[0001] 本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与提高大麦籽粒氮素利用效率QTL Qnutegy.sau‑2H紧密连锁的SNP分子标记及其用途。

[0002] 大麦(Hordeum vulgare L.)是重要的谷类作物之一，种植遍布世界各地，在世界2
作物产量中排名第五位，种植面积约56万km，总产约1.2亿公吨，我国种植面积约为2438万亩。

[0003] 氮是植物生长发育不可或缺的营养元素之一。作物产量的增加主要取决于氮肥的施用。在过去的40年里，全球粮食产量的翻倍与氮素利用效率的激增密切相关。过量施用氮肥会降低氮利用效率，导致一系列环境问题，如全球酸化、平流层臭氧破坏和水体富营养化。随着全球种植面积的减少和粮食需求的增加，种植高氮素利用效率的作物在减少氮肥施用量和提高粮食产量方面起着非常重要的作用。

[0004] 与其他作物相比，大麦是最早的驯化植物之一。它可以在更广泛的条件下生长，特别是在各种胁迫下。随着现代育种和集约化农业的发展，栽培大麦品种的遗传多样性减少，许多优良的等位基因丢失。因此，许多栽培的大麦品种对各种非生物和生物胁迫环境都很敏感。野生大麦在肥力差的土壤中能保持正常生长和生产力。具有丰富的遗传多样性，可为大麦育种提供优良的基因，从而打破遗传改良的瓶颈。在低氮胁迫下培育具有较强生长能力和更高的物质生产能力的新作物品种，是目前提高氮素利用效率的有效途径。因此，在低氮条件下选育具有耐低氮能力高或氮效率高的大麦品种意义重大。

[0005] 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)标记指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有数量多、分布广泛、在单个基因和整个基因组中分布不均匀以及SNP等位基因频率容易估计的优点，是当前遗传标记研究中最多，也是最有前景的分子标记。其中，55K SNP芯片、90K SNP芯片和660K SNP等芯片在大麦中已被广泛运用。

[0006] 竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)研发的具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及In Del位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。

[0007] 近年来，已有关于大麦氮素相关性状QTL定位的相关报道，然而目前与籽粒氮素利用效率性状且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记较少，因此进一步鉴定到更具实用价值的籽粒氮素利用效率QTL或基因，利用分子生物学技术，选择高籽粒氮素利用效率的大麦株系以及利用分子生物学技术进行大麦育种具有重要的指导意义。

[0032] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

[0033] 实施例1

[0034] 大麦籽粒氮素利用效率QTL Qnutegy.sau‑2H及其分子标记KASP‑nutegy‑sau1的获得，具体过程如下：

[0035] (1)利用大麦品系‘Baudin’为母本，以大麦品系‘CN4027’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传种法获得含有128个株系的F9代RIL群体构成遗传作图群体。

[0036] (2)重组自交系群体籽粒氮素利用效率表型鉴定：采用田间实验，共种植2个生态点(2017和2018什邡)，田间试验采取裂区设计，主区为氮处理，副区为基因型。两主区之间用60cm深的沟渠隔开。设置两个氮处理：正常施氮磷钾肥，不施氮肥，正常施磷钾肥。正常施‑2 ‑2纯氮150kg·hm ，氮源为尿素。两处理均施用纯磷P2O5 75kg·hm ，磷源为过磷酸钙，纯钾‑2
K2O 75kg·hm ，钾源为氯化钾。单行区，行长80cm，行距10cm，每行点播15粒大麦种子，行区之间隔一行。每个单行区为1次重复，每个处理3次重复。田间管理遵循当地的常规管理方法。在成熟期，每行随机收取3个单株，将收获的秸秆置于105℃杀青30min后于80℃烘干至恒重。称量干重后研磨过筛，称取0.10‑0.20g样品并加入H2SO4‑H2O2消煮，然后用凯氏定氮仪测量氮含量。

[0037] (3)DArT芯片分析

[0038] a)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用DArT芯片技术，以亲本Baudin和CN4027的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本Baudin的带型记为A，亲本CN4027的带型记为B。群体株系带型来源于Baudin的记为A，来源于CN4027的记为B，杂合型为H。

[0039] b)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建大麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 5.0的多重QTL作图模型(Multiple QTL Model)，并结合群体在施用正常氮水平与不施氮肥条件下的籽粒氮素利用效率表型数据进行QTL定位分析，但仅在低氮条件下鉴定到Qnutegy.sau‑2H，其位于2H染色体上一个7.6cM区段内。

[0040] c)籽粒氮素利用效率位点的比较以及分子标记的获得：前人在大麦2H染色体上报道的与籽粒氮素利用效率相关的QTL或基因较少，Mickelson等人报道控制籽粒氮素利用效率的Qgpc‑2H(564.76Mbp)位于2H染色体长臂上(Mickelson S et al.2003,Journal of experimental botany,54,801‑802)；Pasam等人报道控制籽粒粗氮白含量的QTL3_CPC(42.23Mbp)、QTL4_CPC(516.16Mbp)、QTL5_CPC(625.76Mbp)、QTL6_CPC(677.84Mbp)、QTL7_CPC(707.26Mbp)和QTL8_CPC(745.12Mbp)位于2H染色体上(Pasam R et al.2012,BMC plant biology,12,16)；Muehlbauer等人报道控制籽粒氮含量的QGpc2H.54(93.02Mbp)和QGpc2H.86(580.71Mbp)(Muehlbauer G et al.2014,The plant genome,7,3)。本研究在大麦2H染色体上鉴定到一个控制籽粒氮素利用效率的QTL Qnutegy.sau‑2H位于649.65‑661.57Mbp。这表明Qnutegy.sau‑2H很可能是新的QTL。

[0041] 为了进一步密化图谱并获得与Qnutegy.sau‑2H紧密连锁的分子标记，利用SNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因。进一步对基因进行测序，挖掘多态性位点，从而开发获得高效的KASP分子标记。

[0042] 最终经过多次克隆测序，引物设计和扩增，共设计KASP引物4对(表1)，最终得到标记KASP‑nutegy‑sau1(多态性A/G)与籽粒氮素利用效率QTL Qnutegy.sau‑2H紧密连锁。

[0043] 表1KASP引物序列

[0044]

[0045]

[0046] d)进行分析。设计的4对KASP引物中最终得到了1个分子标记，即KASP‑nutegy‑sau1，其与籽粒氮素利用效率QTL紧密连锁。结果如图1和图2所示。

[0047] 实施例2

[0048] 分子标记KASP‑nutegy‑sau1在选择控制籽粒氮素利用效率QTL Qnutegy.sau‑2H上的应用，具体如下：

[0049] (1)利用日本地方种质资源大麦‘CN4079’为父本，栽培大麦‘Baudin’为母本构建重组自交系，在后代株系中随机选择92个株系。

[0050] (2)对所获得的92个株系进行KASP‑nutegy‑sau1标记检测，具体方法为：提取92个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP‑nutegy‑sau1的特异性引物对为引物进行PCR。

[0051] FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)5’‑GAAGGTGACCAA GTTCATGCTTTCATCGTCACTAGGAAGTCTTTCA‑3’(SEQ ID NO.1)

[0052] HEX标签上引物(下划线部分为FHM标签序列)5’‑GAAGGTCGGAGTC AACGGATTTTTCATCGTCACTAGGAAGTCTTTCG‑3’(SEQ ID NO.2)

[0053] 通用下游引物：5’‑GGTACTGACCCAGACGACCC‑3’(SEQ ID No.3)

[0054] 上述荧光定量PCR的反应体系为：5μL Master Mix、5ng模板DNA、1.4μL混合引物(由引物SEQ ID No.1‑3均按照10ng/μL的浓度，分别使用120μL、120μL和300μL，并添加460μL ddH2O进行混合)、ddH2O加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以ddH2O代替DNA模板的空白；所述荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。

[0055] 荧光读值结果(如图3所示)，将检测到与‘Baudin’一致的FAM(正方形)荧光的植株基因型记为A，为较高籽粒氮素利用效率株系，同‘CN4079’一样表现为HEX(圆形)荧光的植株基因型记为B，为较低籽粒氮素利用效率株系。各个株系基因型与籽粒氮素利用效率田间表型值如表2所示。

[0056] 表2‘Baudin’בCN4079’重组自交系KASP‑nutegy‑sau1基因型与表型对应结果[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062] 最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。