是单环刺螠改造多肽对IL‑6含量的影响。模型组与空白组相比IL‑6含量极显著上升(P<0.001)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使IL‑6极显著含量从138.08±0.29(pg/mL)下降至117.88±4.41(pg/mL)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量对酒精引起的酒精性肝损伤保护作用很小，在统计学上无意义。中剂量有一定的效果，可以显著的降低IL‑6的含量(P<0.05)，使之从138.08±0.29(pg/mL)降低至123.70±1.06(pg/mL)，高剂量使IL‑6降低至
118.71±2.90(pg/mL)。
[0177] 结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽F2‑1均能降低酒精性肝损伤小鼠组织中IL‑6的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0178] 2.4.4.3一氧化氮合酶(iNOS)含量测定
[0179] 参阅图24，表达的是单环刺螠改造多肽对iNOS含量的影响。模型组与空白组相比iNOS含量极显著上升(P<0.001)，表明NIAAA模型建立成功，大量的酒精导致了小鼠肝脏的损伤。与模型组相比，水飞蓟素能使iNOS含量极显著的从8.10±0.93(pg/mL)下降至4.68±0.44(pg/mL)(P<0.001)。给药组与模型组相比，低剂量对酒精引起的酒精性肝损伤保护作用很小，在统计学上无意义。中剂量有一定的效果，可以显著的降低iNOS的含量(P<0.01)，使之降低至6.12±0.05(pg/mL)，高剂量使iNOS降低至4.88±0.23(pg/mL)。结果表明：不同剂量的单环刺螠改造多肽均能降低酒精性肝损伤小鼠组织中iNOS的含量，且有剂量依赖性，并在一定程度上缓解酒精造成的肝脏损伤。
[0180] 综上所述：F2‑1处理后，NIAAA小鼠肝细胞中TNF‑α、IL‑6、iNOS的表达显著降低，表明F2‑1可能通过下调促炎细胞因子来抑制炎症。
[0181] 实施例2选用雄性ICR小鼠(20±2g)，适应性生长一周后，每天灌胃不同剂量单环刺螠改造多肽F2‑1，此过程持续10天。给予适应性生长饲料，此过程持续5天且继续给药。用含无水乙醇的液体饲料，10天建立酒精性肝损伤模型。从单环刺螠改造多肽F2‑1对无水乙醇诱导的酒精性肝损伤小鼠的调脂以及抗炎三个方面探讨单环刺螠改造多肽F2‑1对酒精性肝损伤小鼠的保护作用及机制。选取F2‑1的给药浓度为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg观察F2‑1对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。
[0182] 在建立小鼠酒精性肝损伤模型，结果显示：与正常组小鼠相比较，模型组小鼠H&E染色发现模型组小鼠肝脏细胞出现肝细胞脂质空泡变多、肝索排列紊乱、炎症因子浸润等情况，证明酒精性性肝损伤模型建立成功，给药组显示具有一定的改善效果。说明F2‑1可以增加脂质代谢，减少脂质积累。
[0183] 在脂质代谢研究层面不同浓度的F2‑1均可以降低体内ALT、AST、TC、TG、LDL‑C的含量，同时提高HDL‑C的含量。其中ALT和AST是评价肝脏是否健康的重要指标，F2‑1对其均有一定程度的改善，说明F2‑1可以调节肝脏脂肪代谢，减少脂肪堆积，对肝脏具有一定程度的保护作用。
[0184] 在抗炎层面不同浓度的F2‑1可以降低体内TNF‑α、IL‑6、iNOS的含量。单环刺螠改造多肽F2‑1可以通过减少炎症标志物(如TNF‑α、IL‑6、iNOS)来抑制炎症的初始过程，从而调节抗炎基因的表达，从而对因酒精引起的肝损伤起到保护作用。
[0185] 综上所述，在无水乙醇造成的酒精性肝损伤小鼠模型中，单环刺螠改造多肽F2‑1能够通过缓解小鼠所受脂质代谢及降低炎症反应等方面来保护小鼠免受无水乙醇损伤。单环刺螠改造多肽F2‑1显著的保护小鼠免受酒精引起的肝损伤，同时显著抑制血清中的促炎细胞因子，如TNF‑α、IL‑6、iNOS。以F2‑1为代表的单环刺螠改造多肽是一种潜在的护肝生物活性肽。
