[0001] 本发明涉及定点突变Hog1p在提高酿酒酵母利用木糖产乙醇中的应用，属于生物工程领域。

[0002] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养，环境适应性强等优点，是生产燃料乙醇的理想菌株，但由于其缺乏有效的木糖利用途径，只能利用木质纤维素水解液中的葡萄糖，而不能利用木糖（占木质纤维素水解糖的18 30%），限制了其纤维乙醇生产中的应用。木质纤维素预处理过程中产生的多种抑制物~对酿酒酵母的生长及葡萄糖木糖代谢产生较大负面影响。因此，提高酿酒酵母高效利用木质纤维素预处理液中葡萄糖木糖和对抑制物的耐受性是利用酿酒酵母高效转化燃料乙醇的基本要求。全球科学家通过途径工程、适应性驯化等策略使酿酒酵母的葡萄糖木糖共利用能力和对抑制物的耐受性分别得到较明显地提升。然而，越来越多的研究表明，酿酒酵母的木糖代谢能力更容易受到抑制物的影响，提高酿酒酵母对抑制物耐受性的增加往往伴随着木糖利用能力的显著下降，反之亦然（Bellissimi, E., van Dijken, J.P., et al., 
2009. Effects of acetic acid on the kinetics of xylose fermentation by an engineered, xylose‑isomerase‑basedSaccharomyces cerevisiaestrain. FEMS Yeast Res. 9(3), 358‑364.; Demeke, M.M., Dumortier, F., Li, Y.Y., et al., 2013. Combining  inhibitor  tolerance  and  D‑xylose  fermentation  in industrialSaccharomyces cerevisiaefor efficient lignocellulose‑based bioethanol production. Biotechnol. Biofuels. 6 (1), 120.; Wei, F., Li, M., Wang, M., Li,  H., et al., 2021. A C6/C5 co‑fermentingSaccharomyces cerevisiaestrain with the alleviation of antagonism between xylose utilization and robustness. GCB Bioenergy 13 (1), 83‑97.），酿酒酵母的木糖代谢能力和对抑制物的耐受性往往呈现此消彼长的拮抗现象，同一菌株很难同时呈现较强的木糖代谢能力和较高的耐受性，这也是酿酒酵母在利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中存在的技术瓶颈，相关机制尚未被研究清楚。

[0003] 酿酒酵母促分裂原活化蛋白激酶Hog1p是酿酒酵母中应对高渗透压胁迫环境应答的主要调控因子，通过介导高渗透性甘油促分裂原激酶（HOG‑MAPK）信号通路、调控相关基因表达、介导细胞周期阻滞等机制，显著提升酿酒酵母的抗逆性和增强细胞对外界不利环境的适应能力。在高渗透压条件下，酿酒酵母通过渗透传感复合体Sln1p‑Ypd1p‑Ssk1p和膜结合的Sho1p系统接收信号，然后通过Ssk2p/Ssk22p将信号传递给Pbs2p，被激活的Pbs2p通过对Hog1p的Thr‑174和Tyr‑176双重磷酸化激活Hog1p，磷酸化的Hog1p进入细胞核内，以调控渗透相关的基因表达应对胁迫，一般来说正常条件下Hog1p主要分布于细胞质中，当受到胁迫刺激后Hog1p的Thr‑174和Tyr‑176被Pbs2p磷酸化，磷酸化的Hog1p易位到细胞核中，调控胁迫应答相关基因的表达。当细胞重新适应环境蛋白磷酸酶Ptp1p、Ptp2p会与Hog1p相互作用，从而使Hog1p去磷酸化，Hog1p重新分布到细胞核中。

[0004] Hog1p包含激酶结构域，CD结构域（Common docking）和PBD‑2结构域（Pbs2‑binding domain），其中激酶结构域结构域位于第23位至第302位氨基酸，该结构域的Thr‑174和Tyr‑176可被Pbs2p磷酸化，从而激活Hog1p的表达。酿酒酵母定点突变Hog1p激酶结构域中第237位脯氨酸在缓解酿酒酵母木糖利用和乙酸耐受性之间的拮抗现象方面的积极作用尚无报道，也没有其促进酿酒酵母在含有乙酸条件下转化木糖生成乙醇相关的报道。

[0014] 下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，是本发明的较佳实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

[0015] 下述实施例中涉及的菌株和培养基概述：SC‑Ura培养基：1.7 g/L Yeast Nitrogen Base（YNB），5 g/L硫酸铵，0.77 g/L CSM‑Ura（缺尿嘧啶的必需氨基酸混合物），固体培养基添加20 g/L的琼脂粉，调整pH至5以上，115℃灭菌30 min。用作活化培养基时，添加20 g/L葡萄糖，用作发酵培养基时，添加20 g/L木糖或20 g/L木糖和2.5 g/L乙酸。

[0016] 实施例1：定点突变酿酒酵母菌株Hog1p的第237位脯氨酸利用Cre‑loxP系统（Güldener, U., Heck, S., Fielder, T., et al., 1996. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24 (13), 2519‑2524.）将酿酒酵母BSPC312菌株（Shen Y, Chen X, Peng B, Chen L, Hou J, Bao X. An efficient xylose‑fermenting recombinant Saccharomyces cerevisiae strain obtained through adaptive evolution and its global transcription profile. Appl Microbiol Biotechnol. 2012, 96(4):1079‑P237G
1091. ）Hog1p的第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸，获得突变株HOG1 。

[0017] 实施例2：HOG1P237G菌株在含有20 g/L木糖的SC‑Ura培养基中的限氧摇瓶发酵性能评估P237G
挑取HOG1 和对照菌株BSPC312的单菌落，分别接种到5 mL含有含有20 g/L葡萄糖的SC‑Ura液体培养基，于30℃摇床中200 rpm活化培养12 h 24 h，待菌液浑浊后再转接~
至5 mL含有20 g/L葡萄糖的SC‑Ura培养基中进行第二次活化，活化时间为12 h 24 h。将活~
化的种子液接种至装有30 mL含有20 g/L木糖的SC‑Ura培养基的限氧瓶中，调整起始OD600为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用高效液相色谱P237G
分析发酵液成分，结果如图1所示，HOG1 的木糖利用和乙醇产生均高于对照菌株，乙醇得率提高了72.4%，说明将Hog1p的第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸能提高酿酒酵母利用纯木糖产乙醇的得率。

[0018] 实施例3：HOG1P237G菌株在含有2.5 g/L乙酸和20 g/L木糖的SC‑Ura培养基中的限氧摇瓶发酵性能评估P237G
挑取HOG1 和对照菌株BSPC312的单菌落，分别接种到5 mL含有20 g/L葡萄糖的SC‑Ura液体培养基，于30℃摇床中200 rpm活化培养12 h 24 h，待菌液浑浊后再转接至5 ~
mL含有20 g/L葡萄糖的SC‑Ura培养基中进行第二次活化，活化时间为12 h 24 h。将活化的~
种子液接种至装有30 mL含有2.5 g/L乙酸和20 g/L木糖的SC‑Ura培养基的限氧瓶中，调整起始OD600为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外P237G
可见分光光度计测定发酵液的OD600，结果如图2所示，HOG1 的生长明显好于对照菌株。利P237G
用高效液相色谱分析发酵液成分，HOG1 的木糖利用和乙醇产生均高于对照菌株，乙醇得率提高了25.8%（图3）；乙酸的消耗速度明显高于对照菌株，产生的副产物甘油略低于对照菌株（图4）。说明将Hog1p的第237位脯氨酸定点突变为甘氨酸能提高菌株的乙酸消耗速度增强菌株的耐受性，进而提高菌株在乙酸条件下利用木糖产生更多的乙醇。