[0003] 公开了涉及对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶的组合物和方法。这些组合物和方法特别适用于在通过酵母和真菌细胞产生的蛋白质中进行接头特异性裂解。这些组合物和方法的一个用途是用于附聚发酵产品中的酵母和酵母组分。组合物的另一个用途是用于产生碳水化合物含量减少的蛋白质的级分。

[0004] 蛋白质糖基化是对多肽链的常见天然修饰。糖基化是指碳水化合物附接到蛋白质的官能团，以调节折叠、稳定性、溶解度和蛋白质‑蛋白质相互作用。已知不同类型的蛋白质糖基化，通常可归类为将碳水化合物附接到天冬酰胺或精氨酸残基的氨基基团的N‑连接糖基化，以及将碳水化合物附接到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基基团的O‑连接糖基化。

[0005] 在特定的O‑连接糖基化形式中，甘露糖直接附接到丝氨酸和苏氨酸残基，通常在模块蛋白质的接头结构域中。这样的修饰主要发生在酵母和真菌细胞中，但很少发生在细菌细胞中。虽然以前已经描述过这种O‑连接糖基化形式，但是尚未描述过将其开发用于商业目的的能力。

[0042] 1.定义和缩写

[0043] 在描述本发明的组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了以下定义和缩写。

[0044] 根据这一详细说明，以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有清楚地指示。因此，例如，提及“酶”包括多种这样的酶，并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一次或多次剂量及其等效物等。

[0045] 将本文件组织成若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被解释为限制。

[0046] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。为了清楚起见，以下术语定义如下。

[0047] 如本文所用，“甘露糖修饰的”氨基酸序列是具有其中甘露糖直接附接到丝氨酸和苏氨酸残基的O‑连接糖基化形式的连续氨基酸序列。

[0048] 如本文所用，“靶”蛋白是预选或潜在的具有甘露糖修饰的氨基酸序列的目的蛋白。

[0049] 如本文所用，“甘露糖特异性糖蛋白酶活性”是指对具有其中甘露糖直接附接到丝氨酸和苏氨酸残基的O‑连接糖基化形式的连续氨基酸序列的蛋白水解活性。

[0050] 如本文所用，“接头”是使模块蛋白质中不同结构域(如核心区和结合结构域)分隔开的连续氨基酸序列。

[0051] 如在此所用，术语“接触”是指使多种组分物理接近，例如以促进化学反应。

[0052] 如本文所用，“重组多肽”是在异源生物中制备的多肽或由人类操纵的基因表达的多肽。

[0053] 如在此所用，“附聚”是指由多个小团块形成单个团块。

[0054] 如本文所用，“破坏生物”是指使完整的细胞裂解或破裂。

[0055] 如本文所用，“全釜馏物”是蒸馏后干磨乙醇生产设施的副产品。

[0056] 如本文所用，“稀釜馏物”是分离固体材料后全釜馏物的液体部分。

[0057] 如本文所用，“酒糟(DG)”是全釜馏物的固体/浆液组分。

[0058] 如本文所用，“干酒糟(DDG)”是已干燥的DG。

[0059] 如本文所用，“具溶解物的干酒糟(distillers’dried grains with solutes，DDGS)”是与浓缩的稀釜馏物一起进行干燥以增加营养价值的DG。

[0060] 如本文所用，术语“约”是指参考值的±15％。

[0061] 除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

[0062] EC 酶学委员会

[0063] ℃ 摄氏度

[0064] g或gm 克

[0065] μg 微克

[0066] mg 毫克

[0067] kg 千克

[0068] μL和μl 微升

[0069] mL和ml 毫升

[0070] nm 纳米

[0071] U 单位

[0072] min 分钟

[0073] rpm 转数/分钟

[0074] hr 小时

[0075] CAZy 碳水化合物活性酶数据库

[0076] DG 酒糟

[0077] DDG 干酒糟

[0078] DDGS 具溶解物的干酒糟

[0079] rcf 相对离心力

[0080] sd 标准偏差

[0081] HMM 隐马尔可夫模型(HMM)

[0082] RI 折射率

[0083] 2.对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶

[0084] 在特定的O‑连接糖基化形式中，甘露糖直接附接到丝氨酸和苏氨酸残基。虽然已经描述了该糖基化形式，但是迄今为止既没有描述也没有利用该糖基化形式在某些蛋白质的接头区中的普遍性，以及使用特定类别的蛋白酶选择性蛋白水解这样的蛋白质的接头区的能力。O‑连接甘露糖糖基化主要发生在酵母和真菌细胞中，但很少发生在植物细胞和细菌细胞中。最值得注意的是，O‑连接甘露糖糖基化发生在由酵母表达和修饰的蛋白质中，其对酿造、酿酒、药理学和工业的重要性怎么强调都不为过。虽然已经报道了直接的甘露糖连接可以提高肽(以及引伸至蛋白质)对蛋白水解的抗性，但是尚未将这样的连接作为控制蛋白质活性或物理特性的手段的目标。

[0085] 诸位申请人最初鉴定了在来自谷物乙醇工厂的多种形式的釜馏物存在下孵育时表现出的出乎意料特性的重组多肽。对这些蛋白质的进一步研究证明，这些重组多肽是对直接O‑连接的甘露糖糖基化的蛋白质、特别是在模块蛋白质的接头区中具有这样的糖基化的那些蛋白质(诸如由酵母和真菌产生的蛋白质)具有特异性的蛋白酶。

[0086] 3.对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶的特征

[0087] 第一个鉴定的对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶被称为IFF05497(SEQ ID NO:1)。使用该分子收集了大量数据，特别是涉及对来自燃料乙醇设施的釜馏物的澄清以及酵母的附聚。进一步的研究表明，IFF05497是对某些水解酶的接头中甘露糖修饰的氨基酸序列具有特异性的蛋白酶，这些水解酶也可以被称为直接O‑连接的甘露糖糖基化的蛋白质。

[0088] 通过多种方法(包括序列同一性)鉴定了表现出对甘露糖修饰的氨基酸序列具有相同修饰的另外的分子。这些分子包括以下，其中氨基酸和核酸序列分别在括号中：IFF21332(SEQ ID NO:2)、IFF21333(SEQ ID NO:3)、IFF21334(SEQ ID NO:4)、IFF21335(SEQ ID NO:5)、IFF21338(SEQ ID NO:6)、IFF21340(SEQ ID NO:7)、IFF21347(SEQ ID NO:
8)、IFF21350(SEQ ID NO:9)、IFF21354(SEQ ID NO:11)、IFF21359(SEQ ID NO:12)、IFF21360(SEQ ID NO:13)、IFF21363(SEQ ID NO:15)、IFF21364(SEQ ID NO:16)、IFF21365(SEQ ID NO:17)、IFF21372(SEQ ID NO:18)、IFF21374(SEQ ID NO:19)、IFF21375(SEQ ID NO:20)、IFF21378(SEQ ID NO:21)、IFF21379(SEQ ID NO:22)、IFF21380(SEQ ID NO:23)、IFF21344(SEQ ID NO:24)、IFF21366(SEQ ID NO:26)、IFF21331(SEQ ID NO:36)、IFF21336(SEQ ID NO:37)、IFF21337(SEQ ID NO:38)、IFF21339(SEQ ID NO:39)、IFF21341(SEQ ID NO:40)、IFF21342(SEQ ID NO:41)、IFF21343(SEQ ID NO:42)、IFF21345(SEQ ID NO:43)、IFF21346(SEQ ID NO:44)、IFF21348(SEQ ID NO:45)、IFF21349(SEQ ID NO:46)、IFF21351(SEQ ID NO:47)、IFF21352(SEQ ID NO:48)、21367(SEQ ID NO:53)、IFF21368(SEQ ID NO:
54)、IFF21369(SEQ ID NO:55)、IFF21371(SEQ ID NO:57)和IFF21377(SEQ ID NO:59)。另外的分子可以基于氨基酸序列同一性通过改良的隐马尔可夫模型(HMM)来鉴定，该改良的隐马尔可夫模型命名为“TreSub‑21374_NRBlast_HSS‑id35‑qc70_T2k”，在此以电子方式提交(参见例如，,Benson,G.(2011)Nuc.Acids Res.[核酸研究]39,第W29–W37页和Eddy,S.R.(2011)Accelerated Profile  HMM  Searches[加速配置文件HMM搜索].PLOS Computational Biology[公共科学图书馆：计算生物学]7:e1002195.https://doi.org/
10.1371/journal.pcbi.1002195)。

[0089] 所鉴定的对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶容易通过常规方法进行表达，并且在一些情况下容易纯化。利用进一步的实验，进行进一步的优化无疑是可能的。

[0090] 4.对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶的应用

[0091] 存在大量迄今未知的用于通过对甘露糖修饰的氨基酸序列具有特异性的蛋白酶来处理甘露糖修饰的靶蛋白的应用。应当认识到，这样的应用必须排除自然界中这样的靶蛋白与蛋白酶接触的那些应用。本发明的组合物和方法的任何实施例均不应被理解为涵盖自然界中发生的事件。本发明的组合物和方法的所有实施例均发生在非天然发生的环境中，最有可能发生在工业环境中，其包括药物工业环境，其中甘露糖修饰的氨基酸序列和对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶在没有人干预的情况下不会相互作用。在一些实施例中，甘露糖修饰的靶蛋白和具有甘露糖特异性糖蛋白酶活性的重组多肽来自不同的生物。

[0092] 本发明的组合物和方法的一个应用是酵母或真菌细胞、细胞体和/或经破坏的酵母的细胞组分的聚集或附聚。不受理论的束缚，甘露糖蛋白存在于酵母或真菌细胞片段的亲水性表面，包括细胞膜。这些表面在甘露糖蛋白水解时变得更具疏水性。然后，更具疏水性的酵母或真菌细胞或细胞片段聚集在含水环境中。与完整的酵母和真菌细胞及其片段相比，聚集的酵母或真菌细胞或片段更容易从溶液和悬浮液中去除。

[0093] 在一个实施例中，将组合物和方法用于从发酵中去除酵母和/或酵母组分，如在啤酒或葡萄酒酿造的情况下。通过过滤、离心甚至沉降，更容易将聚集的酵母和组分从发酵产物中进行去除。酵母和组分的去除致使发酵产物澄清，除了在某些啤酒类型的情况下，这通常是理想的。

[0094] 在相关的实施例中，将组合物和方法用于从燃料乙醇设施中的发酵中去除酵母和/或酵母组分。这可以发生在蒸馏之前，以产生在动物饲料中有用的酵母副产物。这可以可替代地发生在蒸馏之后，以改变釜馏物产物的特征。如实例中所示，利用对甘露糖修饰的蛋白质具有特异性的蛋白酶对釜馏物或稀釜馏物的处理导致富含蛋白质的悬浮固体沉降。因此，固体釜馏物产物诸如DG、DDG和DDGS具有增加的蛋白质含量，增加了固体釜馏物产物作为动物饲料的价值。

[0095] 在另一个实施例中，将组合物和方法用于在深层培养物中表达除乙醇之外的有价值的蛋白质或小分子后去除酵母和/或酵母组分。如上所述，通过过滤、离心甚至沉降，更容易将聚集的酵母和组分从培养物中去除。

[0096] 在相关的实施例中，将组合物和方法用于去除疏水表面上具有甘露糖修饰的蛋白质的其他真菌细胞和真菌细胞组分。这样的细胞包括子囊菌和担子菌细胞。

[0097] 出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下特定实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。

[0098] 实例

[0099] 实例1：用于对釜馏物修饰进行检测的蛋白质的表达和纯化

[0100] 本文描述了待测定的蛋白质分子的名称、氨基酸序列和核酸序列，如表1中所示。使用标准的分子生物学程序合成编码蛋白质的基因并将其克隆到表达载体中。如WO2018/
005225A1中所述来制备蛋白质。

[0101] 表1.分子名称和相关的SEQ ID NO

[0102]

[0103]

[0104]

[0105] 实例2：全釜馏物浆料的处理

[0106] 将全釜馏物(20g)装载到50‑mL螺旋盖圆底离心管中。向每个管中添加叠氮化钠(50μL的50μg/mL溶液)。向两个管中添加IFF05497粗制剂(110μL，220μg的总蛋白质添加)。保留两个管作为不含酶的对照。向对照管中添加补偿体积的水(110μL)，以匹配所添加的酶的体积。将管在旋转混合器上在32℃下孵育三天。将管从孵育中取出，并以1,370rcf下离心
30min。如图1所示，用IFF05497处理的全釜馏物的上清液比不含酶的对照的上清液具有更大的澄清度。

[0107] 然后将反应沉淀悬浮于10mL水中，并洗涤通过筛网尺寸为1mm和200μm的堆叠筛，随后进行两次15mL的冲洗。利用三次15mL的冲洗将收集的超细固体从筛的表面洗涤下来。通过离心收集穿过200μm筛网的材料(被视为超细固体)并在65℃下干燥过夜。

[0108] 使用总氮分析(Costech)确定超细固体的蛋白质含量。利用IFF05497粗制剂对全釜馏物固体的处理产生了具有更大总蛋白质含量的超细颗粒固体(表2)，表明超细颗粒固体富含蛋白质。

[0109] 表2.超细纤维中蛋白质的级分

[0110] 添加 蛋白质(％) sd水 52.9 0.7
IFF05497 57.6 0.5

[0111] 实例3：来自全釜馏物的悬浮固体

[0112] 收集来自干磨乙醇工厂的全釜馏物并将其用IFF05497进行处理或不处理。将74g的全釜馏物倒入两个125mL的锥形烧瓶中。向每个烧瓶中添加74μL的50g/L叠氮化钠储液(参见上文)。向一个烧瓶中添加30.4μL的IFF05497(1.6mg)，同时向另一个烧瓶中添加30.4μL的水。使烧瓶在32℃且150rpm下孵育。46小时后，将烧瓶从孵育箱中取出，将每个烧瓶中约50g的全釜馏物倒入50mL离心管中。将管以3,000rpm离心5分钟。将约3g的上清液添加预先称重的托盘中，并放入70℃烘箱中干燥约72小时。之后，对干燥托盘进行称重，以确定总悬浮固体。总悬浮固体记录于表3，并在图2中进行了图示。用IFF05497处理的全釜馏物显示出悬浮固体的减少。

[0113] 表3.用IFF05497处理后或未经处理的全釜馏物上清液的总悬浮固体[0114] 条件 悬浮固体(％) sd没有酶 4.45 0.02
IFF05497 4.38 0.03

[0115] 实例4：用IFF05497处理的过滤稀釜馏物的动态光散射

[0116] 稀釜馏物是由全釜馏物通过以1,370rcf离心10min并过滤通过0.45μm注射器过滤器进行进一步处理而制备的。将IFF05497的粗制剂在缓冲液(50乙酸钠，pH 5.0)中进行稀释，并添加到过滤稀釜馏物样品中，使终浓度为约6nM、3nM和1.5nM。

[0117] 使用Wyatt动态光散射微量滴定板系统和具有黑边和透明平底的康宁公司(Corning)(3880)96孔板测量过滤稀釜馏物中悬浮颗粒的扩散系数。在添加酶后2.5小时内连续进行测量。

[0118] 用在0.45μm处过滤的稀釜馏物测量动态光散射。如图3中所示，由于添加了IFF05497，稀釜馏物中颗粒扩散系数的测量值随时间而变化。

[0119] 如图4中所示，IFF05497浓度越大，导致扩散系数下降越快。扩散系数的下降与粒度的增加一致，这与观察到的用IFF05497处理的全釜馏物上清液澄清度的增加一致。

[0120] 实例5：IFF05497对稀釜馏物的处理

[0121] 在实验室中收集来自干磨乙醇工厂的全釜馏物并将其用于制备稀釜馏物。为此，将两个1L的瓶子填充有全釜馏物，并以3,000rpm离心5分钟。将上清液收集并用作稀釜馏物样品。将50g的该稀釜馏物称取到两个250mL的锥形烧瓶中。向每个烧瓶中添加50μL的50g/L叠氮化钠储液。向一个烧瓶中添加20μL的IFF05497粗制剂(1.1mg总蛋白)。将烧瓶在32℃且150rpm下孵育。46小时后，将烧瓶从孵育箱中取出，将每个烧瓶的全部内容物倒入预先称重的50mL离心管中。将管以3,000rpm离心5分钟。倾析液体，将约3g的上清液转移到预先称重的托盘中。将含有稀釜馏物沉淀的样品托盘和离心管置于70℃烘箱中干燥约72小时。对干燥托盘和管进行称重，以确定总悬浮固体和固体回收。固体回收示出于图5中，并记录在表4中。用IFF05497处理稀釜馏物导致固体回收增加。总悬浮固体示出于图6中，并记录在表5中。用IFF05497处理稀釜馏物导致悬浮固体的减少。

[0122] 表4.来自用IFF05497处理后或未经处理的稀釜馏物的固体回收，以回收的固体/总稀釜馏物为单位。

[0123] 条件 回收的固体(％)没有酶 0.083
IFF05497 0.122

[0124] 表5.用IFF05497处理后或未经处理的稀釜馏物上清液的总悬浮固体。

[0125]条件 悬浮固体(％) sd
没有酶 3.40 0.13
IFF05497 4.265 0.012

[0126] 实例6：发酵期间对玉米液化浆料的处理

[0127] 玉米液化的浆料(35％总干燥固体)补充有600ppm尿素，使用硫酸调节至pH 4.8，加入α‑淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶，并用以0.1％wt/wt的活性干酵母干拌。将制备的浆料(100g)分装到烧瓶中。将IFF05497的粗制剂以7.7μg蛋白质/(g总干燥固体)、30.7μg蛋白质/(g总干燥固体)和99.6μg蛋白质/(g总干燥固体)的最终剂量添加到一式三份的烧瓶中。将烧瓶盖上，允许二氧化碳释放，并在32℃下培养65小时。

[0128] 孵育后，将84g浆料通过250μm筛过滤，并将含有超细颗粒的液体级分在施加温和的真空压力的情况下收集。将纤维滤饼从筛的表面转移到洗涤杯并悬浮于90mL水中。将纤维放回到筛中，并再次收集液体级分。重复进行转移、悬浮和收集步骤，总共收集四次液体级分。将超细纤维材料通过以1,370rcf离心从液体级分中收集。将上清液通过抽吸去除。将来自各个级分的超细纤维材料重悬于水并合并到单管中。将超细纤维材料的最终样品通过以1,370rcf离心收集，并将洗涤水上清液通过抽吸去除。将超细纤维材料在65℃下干燥3天。使用总氮分析(Costech)确定超细固体的蛋白质含量。如表6中所示，发酵前添加IFF05497导致从超细材料中回收的蛋白质含量增加。

[0129] 表6.与IFF05497孵育后来自SSF的超细纤维中蛋白质的级分(％)(剂量以μg蛋白质/(g总干燥固体)为单位记录)。

[0130] 酶剂量(μg/g) 蛋白质(％) sd水 52.1 0.4
7.7 52.5 0.6
33.7 52.9 0.4
99.6 52.9 0.3

[0131] 实例7：IFF05497对芽殖酵母的处理

[0132] 在存在或不存在IFF05497的情况下，在酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的溶液(YPD)中繁殖谷物乙醇工业中众所周知的酿酒酵母(Saccharomyces cerevesea)的常规菌株。简言之，以0.1％w/w将活性干酵母(ADY；Ethanol Red)添加到六个相同的带挡板烧瓶中，这些烧瓶含有100g的含有20％葡萄糖的YPD和600ppm尿素的混合物。对这些烧瓶中的三个进一步补充37.6μL的IFF05497(2.03mg总蛋白)，而其他烧瓶补充37.6μL的水。使烧瓶以200rpm在32℃下孵育26小时。孵育后，将每个烧瓶的内容物分装于两个50mL离心管，并以3,000rpm离心10min。

[0133] 倾析上清液，并将所得酵母沉淀用水洗涤，并重复离心和倾析。将所得洗涤过的沉淀在70℃的烘箱中干燥约72小时。使用艾卡公司(IKA)试管研磨机(tube mill)100研磨干燥的酵母沉淀。将所得干燥且研磨过的酵母粉末从一式三份的样品合并成一式两份的样品，用于通过燃烧和氮测量进行蛋白质测定。表7显示了用IFF05497处理或未经处理的酵母沉淀的蛋白质含量(根据测量的氮含量计算)。在IFF05497存在下生长的酵母的蛋白质含量(平均54.2％的蛋白质)高于未进行任何酶处理的酵母的蛋白质含量(53.1％的蛋白质)。

[0134] 表7.在有或没有IFF05497的ADY中生长的残余酵母的蛋白质含量

[0135]条件 残余酵母沉淀的平均蛋白质含量(％)
没有酶重复1 53.1
没有酶重复2 53.0
IFF05497重复1 54.2
IFF05497重复2 54.2

[0136] 实例8：酵母经IFF05497处理后的蛋白质含量

[0137] 如上所述在YPD中繁殖酿酒酵母菌株。将烧瓶以150rpm在32℃下孵育21小时。孵育后，将烧瓶内容物倒入六个50mL离心管并以3,000rpm离心5min。倾析上清液，并将所得酵母沉淀用超纯水通过重复离心和倾析洗涤。然后向每个管中添加2.5mL的水和2.5mL的0.3乙酸钠缓冲液(pH 5.3)。将酵母沉淀通过涡旋制成浆料，并一起收集在一个烧杯中。

[0138] 然后将烧杯放在带有搅拌棒的搅拌器上。在搅拌的同时，将10mL制备的酵母浆料移液到四个20mL的玻璃闪烁小瓶中。向每个小瓶添加叠氮化钠至终浓度为0.17％。向这些小瓶中的两个添加5μL的IFF05497粗制剂(0.27mg总蛋白)。将小瓶盖上并以150rpm在32℃下孵育。

[0139] 26小时后，取出小瓶，将样品收集到50mL离心管中。将管以3,000rpm离心5分钟。如下文所述，收集上清液中的一部分(1mL)用于进行液体分析。倾析剩余的上清液，并将沉淀用水通过重复离心和倾析洗涤。将所得洗涤过的沉淀在70℃的烘箱中干燥约72小时。

[0140] 使用艾卡公司试管研磨机100研磨干燥的酵母沉淀。将所得干燥且研磨过的酵母粉末合并用于一式两份的样品，用于通过燃烧和氮测量进行蛋白质测定。表8显示了根据测量的氮含量计算的用IFF05497处理或未经处理的酵母沉淀的蛋白质含量。进行了IFF05497处理的酵母沉淀的蛋白质含量(60.1％的蛋白质)高于未进行任何酶处理的酵母沉淀的蛋白质含量(57.8％的蛋白质)。

[0141] 表8.用IFF05497处理后或未经处理的残余酵母的蛋白质含量

[0142] 条件 残余酵母沉淀的蛋白质含量(％)没有酶 57.8
IFF05497 60.1

[0143] 将经处理的酵母样品离心后收集的液体样品通过0.22μm旋转过滤器过滤。在80℃下将所得过滤液体直接进样到安捷伦公司(Agilent)高效液相色谱(HPLC)仪器中，该仪器配有折射率(RI)检测器和飞诺美公司(Phenomenex)Rezex Organic Acids H+ROA 150x7.8 mm柱，以0.6mL/min运行0.01硫酸的等度流动相。

[0144] 还对过滤液体样品进行酸水解以测定总糖含量(单体和低聚物)。将50μL的过滤样品与50μL的0.8硫酸混合并置于压力密封的96孔板中。将板置于高压釜中并在121℃下加热45分钟。冷却后，向每个样品中添加50μL的水，并如前所述将所得混合样品进样到HPLC。

[0145] 将在5.07分钟时出现的峰合理地推定为甘露糖。在未经酸处理直接进样的样品中未检测到甘露糖，表明IFF05497不释放任何单体甘露糖。因此，在经酸处理的样品中检测到的甘露糖的量代表甘露糖低聚物，如表9中所汇总的。因此，用IFF05497处理的酵母样品比没有酶的对照多释放5.9倍的甘露糖低聚物。

[0146] 表9.用IFF05497处理后或未经处理的过滤酵母水解产物中的甘露糖低聚物含量[0147] ‑1条件 酵母水解产物中的甘露糖低聚物浓度(mgL )
没有酶 33.4
IFF05497 197.3

[0148] 实例9：IFF05497与酵母孵育导致聚集

[0149] 将纯化的IFF05497(10μL，2mg/mL)与活性酵母(500μL，1％wt/wt悬浮液)合并，并在32℃下孵育24小时。将酵母样品在水中稀释100倍并通过显微镜观察。发现用IFF05497处理的酵母细胞发生聚集(图7B)，而未经处理的细胞是分散的(图7A)。

[0150] 通过在95℃下热处理30min使酵母灭活。将纯化的IFF05497(10μL，2mg/mL)与灭活酵母(500μL，1％wt/wt悬浮液)合并，并在32℃下孵育24小时。将酵母样品在水中稀释100倍并通过显微镜观察。发现用IFF05497处理的灭活酵母细胞同样发生聚集(图8B)，而未经处理的细胞是分散的(图8A)。

[0151] 实例10：IFF05497催化活性和特异性

[0152] 将纯化的IFF05497与纯化的靶蛋白(即：IFF05588、IFF07399、IFF01509、IFF01540、IFF06679、IFF03904、IFF08955、IFF08955v3(其包括人工接头)或IFF01073)以1份与20份的比率在pH 5.0的20mM乙酸钠中合并。将反应在35℃下孵育过夜。靶蛋白的特征汇总于表10中。将反应与SDS‑PAGE上样染料合并，并将5μg总蛋白上样到SDS‑PAGE凝胶的孔中。

[0153] 含有结合模块、接头和核心结构域的蛋白质通过与IFF05497孵育而改变，导致迁移率变动(图9)。泳道分配汇总于表10中。这些结果表明，IFF05497是对结合模块与核心结构域之间存在接头的蛋白质底物具有特异性的蛋白酶。在本实例中，结合模块是碳水化合物结合模块(CBM)。

[0154] 表10.用IFF05497处理的蛋白质样品显示出凝胶迁移率变动。

[0155]

[0156]

[0157] 对经IFF05497处理然后用胰蛋白酶处理的IFF07399样品的质谱肽分析鉴定了来自IFF07399的具有己糖修饰的肽(表11)。下标中的数字表示IFF07399序列中的氨基酸位置。对于所鉴定的每个肽序列，指示了检测到的己糖修饰的数目。

[0158] 表11.通过IFF05497对IFF07399处理后所鉴定的肽。

[0159]肽序列 测定的己糖残基
T49LKTTTT55 9
T56SSTSSAPTGK66 5、6、7和8
S57STSSAPTGK66 5
S58TSSAPTGK66 4
T59SSAPTGK66 4

[0160] 已知在里氏木霉和其他真菌中表达的蛋白质在一些苏氨酸和一些丝氨酸残基上被甘露糖修饰，特别是在接头结构域中。发现多达三个甘露糖单元附接到单个丝氨酸或单个苏氨酸。IFF05497似乎是在甘露糖修饰的丝氨酸或甘露糖修饰的苏氨酸之前的裂解具有特异性的蛋白酶。

[0161] 实例11：有和没有0‑糖基化的靶蛋白

[0162] IFF01073在没有糖基化的大肠杆菌中产生，并且也在有糖基化的里氏木霉中产生。将纯化的IFF05497与在大肠杆菌中表达的或在里氏木霉中表达的IFF01073的粗制剂以1份与20份的比率在pH 5.0的20乙酸钠中合并。将反应在35℃下孵育过夜。如前所述，通过SDS‑PAGE对反应进行分析。

[0163] IFF05497对在里氏木霉中产生的蛋白质IFF01073进行了修饰，但对在大肠杆菌中产生的未经甘露糖修饰的相同氨基酸序列没有进行修饰(图10和图11)。这些结果证实IFF05497是对具有直接连接的甘露糖修饰的蛋白质底物具有特异性的蛋白酶。

[0164] 表12.IFF05497对在里氏木霉或大肠杆菌中产生的IFF01073的活性。

[0165]泳道 蛋白质 表达宿主 凝胶迁移率变化
A1 IFF01073 大肠杆菌 ‑
A2 IFF01073和IFF05497 大肠杆菌 否
B1 IFF01073 里氏木霉 ‑
B2 IFF01073和IFF05497 里氏木霉 是
C IFF05497 里氏木霉 ‑

[0166] 实例12：IFF05497相关蛋白的活性

[0167] 将纯化的IFF05497、IFF21344、IFF21358、IFF21366或IFF21374与IFF07399以1份与20份的比率在pH 5.0的20乙酸钠中合并。将反应在35℃下孵育过夜。如前所述，通过SDS‑PAGE对反应进行分析。

[0168] IFF05497、IFF21344、IFF21358、IFF21366和IFF21374均具有引起蛋白质IFF07399迁移率变动的能力(图11和图12以及表13)。所有这些似乎都是具有与IFF05497相似的活性和特异性的蛋白酶。

[0169] 表13.IFF07399与IFF05497或相关蛋白孵育

[0170]泳道 蛋白质 凝胶迁移率变化
A1 IFF07399 ‑
B1 IFF07399和IFF05497 是
B2 IFF05497 ‑
C1 IFF07399和IFF21344 是
C2 IFF21344 ‑
D1 IFF07399和IFF21358 是
D2 IFF21358 ‑
E1 IFF07399和IFF21366 是
E2 IFF21366 ‑
F1 IFF07399和IFF21374 是
F2 IFF21374 ‑

[0171] 通过摇瓶规模的发酵制备与IFF05497相关的蛋白质(即，IFF21359、IFF21354、IFF21335、IFF21360、IFF21334、IFF21332、IFF21375、IFF21350、IFF21365、IFF21380、IFF21338、IFF21372、IFF21333、IFF21347、IFF21378、IFF21374、IFF21364、IFF21379、IFF21340、IFF21363、IFF21353和IFF21362)的粗制样品。使用具有5kDa标称分子量截止值‑1 ‑1的离心蛋白质浓缩装置将来自发酵的上清液浓缩10倍至终浓度为1.8g L 至5.5g L 。使用标称分子量截止值为7kDa的尺寸排阻色谱树脂，将浓缩样品缓冲液交换到pH 5.0的50乙酸钠缓冲液中。将IFF05588的粗制剂在pH 5.0的50乙酸钠缓冲液中稀释至终浓度为2g/L。

[0172] 将IFF05497相关粗蛋白的浓缩制剂(5μL，浓度范围为1.8g L‑1至5.5g L‑1)与IFF05588的稀释制剂(95μL的2g/L稀释液)合并。将反应在25℃下孵育24小时。然后将样品过滤并通过使用Zorbax300SB‑C3柱、用含有0.1％三氟乙酸的水与乙腈的梯度进行反相色谱法来分析。

[0173] 观察到IFF05588的修饰形成了保留时间比从完整IFF05588获得的峰更靠后的峰(图12)。对IFF05588的总峰面积和6.6分钟后的峰面积进行了定量，计算了后峰面积除以总峰面积的比率，以表示对IFF05588修饰的程度。该比率是相对后峰面积，并记录于表14中。在这些反应条件下，除了一个(IFF21362)以外，所有含有与IFF05497相关的蛋白质的样品都能够修饰IFF05588。

[0174] 表14.IFF05588与IFF05497或相关蛋白质孵育

[0175]蛋白酶 相对后峰面积
IFF21359 0.68
IFF21354 0.67
IFF21335 0.66
IFF21360 0.66
IFF21334 0.65
IFF21332 0.65
IFF21375 0.63
IFF21350 0.61
IFF21365 0.61
IFF21380 0.61
IFF21338 0.60
IFF21372 0.60
IFF21333 0.59
IFF21347 0.59
IFF21378 0.52
IFF21374 0.51
IFF21364 0.49
IFF21379 0.45
IFF21340 0.33
IFF21363 0.30
IFF21353 0.25
缓冲液 0.24
IFF21362 0.23

[0176] 实例13：与IFF05497相关的蛋白质的另外的活性

[0177] 通过在摇瓶中发酵至终浓度为0.8g/L至2.6g/L来制备与IFF05497相关的蛋白质(IFF21331、IFF21332、IFF21333、IFF21334、IFF21335、IFF21336、IFF21337、IFF21338、IFF21339、IFF21340、IFF21341、IFF21342、IFF21343、IFF21344、IFF21345、IFF21346、IFF21347、IFF21348、IFF21349、IFF21350、IFF21351、IFF21352、IFF21353、IFF21354、IFF21355、IFF21356、IFF21357、IFF21358、IFF21359、IFF21360、IFF21361、IFF21362、IFF21363、IFF21364、IFF21365、IFF21366、IFF21367、IFF21368、IFF21369、IFF21370、IFF21371、IFF21372、IFF21374、IFF21375、IFF21376、IFF21377、IFF21378、IFF21379和IFF21380)的粗制样品。从5.9g/L开始制备富集的IFF05497的稀释系列，将其连续稀释10倍、100倍和1,000倍以及10,000倍，以便在反应测试中包括粗制样品。将IFF05588的粗制剂在pH 5.0的50乙酸钠缓冲液中稀释至终浓度为2g/L。

[0178] 将IFF05497相关蛋白质的粗制剂(5μL)与IFF05588的稀释制剂(95μL)合并。在与EDTA(0.5M)合并之前，将反应在25℃下孵育5、10和15分钟。然后将样品过滤并通过使用Zorbax 300SB‑C3柱、用含有0.1％三氟乙酸的水与乙腈的梯度进行反相色谱法来分析。

[0179] 观察到IFF05588修饰形成了保留时间比从完整IFF05588获得的峰更靠后的峰，如显示用IFF21347对IFF05588处理的图12中所证明的。

[0180] 对IFF05588的总峰面积和6.6分钟后的峰面积进行了定量，计算了后峰面积除以总峰面积的比率，以表示对IFF05588修饰的程度。将每个时间点的相对峰面积值通过减去在该时间点观察到的所有相对峰面积的平均值而中心化(centered)。将峰面积中的那些中心化差值通过将该中心化差值除以相对峰面积的标准偏差来缩放。然后对每个样品在所有时间点的相对峰面积的中心化值和缩放值进行平均。该平均的缩放和中心化比率是相对活性的表示，并记录于表15中。在这些反应条件下，除了七个(IFF21355、IFF21358、IFF21356、IFF21361、IFF21370、IFF21357和IFF21353)以外，所有含有与IFF05497相关的蛋白质的样品都能够修饰IFF05588。

[0181] 表15.IFF05588与IFF05497或相关蛋白质孵育显示保留时间和峰形发生变动[0182]

[0183]

[0184] 将制备用于短时间反应孵育的一些粗制样品进一步稀释2倍或10倍，取决于在短时间孵育中观察到的活性水平。一些样品在没有进一步稀释的情况下使用(参见表16)。然后将稀释的粗样品和对照(1μL、2μL和5μL)与IFF05588的稀释制剂(95μL)合并。在与EDTA(0.5M)合并之前，将反应在25℃下孵育24小时。然后将样品过滤并通过使用Zorbax 300SB‑C3柱、用含有0.1％三氟乙酸的水与乙腈的梯度进行反相色谱法来分析。观察到IFF05588修饰形成了保留时间比从完整IFF05588获得的峰更靠后的峰，如显示用IFF21347对IFF05588处理的图12中所证明的。

[0185] 对IFF05588的总峰面积和6.6分钟后的峰面积进行了定量，计算了后峰面积除以总峰面积的比率，以表示对IFF05588修饰的程度。将每种剂量的相对峰面积值通过减去在该剂量下观察到的所有相对峰面积的平均值而中心化。将峰面积中的那些中心化差值通过将该中心化差值除以相对峰面积的标准偏差来缩放。然后对每个样品在所有剂量下的相对峰面积的中心化值和缩放值进行平均。该平均的缩放和中心化比率是相对活性的表示，并记录于表16中。在这些反应条件下，除了两个(IFF21376和IFF21361)以外，所有含有与IFF05497相关的蛋白质的样品都能够修饰IFF05588。对这两个样品的色谱图进行密切比较显示缓冲液与样品色谱图之间的差异表明了样品中的活性。

[0186] 表16.IFF05588与不同剂量的IFF05497或相关蛋白质孵育

[0187]

[0188]

[0189]