技术领域
[0001] 本申请属于碳点纳米酶技术领域，更具体地，涉及碳点纳米酶及负载碳点纳米酶的水凝胶及其在检测产品新鲜度中的应用。
相关背景技术
[0002] 水产品在腐败阶段，体内含氮物质分解为碱性胺类物质，使pH值不断上升。pH作为评价水产品新鲜度的重要指标之一，目前通常使用酸度计法、近红外光谱、探针式pH计、比色阵列传感器等测定水产品的pH，这些方法常常需要对实际样品进行粉碎、离心等前处理，步骤繁琐效率低下，处理长，容易导致胺类物质挥发影响结果准确性，难以实现水产品新鲜度的大规模检测和长期监测。智能指示标签作为目前实现可视化监测水产品新鲜度的高效无损检测技术，通常是依赖比色通道或者荧光通道检测pH的变化，对于色盲人群和对颜色不敏感的人群来说存在判断困难。
[0003] 次黄嘌呤(Hx)是水产品腐败初期广泛出现的物质之一，在水产品死亡后逐步积累，是近年来评价水产品新鲜度最热门的指标之一。目前通常使用质谱学技术、近红外光谱、电子鼻、电子舌技术、计算机视觉技术和气相色谱‑质谱仪(GC‑MS)技术等检测Hx，检测结果准确可靠，但检测步骤繁琐且对设备要求较高，难以快速进行大规模检测。基于酶联反应建立比色法或荧光分析法实现Hx的可视化检测是一种灵敏可行的策略，但这种策略需要黄嘌呤氧化酶(XOD)先将Hx氧化分解为H2O2，再利用纳米材料的过氧化物酶(POD)性质将H2O2氧化为活性氧与显色底物作用。其中生物酶价格昂贵且不稳定，且涉及到两种酶催化反应耗时较长，对检测条件要求仍比较苛刻。基于Hx直接反向调节纳米酶活性的检测手段的出现，为Hx的快速精准检测提供了新的策略。研究发现Hx可以显著减弱立方铂纳米材料(PVP‑PTNC)的POD活性，强有力抑制了蓝色产物ox‑TMB的生成，可以在不使用天然酶(XOD)的情况下实现Hx的定量检测，突破了依赖氧化酶二次转化Hx的局限性。
[0004] 水产品具有极高营养价值，是优质蛋白的重要来源，但水产品中含有大量水分和活跃的内源性蛋白酶，死亡后极易腐败，导致pH和Hx发生显著变化，pH和Hx作为评价水产品新鲜度的重要指标，但目前的技术一般是单独检测pH或Hx指标，无法同时检测pH和Hx指标，单个指标检测容易受环境干扰使检测结果不够准确，多指标检测能最大程度保证检测的准确性，因此开发一种高效灵敏、能够同时快速捕捉水产品中pH和Hx双重指标的变化的检测技术，在水产品安全检测领域具有巨大的应用价值。
具体实施方式
[0048] 为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0049] 本申请提供了一种碳点纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
[0050] 将乙二胺四乙酸二钠盐、2,4‑二羟基苯甲酸、铁源、钴源、磷源和去离子混合均匀，加热进行合成反应，反应液经离心、透析、冷冻干燥，得到碳点纳米酶(即Fe,Co,P‑CDs纳米酶)。
[0051] 一些实施例中，上述铁源为六水合氯化铁、硫酸铁和硝酸铁中的一种或多种。一些实施例中，上述钴源为VB12、氯化钴、硫酸钴和硝酸钴中的一种或多种。一些实施例中，上述磷源为磷酸、磷酸二氢钠和焦磷酸钠中的一种或多种。
[0052] 一些实施例中，上述乙二胺四乙酸二钠盐、2,4‑二羟基苯甲酸、铁源、钴源和磷源的质量比为(0.05～0.1)：(0.05～0.1)：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)：(8～11)。
[0053] 一些实施例中，上述反应液中，乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为2mg/mL～4mg/mL。
[0054] 较佳实施例中，上述乙二胺四乙酸二钠盐、2,4‑二羟基苯甲酸、铁源、钴源和磷源的质量比为(0.06～0.08)：(0.06～0.08)：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)：(9～10)。
[0055] 较佳实施例中，上述反应液中，上述乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为2.4mg/mL～3.2mg/mL。
[0056] 一些实施例中，上述合成反应的温度为180℃～220℃，合成反应的时间为1h～5h。需要理解的是，本申请并不限定上述加热的方式，可以为但不限于水热法、微波法。
[0057] 一些实施例中，采用500Da的分子量截留量的透析袋透析除去微小杂质，得到含有绿色荧光碳点的溶液，然后通过冷冻干燥得到碳点纳米酶。
[0058] 本申请还提供了利用上述制备方法制得的碳点纳米酶。
[0059] 本申请制备的碳点纳米酶能够用于检测样品的pH值。本申请制备的碳点纳米酶的荧光强度对pH敏感，上述碳点纳米酶在pH＜6时，在激发波长370nm下发射峰的波长为500nm；在6＜pH＜7时，在激发波长370nm下发射峰的波长为505nm；在pH＝7时，在激发波长
370nm下出现2个发射峰，发射峰的波长分别为425nm、505nm；在pH＞7时，在激发波长370nm下425nm发射波长的发射峰强度增强。本申请制备的碳点纳米酶的荧光颜色对pH敏感，在pH小于7时，上述碳点纳米酶在365nm的紫外灯照射下呈绿色；在pH大于7时，在365nm的紫外灯照射下呈蓝绿色。检测待测样品的pH值的具体步骤如下：
[0060] S1、将上述碳点纳米酶和不同pH的PBS缓冲液混合均匀，测量370nm激发波长下，425nm发射波长的荧光强度与505nm发射波长的荧光强度的比值(I425/I505)；
[0061] S2、以pH值为自变量，荧光强度比I425/I505为因变量，分析获得pH值和荧光强度比I425/I505的关系式；
[0062] S3、对待测样品进行处理，离心获取上清液后与碳点纳米酶充分混合，测量370nm激发波长下荧光强度比I425/I505；
[0063] S4、将待测样品上清液的荧光强度比I425/I505代入上述关系式，获得待测样品上清液pH值。
[0064] 本申请制备的上述碳点纳米酶能够用于检测样品的次黄嘌呤浓度。本申请制备的碳点纳米酶具有过氧化物模拟酶活性，能够使得底物3,3’5,5’‑四甲基联苯胺(TMB)被H2O2氧化为oxTMB，进而使溶液颜色发生鲜明变化，能够用于检测样品的次黄嘌呤的浓度。检测样品的次黄嘌呤浓度的具体步骤如下：
[0065] S1、将上述碳点纳米酶的水溶液和不同浓度的次黄嘌呤标准溶液置于37℃水浴处理，其中次黄嘌呤标准溶液的浓度大于等于0，然后加入TMB溶液、H2O2溶液和PBS，混合均匀，调整混合物体系pH为4，置于37℃水浴处理，测量652nm处，次黄嘌呤标准溶液的浓度为0时的混合液的吸光度(A0)，不同浓度的次黄嘌呤标准溶液的混合液的吸光度(A)，计算吸光度差值A0‑A；
[0066] S2、以次黄嘌呤浓度为自变量，吸光度差值A0‑A为因变量，分析获得次黄嘌呤浓度和吸光度差值A0‑A的关系式；
[0067] S3、对待测样品进行处理，离心获取上清液后与上述碳点纳米酶的水溶液置于37℃水浴处理，然后加入TMB溶液、H2O2溶液和PBS，混合均匀，调整混合物体系pH为4，置于37℃水浴处理，测量652nm处混合液的吸光度An，计算吸光度差值A0‑An；
[0068] S4、将待测样品上清液的吸光度差值A0‑An代入上述关系式，获得待测样品上清液次黄嘌呤浓度。
[0069] 一些实施例中，上述样品或待测样品可以是但不限于生物样品、环境样品。进一步地，上述生物样品、环境样品可以是食物样品(新鲜水果或蔬菜、肉类、水产品)、土壤样品、淡水样品、废水样品，或它们的组合。
[0070] 可以理解的是，本申请并不限定上述分析的方法，可以为但不限于线性分析、回归分析。
[0071] 本申请还提供了一种负载上述碳点纳米酶的水凝胶。
[0072] 一些实施例中，上述水凝胶的制备方法包括如下步骤：
[0073] 将上述碳点纳米酶的水溶液和显色底物溶液、H2O2溶液、PBS缓冲溶液、海藻酸钠、明胶、壳聚糖混合均匀，得到蓝色聚合物溶液；然后将上述蓝色聚合物溶液和CaCl2溶液混匀，静置交联，得到水凝胶。
[0074] 一些实施例中，上述蓝色聚合物溶液中，上述海藻酸钠的质量百分数为0.8wt％～1.5wt％；和/或，上述明胶的质量百分数为0.45wt％～1wt％；和/或，上述壳聚糖的质量百分数为0.2wt％～0.42wt％。本申请通过协同调整蓝色聚合物溶液中海藻酸钠、明胶、壳聚糖的质量百分数，从而调控水凝胶对pH的响应性，使得水凝胶在pH小于8时保持形态稳定，在pH为8时，能够由固态转变为溶胶态，能够在食品，尤其是水产品发生变质时快速捕捉pH的变化。
[0075] 一些实施例中，上述碳点纳米酶的水溶液中碳点纳米酶的浓度为10mg/mL～20mg/mL。
[0076] 一些实施例中，上述显色底物溶液为3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺的有机溶液。一些实施例中，上述显色底物溶液中显色底物的浓度为5mM～20mM。
[0077] 一些实施例中，上述H2O2溶液中H2O2的质量百分数为0.3wt％～3wt％。
[0078] 一些实施例中，上述碳点纳米酶的水溶液、上述显色底物溶液和上述H2O2溶液的体积比为(0.5～1.5)：(4～6)：(0.5～1.5)，优选为(0.8～1.2)：(4.5～5.5)：(0.8～1.2)，更优选为1:5:1。
[0079] 本申请通过调整上述碳点纳米酶的水溶液中碳点纳米酶的浓度、显色底物溶液中显色底物的浓度、H2O2溶液中H2O2的质量百分数及三者的体积比，从而调控制得的水凝胶检测Hx的灵敏度。可以理解的是，本领域技术人员根据待检测产品的新鲜度评判标准适应性调整上述参数，均在本申请的保护范围内。
[0080] 一些实施例中，上述PBS缓冲溶液的pH为3～5。
[0081] 本申请并不限定上述水凝胶的应用形式，包括但不限于水凝胶薄膜、水凝胶球中的至少一种。
[0082] 一些实施例中，上述水凝胶薄膜的制备方法包括如下步骤：将上述蓝色聚合物溶液置于器皿中流延平整后，加入CaCl2溶液完全浸没上述蓝色聚合物溶液，静置交联、裁剪，得到水凝胶薄膜，即CDs‑CSG水凝胶薄膜。
[0083] 一些实施例中，上述水凝胶球的制备方法包括如下步骤：将上述蓝色聚合物溶液滴入到CaCl2溶液中，静置交联，得到水凝胶球，即CDs‑CSG水凝胶球。
[0084] 本申请并不限定上述水凝胶球的大小、水凝胶薄膜的厚度等，本领域技术人员可以根据实际应用场景的需求选择合适的大小、厚度。
[0085] 本申请提供的水凝胶薄膜能够裸眼可视化检测样品的pH。在本申请具体实施例中，发明人通过实验发现，将上述厚度为0.5mm～1mm的水凝胶薄膜用于检测pH值，当pH＝8.0时能够快速破碎溶解，由固态凝胶转变为溶胶态，快速捕抓pH的变化。
[0086] 本申请提供的负载碳点纳米酶的水凝胶能够用于检测样品中Hx的浓度。利用上述水凝胶球检测样品中Hx的浓度具体步骤如下：
[0087] S1、将上述CDs‑CSG水凝胶球、不同浓度的Hx标准溶液和PBS缓冲液混合，调整混合体系pH为4.0，37℃孵育后，取出CDs‑CSG水凝胶球，用智能手机拍照读取CDs‑CSG水凝胶球在不同浓度的Hx标准溶液中孵育前后的色差值ΔR/B值，并转换为RGB颜色模式的数字值，作为判断标准；
[0088] S2、对待测样品进行处理，离心获取上清液后重复步骤S1，用智能手机拍照获得CDs‑CSG凝胶球在待测样品上清液中孵育前后的色差值ΔR/B值，转换为RGB颜色模式的数字值，与上述判断标准进行比较，即可确定待测样品中Hx的浓度。
[0089] 本申请还提供了上述水凝胶在可视化快速检测pH和/或次黄嘌呤以判别产品新鲜度中的应用。需要理解的是，上述产品包括但不限于水产品。本申请具体实施例中，制备的水凝胶薄膜能够快速捕抓pH和Hx的变化，在pH＝8.0时快速破碎溶化，在Hx≥118mg/kg(虾肉亚鲜度评判标准)时薄膜的蓝色快速完全褪去。
[0090] 在实际应用时，本申请提供的水凝胶薄膜能够在水产品腐败变质时出现破碎溶化和完全褪色两种肉眼可见的明显变化，通过形态和颜色变化准确评价水产品新鲜度，快速实现水产品新鲜度的裸眼可视化在线监测。
[0091] 可以理解的是，当待检测产品的新鲜度评判标准高于或低于虾肉的新鲜度评判标准，本领域技术人员适应性调整水凝胶中碳点纳米酶、显色底物、H2O2的含量，从而使得制备的水凝胶球、水凝胶薄膜能够准确响应待检测产品的新鲜度，均在本申请的保护范围内。
[0092] 本申请提供的水凝胶能够针对水产品，尤其是虾类的新鲜度进行检测，通过水凝胶薄膜的形态变化能够在水产品腐败变质时快速响应pH，为新鲜度的视觉感官判断提供强有力的支撑，突破了智能标签指示食品新鲜度只能依赖于颜色和荧光变化的局限性，为大众快速判断食品新鲜度提供了前所未有的新角度。同时，还能够依据水凝胶薄膜或水凝胶球的蓝色褪去的情况快速准确响应Hx的变化，因此，本申请提供的水凝胶基于pH和Hx的双重响应实现可视化检测水产品的新鲜度，为水产品新鲜度的检测提供了新器件，在食品安全检测领域具有巨大潜力。
[0093] 以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本申请，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0094] 以下为实施例：
[0095] 实施例1
[0096] 1.绿色发光的铁钴磷共掺杂的碳点纳米酶(Fe,Co,P‑CDs)的制备：
[0097] 将0.0731g乙二胺四乙酸二钠盐、0.0771g 2,4‑二羟基苯甲酸、0.03g VB12和0.04g FeCl3·6H2O溶于20mL 5M磷酸溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，200℃反应3h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析4h，冷冻干燥得到固体样品。
[0098] 2.检测Fe,Co,P‑CDs纳米酶
[0099] 2.1对上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶进行荧光和紫外光谱扫描：
[0100] 将上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶在去离子水分散溶解得到Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液，然后分别置于荧光分光光度计(FL 8500，PerkinElmer Company)检测池中测定发射波长(Wavelength)及荧光强度(PL intensity)，以及紫外‑可见光分光光度计(Lambda‑35，PerkinElmer Company)检测池中对不同波长(Wavenumber)下的吸光度(Absorbance)进行检测。
[0101] 如图1所示，Fe,Co,P‑CDs纳米酶在273nm、435nm处表现出两个主要的吸收峰，分别归属于芳香族C＝C的π→π*跃迁和C＝O的n→π*跃迁。另外，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的荧光光谱在激发波长430nm下发射波长达到505nm左右。图1左上角插图显示，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的水溶液在阳光下呈黄色(插图左侧)，在365nm紫外光照射下呈明亮绿色荧光(插图右侧)。
[0102] 以罗丹明6G为参考(在乙醇中的QYs＝95％)，通过比较Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液(在430nm波长处激发)的综合荧光强度和吸光度值，获得Fe,Co,P‑CDs纳米酶的QYs。相对QYs的计算公式如下，
[0103] φx＝φST(Gradx/GradST)(ηx2/ηST2)×100％
[0104] 式中，Φ为QYs，Grad为综合荧光强度与吸光度的梯度，η为折射率(水为1.33，乙醇为1.36)，ST代表标准，x代表样品。将重吸收效应降至最低，激发波长处的吸收率保持在0.1以下，经测试，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的量子产率高达48.76％。
[0105] 2.2对上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶进行红外光谱扫描：
[0106] 采用傅里叶变换红外光谱FT‑IR检测上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶样品在不同波长(Wavenumber)下的透过率(Transmittance)，探究Fe,Co,P‑CDs纳米酶的表面基团。
[0107] 如图2所示，在3447cm‑1和3129cm‑1处观察到的CDs吸收带是由于羟基(O‑H)基团的‑1 ‑1拉伸振动以及氨基(N‑H)基团的拉伸振动产生的。在2936cm 和2454cm 处出现的峰是由于‑1 ‑1
Fe,Co,P‑CDs上存在的C‑H和C‑C键的伸缩振动产生的。1644cm 和1357cm 拉伸频率源自C‑
＝O/C＝N和C‑N/COO，证实了EDTA的羧基与2,4‑DHBA的羟基发生了脱水、缩合反应。其他主‑1 ‑1 ‑1
要峰为1715cm 处的C＝O振动，1140cm 处的C‑O‑C的拉伸振动。617cm 处的C‑H平面外弯曲‑1 ‑1 ‑1 ‑1
振动的特征峰，1072cm 、955cm 和862cm 处的P‑O/P＝O振动，527cm 处的强烈的吸收峰显示了Fe‑O的存在。
[0108] 2.3观察上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶的形貌和尺寸分布：
[0109] 将纯化的样品用去离子水分散溶解，取10μL滴在300目的铜网上，使用透射电镜(JEM‑2100，JEOL Ltd.，Japan)进行观察。
[0110] 如图3所示，可以看出，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的尺寸均匀，分散性良好，平均粒径约为2.43nm，由左插图(HRTEM图像)可以看出，Fe,Co,P‑CDs纳米酶具有明显且清晰的晶格条纹，晶格间距为0.12nm。
[0111] 2.4检测上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶、氧化酶模拟活性
[0112] 以TMB为显色底物，初步评估Fe,Co,P‑CDs的过氧化物酶活性和氧化酶活性。将50μL浓度为2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液，100μL浓度为5mM的TMB溶液和50μL H2O2溶液(H2O2质量百分含量为0.3％)混合，加入820μL pH为4的PBS缓冲溶液(浓度为20mM)，然后将混合溶液置于37℃水热20min，记录其在652nm的吸光度，以测定Fe,Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶模拟活性。
[0113] 按照上述步骤测试Fe,Co,P‑CDs纳米酶的氧化酶模拟活性，其中测试体系中不添加除H2O2溶液，将混合溶液置于37℃水热20min，记录其在652nm的吸光度，以测定Fe,Co,P‑CDs纳米酶的氧化酶模拟活性。
[0114] 如图4所示，当H2O2的存在下，Fe,Co,P‑CDs能够催化氧化TMB变蓝(右插图中1号离心管)，在652nm处有典型的特征吸收峰(1号红色线条)，说明Fe,Co,P‑CDs具有过氧化物模拟酶活性。在H2O2不存在的情况下，Fe,Co,P‑CDs纳米酶需要在37℃下反应20min才能够催化氧化TMB，使显色底物变为淡蓝色(右插图中4号离心管)，在652nm处有较低的吸收峰(4号紫色线条)，说明Fe,Co,P‑CDs具有较弱的氧化酶活性。
[0115] 2.5上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶模拟活性与pH值的关系：
[0116] 将50μL浓度为2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液，100μL浓度为5mM的TMB溶液和50μL H2O2溶液(H2O2质量百分含量为0.3％)混合，加入820μL pH分别为2、3、4、5、6、7的PBS缓冲溶液(浓度为20mM)，然后置于37℃水热20min，记录其在652nm的紫外吸收。
[0117] 图5中(插图为pH为2～7依次对应的溶液的颜色)，在不同pH值的PBS缓冲液中，Fe,Co,P‑CDs纳米酶在652nm波长处的紫外线吸收强度变化很大，其中Fe,Co,P‑CDs纳米酶催化反应的最佳pH值为4.0，当pH值大于或小于4均影响Fe,Co,P‑CDs的催化活性，结果说明，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶模拟活性受pH值影响。
[0118] 2.6检测上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶在不同浓度的TMB和H2O2下的稳态动力学以及相应Lineweaver‑Burk：
[0119] 通过稳态动力学测定Fe,Co,P‑CDs纳米酶的Vmax和Km，如图6内容(a)、图6内容(b)‑5 ‑1所示，TMB的Vmax和Km分别为8.83×10 mM s 和1.28mM；如图7内容(a)、图7内容(b)所示，‑5 ‑1
H2O2的Vmax和Km分别为4.61×10 mM s 和0.13mM。
[0120] 2.7上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶检测次黄嘌呤(Hx)的效果：
[0121] 将20μL不同浓度的次黄嘌呤(Hx)标准溶液与50μL浓度为2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液置于37℃水浴30min，随后加入100μL浓度为5mM的TMB溶液，50μL H2O2溶液(H2O2质量百分含量为0.3％)和800μLPBS缓冲溶液(pH＝4)，置于37℃水浴20min，将混合物在652nm波长处的紫外可见吸收值记录为A652。
[0122] 图8内容(a)所示，随着Hx浓度的增加，652nm处的吸光度逐渐减弱，且溶液颜色逐渐变浅(插图为相应的溶液颜色)，分析原因可能是Hx在Fe,Co,P‑CDs上的物理吸附作用使得Fe,Co,P‑CDs上具有催化活性位点的表面被Hx包覆，因此，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的催化活性随着其活性位点的减少而降低。图8内容(b)为加入Hx前后的吸光度差值随Hx浓度变化的曲线，可以看出，当Hx浓度为0.3μM～400.0μM时，吸光度差值(A0‑A)与Hx浓度之间存在线性2
关系，方程为y＝0.0014x+0.0041，相关系数(R)为0.9961，其中x为Hx浓度，y为加入Hx前后
652nm波长处的吸光度差值(A0‑A)，Hx的检测下限(LOD)为0.3μM。
[0123] 2.8评估基于Fe,Co,P‑CDs纳米酶的传感平台检测Hx方法的特异性：
[0124] 在检测反应中选择非目标分析物(包括乳糖(Lactose)、葡萄糖(Glc)和常见离子2+ 2+ 3+ + + 2+ 2+ 2+ 2+ +
如Mg 、Ca 、Fe 、Na、K、Co 、Mn 、Zn 、Cr 、Ag)研究Fe,Co,P‑CDs纳米酶传感平台对Hx的选择性，检测方法同2.7。
[0125] 图9中，与非目标分析物相比，Fe,Co,P‑CDs纳米酶比色传感平台对Hx的吸光度值差值最大，该检测平台对Hx具有优异的选择响应性。
[0126] 2.9基于Fe,Co,P‑CDs纳米酶传感平台检测虾实际样品的Hx：
[0127] 将活虾随机分组，分别在室温下放置3h、6h，每个处理组有三个重复。使用研钵和研杵将放置不同时间的虾碾碎至纯净，取2g虾样品与10mL蒸馏水混合，涡旋混匀3min、超声15min、5000rpm离心5min。取上清液并加入TCA(质量分数为10％)充分搅拌，离心除去沉淀的蛋白质，并用0.45μm聚醚砜滤膜过滤，得到虾提取物。取20μL放置3h、6h的虾提取物，向各提取物中分别添加终浓度为10μM、20μM和40μM的Hx标准溶液。将虾提取物、添加不同终浓度的Hx标准溶液的虾提取物分别置于37℃水浴30min，然后加入50μL浓度为2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液、100μL浓度为5mM的TMB溶液、50μL H2O2溶液(H2O2的质量百分含量为
0.3％)和780μL PBS缓冲溶液(pH＝4)，置于37℃水浴20min，记录混合物在652nm处的吸光度信号，代入2.7中的方程，得到Hx原始量、Hx测得量，回收率＝((Hx测得量‑Hx原始量)/Hx加入量)×100％。采用标准添加法评估基于Fe,Co,P‑CDs纳米酶的生物传感平台的有效性结果见表1。
[0128] 表1虾提取物中Hx和添加Hx的分析结果
[0129]
[0130] 表1中，Hx的回收率为95.30％～107.15％，相对标准偏差(RSD)为2.88％～5.94％，说明该生物传感平台具有良好的回收率和重现性。
[0131] 2.10上述Fe,Co,P‑CDs纳米酶检测pH值的效果：
[0132] 分别取900μL不同pH值的PBS(浓度为20mM)缓冲溶液，加入100μL浓度为2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶水溶液，混合均匀。使用荧光计记录上述混合溶液在370nm激发下的发射波长，并记录425nm处的发射波长下的荧光强度与505nm处的发射波长下的荧光强度之比(I425/I505)，考察Fe,Co,P‑CDs纳米酶的荧光特性对pH的敏感性。
[0133] 如图10所示，当pH值从2.0升至13.0时，Fe,Co,P‑CDs的荧光颜色和荧光强度发生变化。当pH值小于6时，在500nm处出现一个发射峰，此时，在365nm紫外线照射下，Fe,Co,P‑CDs纳米酶荧光颜色为绿色(左上插图)。当pH值大于6时，发射峰从500nm红移到505nm，强度增强。当pH为7时，在425nm波长处出现新的荧光发射峰，荧光颜色从绿色变为蓝吕色。进一步提高pH值时，425nm波长处的荧光发射峰强度增强。
[0134] 由图11内容(a)所示，Fe,Co,P‑CDs纳米酶在425nm、505nm处的荧光强度比(I425/I505)和pH值的关系，可以表示为两个连续的线性关系，当pH为6～7时，y＝0.4319x‑2.50392 2
(相关系数R＝0.9970)；当pH为7～9时，y＝0.7154x‑4.499(相关系数R＝0.9959)，其中x为pH值，y为荧光强度比I425/I505。可以看出，随着pH值增大，425nm波长处的荧光发射峰强度增强，荧光强度比I425/I505增大。
[0135] 将活虾随机分组，分别在25℃、37℃下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的虾，然后将虾碾碎，取1g虾肉加入到10mL预冷蒸馏水中，涡旋混匀1min、超声20min、4000rpm离心5min。取900μL上清液，加入100μL浓度2mg/mL的Fe,Co,P‑CDs纳米酶溶液。使用荧光计记录混合物在370nm激发下的发射波长，并记录425nm处的发射波长下的荧光强度与505nm处的发射波长下的荧光强度之比(I425/I505)，然后代入上述线性关系中，计算各样品上清液的pH值。
[0136] 动物产品中蛋白质的微生物腐败引起的变质会导致pH值发生变化，如图11内容(b)所示，随着储存时间的延长，样品的pH值升高，荧光颜色也从蓝绿色变为蓝色，虾肉发生明显变质。与25℃下储存的样品相比，37℃下储存的样品pH值变化更为明显。这些结果进一步表明，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的荧光特性指标可以灵敏准确地指示虾肉的pH变化。
[0137] 对比例1
[0138] 将0.0731g乙二胺四乙酸二钠盐、0.0771g 2,4‑二羟基苯甲酸溶于20mL5M磷酸溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，200℃反应3h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析4h，冷冻干燥得到P‑CDs固体样品。
[0139] 对比例2
[0140] 将0.0731g乙二胺四乙酸二钠盐、0.0771g 2,4‑二羟基苯甲酸和0.04gFeCl3·6H2O溶于20mL 5M磷酸溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，200℃反应3h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析4h，冷冻干燥得到Fe,P‑CDs固体样品。
[0141] 对比例3
[0142] 将0.0731g乙二胺四乙酸二钠盐、0.0771g 2,4‑二羟基苯甲酸和0.03gVB12溶于20mL 5M磷酸溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，200℃反应3h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析4h，冷冻干燥得到Co,P‑CDs固体样品。
[0143] 按照实施例1提供的方法，检测P‑CDs纳米酶、Fe,P‑CDs纳米酶、Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶模拟活性，结果如图12，可以看出，P‑CDs纳米酶不具有过氧化物酶模拟活性，Fe,Co,P‑CDs纳米酶的过氧化物酶模拟活性明显高于Fe,P‑CDs纳米酶、Co,P‑CDs纳米酶，可能是Fe,Co,P‑CDs纳米酶的组分间存在协同作用。
[0144] 实施例2
[0145] 将0.05g乙二胺四乙酸二钠盐、0.05g 2,4‑二羟基苯甲酸、0.02g硝酸钴和0.01g FeCl3·6H2O溶于13.5mL 5M磷酸二氢钠溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，220℃反应1h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析2h，冷冻干燥得到固体样品1。
[0146] 将0.06g乙二胺四乙酸二钠盐、0.07g 2,4‑二羟基苯甲酸、0.01g氯化钴和0.03g硝酸铁溶于20mL 5M磷酸溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，180℃反应5h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析4h，冷冻干燥得到固体样品2。
[0147] 将0.1g乙二胺四乙酸二钠盐、0.1g 2,4‑二羟基苯甲酸、0.05g硫酸钴和0.05g硫酸铁溶于20mL 2M焦磷酸钠溶液。将混合溶液转移至25mL聚四氟乙烯内衬反应釜并加入纯净水至满反应釜，200℃反应4h。反应完成后，离心去除不溶物，用500Da的透析袋透析5h，冷冻干燥得到固体样品3。
[0148] 按照实施例1的方法对上述样品进行检测，结果表明，上述样品的水溶液在阳光下均呈黄色，在365nm紫外光照射下均呈明亮绿色荧光。在pH为2.0～13.0的PBS缓冲溶液中，含有上述样品的混合溶液的荧光颜色发生变化，当pH大于7时，混合溶液的荧光颜色从绿色变为蓝绿色，同时在原荧光发射峰的基础上出现新的荧光发射峰，且该发射峰的强度随pH值增大而增强，说明上述样品的荧光特性均对pH的敏感。此外，过氧化物酶模拟活性检测结果表明，上述样品均具有过氧化物模拟酶活性，其过氧化物模拟酶活性与实施例1制备的碳点纳米酶相当。
[0149] 实施例3
[0150] 负载碳点纳米酶的水凝胶的制备：将TMB溶解在甲基亚砜中制备TMB溶液(浓度为20mM)，备用。将海藻酸钠(占整个蓝色聚合物溶液的质量百分数为1.5wt％)完全溶于pH为
4.0的PBS中，加入明胶(占整个蓝色聚合物溶液的质量百分数为0.45wt％)于45℃搅拌至完全溶解，然后加入壳聚糖(占整个蓝色聚合物溶液的质量百分数为0.42wt％)完全搅拌均匀，按照比例在每克蓝色聚合物溶液中加入15μL碳点纳米酶的水溶液(浓度为20mg/mL)、75μL TMB溶液(浓度为20mM)、15μL H2O2溶液(H2O2质量百分数为3wt％)，37℃水浴搅拌60min，得到蓝色聚合物溶液。将上述蓝色聚合物溶液与CaCl2溶液(浓度为0.1mol/L)混匀，静置交联15min，得到CDs‑SCG水凝胶。
[0151] 水凝胶球的制备：用注射器取上述蓝色聚合物溶液，通过挤压法滴入到CaCl2溶液(浓度为0.1mol/L)中，静置交联15min，得到直径为0.5cm的CDs‑SCG水凝胶球。
[0152] 水凝胶薄膜的制备：采用流延法将上述蓝色聚合物溶液在培养皿中流延平整后，沿着培养皿边缘加入CaCl2溶液至完全浸没聚合物溶液，静置交联15min，取出用模具裁剪成圆形的厚度为0.5mm、直径为4.5cm的CDs‑SCG水凝胶薄膜。
[0153] 实验发现，当蓝色聚合物溶液中，海藻酸钠的质量百分数小于0.8wt％时，制得水凝胶薄膜的机械性能极差，形态不稳定；海藻酸钠的质量百分数大于1.5wt％时，制得的水凝胶薄膜在pH为7.5的碱性缓冲溶液中即发生快速完全溶解，不适用于水产品新鲜度的检测。当蓝色聚合物溶液中，壳聚糖的质量百分数小于0.2wt％时，制得的水凝胶薄膜在pH≥8.0碱性缓冲溶液中放置24h以上才能够完全溶胀破碎，无法在水产品腐败变质时快速响应pH。当蓝色聚合物溶液中，明胶的质量百分数小于0.45wt％时，制得水凝胶薄膜的柔韧性和可塑性较差，机械性能较差；明胶的质量百分数大于1wt％时，制得水凝胶薄膜在pH为8.0的碱性缓冲溶液中完全破碎溶解所需时间较长，无法在水产品腐败变质时快速响应pH。
[0154] 上述CDs‑SCG水凝胶薄膜受pH值的影响：
[0155] 水产品如虾类的pH一般为7.1～7.4，虾类死后初期因体内糖原降解生成酸类物导致pH呈下降趋势，而后因为蛋白质等含氮物质分解为胺类物质，导致pH逐渐上升，研究普遍认为pH＝7.8是区分虾类是否可食用的临界值。若将CDs‑CSG水凝胶薄膜用于水产品新鲜度的在线监测，需要CDs‑CSG水凝胶薄膜在水产品新鲜时的pH环境下保持稳定，同时在水产品腐败变质时快速响应pH，另外考虑到CDs的载入可能会影响凝胶的pH响应性，因此需要考察CDs‑CSG水凝胶薄膜在pH为6.5～8.0时其重量和形态随时间的变化。
[0156] 如图13内容(a)所示，CDs‑CSG水凝胶薄膜在溶液中先吸水溶胀使重量略有增加，但随着pH的上升，静电排斥力不断增大，该薄膜不断溶解，重量呈现下降趋势CDs‑CSG水凝胶薄膜不断溶解，重量呈现下降区域，如图13内容(b)所示，CDs‑CSG水凝胶薄膜出现由固态凝胶逐渐转变为溶胶的形态变化，表明上述CDs‑SCG水凝胶薄膜具有pH响应性。
[0157] 结合图13内容(a)和图13内容(b)可知，CDs‑CSG水凝胶薄膜在pH为8.0的环境中放置20min，即出现破损降解，重量开始下降，在50min时由固态凝胶转变为溶胶状，完全分散在缓冲溶液中，重量完全降解为0。当CDs‑CSG水凝胶薄膜在pH为7.5的环境中放置3h时，出现轻微破损和少量降解，但仍保持较完整稳定的形态；放置在pH为6.5、7.0的环境中的CDs‑CSG水凝胶薄膜的形态和重量几乎没有变化，表明本申请制备的CDs‑CSG水凝胶薄膜能够通过其pH响应性在水产品腐败变质时快速响应pH，为新鲜度的视觉感官判断提供强有力的支撑。
[0158] 上述CDs‑SCG水凝胶球检测Hx的效果：
[0159] 将不同浓度的Hx、CDs‑CSG水凝胶球和pH＝4.0的PBS在EP管中混合，37℃孵育60min后，取出CDs‑CSG水凝胶球。使用智能手机拍照读取CDs‑CSG水凝胶球孵育前后的R/B值，计算得到凝胶球色差值ΔR/B和Hx浓度之间的数量关系。
[0160] 如图14内容(a)所示，随着Hx的浓度从1.5μM增加至1500μM时，响应信号ΔR/B也随之增大，ΔR/B与Hx浓度呈现良好的线性关系，回归方程为y＝0.10567x+0.00374，相关系数2
(R)为0.9996，检测下限为1.48μM(LOD＝3σ/S)，其中x为Hx浓度的对数，y为CDs‑CSG水凝胶球的ΔR/B。智能手机可以用作终端读取器，捕获图像并将颜色信号转换为RGB颜色图案的数字值，以准确确定Hx浓度。
[0161] 上述CDs‑SCG水凝胶检测实际样品中Hx的效果：
[0162] CDs‑CSG水凝胶球定量检测虾的Hx，具体是：将新鲜基围虾处死后于25℃分别放置0、3、6、9、12h，进行取样，然后检测Hx含量。取样方法为：将放置不同时间的2g去壳虾肉搅碎后加10mL纯化水，震荡1min，超声15min，4000r/min离心5min，取上清液加入10％三氯乙酸，震荡1min，4000r/min离心10min，取上清液过45μM聚醚砜(PES)滤膜，得到提取好的Hx样液。
检测Hx含量方法为：将Hx样液、CDs‑CSG水凝胶球和PBS(pH＝4)在EP管中混合，37℃孵育
60min，取出CDs‑CSG水凝胶球。用智能手机拍照读取CDs‑CSG水凝胶球孵育前后的R/B值。
[0163] 一般认为，虾肉中Hx含量与其新鲜度的关系为：新鲜度：≤72mg/kg；亚鲜度：72～118mg/kg；腐烂度：≥118mg/kg。CDs‑CSG水凝胶球检测虾肉中Hx的结果见图14内容(b)，在
9h时检测到Hx大于118mg/kg，同时虾肉有较明显的异味和变色，表明此时虾已经腐败变质，无法再食用。
[0164] 上述CDs‑CSG凝胶薄膜在线监测实际样品的腐败情况：
[0165] 将新鲜基围虾处死后，将CDs‑CSG水凝胶薄膜轻附在虾表面，以SCP凝胶膜(无pH和Hx响应性)作为对照，将贴有水凝胶薄膜的虾置于培养皿中，用保鲜膜封好，于25℃分别放置0、3、6、9、12h，观察记录水凝胶薄膜的颜色和形态变化。
[0166] 如图15内容(a)、图15内容(b)、图15内容(c)、图15内容(d)、图15内容(e)所示，随着放置时间延长，虾不断腐败，水凝胶薄膜的蓝色逐渐消失，且凝胶逐渐溶化。当虾在25℃中放置9h时，如图15内容(f)所示，水凝胶薄膜蓝色完全消失，同时与对照凝胶膜相比水凝胶转化为溶胶状，水凝胶的形貌出现肉眼可见的明显变化，此时虾出现明显异味，且虾壳颜色从新鲜时有光泽的青绿色变为暗淡的灰白色，甚至还出现较明显的黑斑，说明虾已经腐败，无法再食用，表明此时虾中Hx＞118mg/kg、pH≥8.0。此结果与水凝胶球定量检测Hx指示虾的新鲜度的结果一致，表明CDs‑CSG水凝胶薄膜通过形态和颜色变化能够准确评价虾的新鲜度，能够作为长期在线监测水产品新鲜度的可靠有力工具。
[0167] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
