技术领域
[0001] 本发明属于微生物基因改造技术领域，具体涉及一种酵母起始转录因子突变蛋白及其衍生产物在生产工业乙醇中的应用。
相关背景技术
[0002] 在生物乙醇发酵过程中，常常会出现高乙醇浓度、高糖、高温、低pH和有毒副产物等高胁迫环境，严重抑制会导致发酵提前终止。因此，获得对高胁迫环境耐受性提高的酵母菌种，可提高生产效率，节约成本。尤其是在超高浓度乙醇发酵过程和纤维素乙醇生产过程中更为重要，是现代乙醇工业生产中的一项核心工作。目前酿酒酵母菌株的选育主要有自然选育、适应性驯化、诱变育种及基因工程等方法。酵母菌在发酵后期，乙醇成为主要的胁迫因素。随着基因组，转录组等多组学的研究表明乙醇耐受性受多基因和网络化的复杂调控，可能发生表达水平变化的基因数量可到上百或上千。乙醇耐性分子机制的复杂性意味着单基因或代谢途径改造难以获得高乙醇耐受性的表型。因此对细胞整体代谢网络的改造的技术手段显得尤为重要。
[0003] 利用全局转录机制工程(Global transcription machinery engineering，gTME)技术改造全局转录调控因子的方法，利用定向进化技术对转录因子进行随机突变和定向筛选、实现对基因转录水平的精细调节，可实现对代谢网络的适度调控，使细胞代谢网络实现平衡进化，并使细胞在整体水平上提高酒精产率或提高耐逆性等性状，是酵母菌代谢工程改造的研究方向。转录因子spt15是TATA结合蛋白，TATA结合蛋白作为第一个与DNA结合的复合物蛋白，在预起始复合物的组装与转录的过程中起着非常重要的作用。与RNA聚合酶Ⅱ及十几种基本的转录因子结合后，可以直接转录基因组中绝大多数相关基因mRNA。然而通过定点突变转录因子spt15使得到的突变蛋白作用的基因结果并不明确，目前通过突变转录因子spt15获得耐高浓度乙醇、耐高温、耐高渗性、耐高乙酸含量突变蛋白的报道十分有限，这无疑阻碍了工业乙醇的生产。
具体实施方式
[0035] 本发明提供了一种酵母起始转录因子突变蛋白、所述酵母起始转录因子突变蛋白的编码基因或包含所述编码基因的基因改造产物在工业生产乙醇中的应用；所述酵母起始转录因子突变蛋白为酵母起始转录因子spt15的第127位赖氨酸突变为以下一种氨基酸残基：甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸。
[0036] 在本发明中，所述酵母起始转录因子spt15的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1[0037]
[0038] 所示。当突变为甘氨酸时，酵母spt15突变基因优选为spt15‑G，氨基酸序列如SEQ ID NO:2(MADEERLKEFKEANKIVFDPNTRQVWENQNRDGTKPATTFQSEEDIKRAAPESEKDTSATSGIVPTLQNIVATVTLGCRLDLKTVALHARNAEYNPKRFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVVTGAGSEDDSKLASRKYARIIQKIGFAAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEPELFPGLIYRMVKPKIVLLIFVSGKIVLTGAKQREEIYQAFEAIYPVLSEFRKM)所示。当突变为谷氨酰胺时，酵母spt15突变基因优选为spt15‑Q，氨基酸序列如SEQ ID NO:3
[0039]
[0040] 所示。当突变为丝氨酸时，酵母spt15突变基因优选为spt15‑S，氨基酸序列如SEQ ID NO:4
[0041]
[0042] 所示。当突变为异亮氨酸时，酵母spt15突变基因优选为spt15‑I，氨基酸序列如SEQ ID NO:5
[0043]
[0044] 所示；当突变为天冬氨酸时，酵母spt15突变基因优选为spt15‑D，氨基酸序列如SEQ ID NO:6(MADEERLKEFKEANKIVFDPNTRQVWENQNRDGTKPATTFQSEEDIKRAAPESEKDTSATSGIVPTLQNIVATVTLGCRLDLKTVALHARNAEYNPKRFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVVTGADSEDDSKLASRKYARIIQKIGFAAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEPELFPGLIYRMVKPKIVLLIFVSGKIVLTGAKQREEIYQAFEAIYPVLSEFRKM)所示。
[0045] 在本发明中，所述酵母起始转录因子突变蛋白的编码基因为酵母spt15突变基因，是在酵母spt15基因的基础上379～381位碱基发生突变。所述酵母spt15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7
[0046] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAAAAAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。当突变为编码甘氨酸的密码子时，密码子突变为GGG，对应的编码基因spt15‑G的核苷酸序列如SEQ ID NO:16[0047] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAGGGAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。当突变为编码谷氨酰胺的密码子时，密码子突变为CAG，对应的编码基因spt15‑Q的核苷酸序列如SEQ ID NO:17[0048] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGTTTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCACAGAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。当突变为编码丝氨酸的密码子时，密码子突变为TCA，对应的编码基因spt15‑S的核苷酸序列如SEQ ID NO:18[0049] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGT TTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCATCAAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。当突变为编码异亮氨酸的密码子时，密码子突变为ATT，对应的编码基因spt15‑I的核苷酸序列如SEQ ID NO:19[0050] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGT TTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAATTAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。当突变为编码天冬氨酸的密码子时，密码子突变为GAT，对应的编码基因spt15‑D的核苷酸序列如SEQ ID NO:20[0051] (ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTAAAGAGGCAAACAAGATAGTGT TTGATCCAAATACCAGACAAGTATGGGAAAACCAGAATCGAGATGGTACAAAACCAGCAACTACTTTCCAGAGTGAAGAGGACATAAAAAGAGCTGCCCCAGAATCTGAAAAAGACACCTCCGCCACATCAGGTATTGTTCCAACACTACAAAACATTGTGGCAACTGTGACTTTGGGGTGCAGGTTAGATCTGAAAACAGTTGCGCTACATGCCCGTAATGCAGAATATAACCCCAAGCGTTTTGCTGCTGTCATCATGCGTATTAGAGAGCCAAAAACTACAGCTTTAATTTTTGCCTCAGGGAAAATGGTTGTTACCGGTGCAGATAGTGAGGATGACTCAAAGCTGGCCAGTAGAAAATATGCAAGAATTATCCAAAAAATCGGGTTTGCTGCTAAATTCACAGACTTCAAAATACAAAATATTGTCGGTTCGTGTGACGTTAAATTCCCTATACGTCTAGAAGGGTTAGCATTCAGTCATGGTACTTTCTCCTCCTATGAGCCAGAATTGTTTCCTGGTTTGATCTATAGAATGGTGAAGCCGAAAATTGTGTTGTTAATTTTTGTTTCAGGAAAGATTGTTCTTACTGGTGCAAAGCAAAGGGAAGAAATTTACCAAGCTTTTGAAGCTATATACCCTGTGCTAAGTGAATTTAGAAAAATGTGA)所示。
[0052] 在本发明中，所述酵母spt15突变基因的突变方法，优选以酵母的基因组DNA为模板，扩增酵母spt15基因；将所述酵母spt15基因利用饱和位点突变引物对进行突变扩增，得到PCR产物；对所述PCR产物进行检测，筛选编码甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、异亮氨酸和天冬氨酸中一种氨基酸残基的突变基因。
[0053] 在本发明中，所述扩增酵母spt15基因用引物优选为核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的反向引物。得到酵母spt15基因后，优选将扩增的酵母spt15基因克隆到载体上制备重组载体，将所述重组载体转化大肠杆菌中扩繁，提取重组载体。所述载体优选为pMD18‑T。得到提取的重组载体后，优选将酵母spt15基因克隆到酵母表达载体中，得到重组表达酵母载体。所述酵母表达载体优选为pYES2NTc。所述将酵母spt15基因克隆到酵母表达载体时，扩增酵母spt15基因的引物优选为Spt15_yes2nt(SEQ ID NO:10)和Spt15_yes2ntR(SEQ ID NO:11)。所述饱和位点突变引物对优选为Spt15_mutF(SEQ ID NO:12)和Spt15_mutR(SEQ ID NO:13)。所述突变扩增的反应条件优选为：94℃50sec，62℃45sec，72℃7min(30个循环)；72℃延伸10min。所述筛选的方法优选为测序筛选，根据测序结果选择含目标突变基因的重组载体。
[0054] 在本发明中，所述包含所述编码基因的基因改造产物优选包括包含所述编码基因的重组载体、包含所述编码基因的重组酵母菌株或包含所述重组载体的重组酵母菌株。所述包含编码基因的重组载体为包含所述酵母spt15突变基因的重组载体。所述重组载体的骨架载体优选为原核表达载体和/或真核表达载体。所述原核表达载体优选包括pMD18‑T，用于所述酵母spt15突变基因的快速扩增。所述真核表达载体优选包括pYES2NTc，用于介导酵母spt15突变基因进入酵母细胞中表达。所述重组载体的构建方法同上述记载，在此不做赘述。所述包含编码基因的重组酵母菌株优选为包含所述酵母spt15突变基因或所述重组载体的重组酵母菌株。所述重组酵母菌株的宿主细胞优选包括酿酒酵母。所述酿酒酵母的菌株为INVSC1。
[0055] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因优选为spt15‑G和/或spt15‑Q时，所述重组酵母菌株工业生产乙醇过程中，发酵体系中乙酸的浓度优选为5～6g/L，更优选为5.5～6g/L。在本发明一个实施例中，INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q可以耐受浓度为6g/L的乙酸，在乙酸浓度为6g/L的条件下生长良好，而INVSC1‑Neo对照菌株在乙酸浓度为6g/L的条件下不能生长，OD值基本无变化。在培养基加乙酸浓度为6g/L的条件下，培养48h时INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q的乙酸耐受性分别是INVSC1‑Neo的3.64倍和4.79倍，其中INVSC1‑spt15‑Q对乙酸的耐受性比INVSC1‑spt15‑G略高。
[0056] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因优选为spt15‑G和/或spt15‑S时，所述重组酵母菌株工业生产乙醇过程中，发酵体系中氯化钠的浓度优选为优选为8％～9％，最优选为8.5％～9％。在本发明一个实施例中，对照菌株INVSC1‑Neo在大于7％的条件下无法生长，突变重组菌株在NaCl质量分数为7％的培养基中均能生长，当接种到NaCl质量分数为9％的培养基中时，只有INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S两个菌株可以生长。在培养基加NaCl质量分数为9％的条件下，培养48h时，重组菌株INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S对NaCl的耐受性分别是INVSC1‑Neo对照菌株的1.16倍和1.75倍。
[0057] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因优选为spt15‑I和/或spt15‑S时，所述重组酵母菌株工业生产乙醇过程中，发酵温度为41℃～43℃。在本发明一个实施例中，对照菌INVSC1‑Neo的耐高温条件为41℃。以培养温度41℃为标准，依次提高培养温度，只有INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M两个菌株可以在培养温度为43℃的条件下生长，而其它菌株在此条件下则无法生长。在发酵培养基温度为42℃的条件下，INVSC1‑spt15‑I的耐受性分别是对照菌株INVSC1‑Neo的1.58倍。
[0058] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因优选为spt15‑G、spt15‑S和/或spt15‑D时，所述重组酵母菌株工业生产乙醇过程中，发酵体系中乙醇的浓度优选为14％～16％，更优选为15％～16％。在本发明一个实施例中，对照菌可以在乙醇体积分数为14％的培养基中生长。当接种到乙醇体积分数为16％的培养基中，只有重组菌株INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S和INVSC1‑spt15‑D菌株可以生长，说明只有这三个菌株获得了一定的乙醇耐性。在培养基加体积分数为16％乙醇的条件下，培养48h时，INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D的乙醇的耐受性分别是INVSC1‑Neo对照组的2.76倍、4.17倍和3.08倍。按耐受性由高到低排列菌株依次为：INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D、INVSC1‑spt15‑G。
[0059] 本发明提供了酵母起始转录因子突变蛋白、所述酵母起始转录因子突变蛋白的编码基因或包含所述编码基因的重组载体在提高酵母对发酵环境耐受性中的应用。
[0060] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因为spt15‑G和/或spt15‑Q时，所述酵母spt15突变基因或所述重组载体优选在提高酵母对乙酸耐受性中的应用；所述乙酸的耐受浓度为5～6g/L，更优选为5.5～6g/L。
[0061] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因为spt15‑G和/或spt15‑S时，所述酵母spt15突变基因或所述重组载体优选在提高酵母对氯化钠耐受性中的应用；所述氯化钠的耐受质量浓度为8％～9％，最优选为8.5％～9％。
[0062] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因为spt15‑I和/或spt15‑S时，所述酵母spt15突变基因或所述重组载体优选在提高酵母对发酵温度耐受性中的应用；所述发酵温度优选为41～43℃，更优选为42～43℃。
[0063] 在本发明中，当所述酵母spt15突变基因为spt15‑G、spt15‑S和/或spt15‑D时，所述酵母spt15突变基因或所述重组载体优选在提高酵母对乙醇耐受性中的应用。所述乙醇的耐受体积浓度为14％～16％，更优选为15％～16％。
[0064] 下面结合实施例对本发明提供的一种酵母起始转录因子突变蛋白及其衍生产物在生产工业乙醇中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0065] 实施例1
[0066] 一种酵母spt15突变基因的突变方法
[0067] 1.spt15基因的克隆方法
[0068] 用Spt15‑F/Spt15‑R引物对酿酒酵母起始转录因子spt15基因进行PCR扩增。PCR循环参数为:94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环。
[0069] PCR扩增用引物具体序列如下：
[0070] Spt15‑F：5'‑ATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGGAGTTTA‑3'(SEQ ID NO:8)；
[0071] Spt15‑R5'‑TCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACAGGGTATATAG‑3'(SEQ ID NO:9)。
[0072] 将PCR扩增后的spt15基因进行凝胶电泳分离，将分离后得到的产物放置的琼脂块中，放入1.5mL的离心管中。回收目的片段用超薄琼脂糖凝胶回收试剂盒，操作按说明书中方法进行。将回收后的spt15基因的PCR产物pMD18‑T载体连接，连接反应体系放置于16℃连接过夜，连接产物置于4℃待转化，氯化钙法将连接液转化到大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，提取单克隆质粒。最后将E.coli DH5α细胞转化产物涂布于含有Amp100μg/ml、X‑Gal40μg/ml的LB平板，接种于培养基后，提取质粒。
[0073] 2.pYES2NTc‑spt15质粒的构建方法
[0074] 经测序得到正确的spt15基因序列后，使用Spt15_yes2nt和Spt15_yes2ntR进行PCR扩增pMD18‑spt15质粒上的spt15基因。
[0075] Spt15_yes2ntF：5'‑GGATCCGCCGATGAGGAACGTTTA‑3'(SEQ ID NO:10)；
[0076] Spt15_yes2ntR：5'‑GCGGCCGCTCACATTTTTCTAAATTCAC‑3'(SEQ ID NO:11)。其中，PCR循环参数为:94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环。
[0077] 用凝胶回收spt15基因及经NotⅠ、BamHⅠ双酶切并回收后的pYES2NTc线性载体，凝胶试剂盒操作步骤如说明书记载，连接spt15基因片段与pYES2NTc线性载体，10μL连接反应体系如下：T4 DNA ligase溶液1μL、T4 DNA ligase Buffer溶液1μL、spt15片段4μL、pYES2NTc线性载体4μL。连接spt15与pYES2NTc质粒载体，将其放置于16℃的条件下连接过夜，其中连接产物于4℃的条件下待转化，氯化钙法转化，将连接液转化到大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，在37℃的培养箱中倒置，培养16h，能够生长的菌落即为阳性克隆。全局转录因子定向进化法构建重组酿酒酵母菌株
[0078] 挑取在平板中已进行转化的E.coli DH5α菌落，将选取的菌落接种于4ml的LB液体培养基中，然后提取质粒。所得的质粒用NotⅠ，BamHⅠ双酶切进行验证定点饱和突变基因库的获得。
[0079] 3.确定突变位点
[0080] 收集整理了不同酵母种属的spt15核心转录因子基因50余个，进行分子进化和蛋白三维结构及保守区域的生物信息学分析。通过研究发现，同一种属的基因差异较小，同源性很高，不同种属有不同的差异性。通过spt15序列的同源比对和三维结构分析，如图1所示，结果发现Lys127位点位于对称结构的中间结合部位，此位点的突变可能影响spt15与目标物的结合，因此本研究设计该位点为突变位点。
[0081] 4.重叠延伸PCR
[0082] 根据重叠延伸PCR(overlap extensionPCR)原理，设计一对突变引物Spt15_mutF和Spt15_mutR。
[0083] Spt15_mutF：5'‑ATGGTTGTTACCGGTGCAnnkAGTGAGGATGACTC A‑3'(SEQ ID NO:12)；
[0084] Spt15 mutR：5'‑TGCACCGGTAACAACCATTTTCCCTGAGGCATTAA AGC‑3'(SEQ ID NO:13)。
[0085] 首先，以重组质粒pYES2NTc‑spt15为模板，使用引物Spt15_mutF和Spt15_mutR进行质粒扩增，PCR反应条件为：94℃50sec，62℃45sec，72℃7min(30个循环)，最后，72℃延伸10min，反向扩增得到包含载体序列和基因序列的线性片段。
[0086] 5.定点饱和突变基因库的获得
[0087] 经过DpnⅠ酶消化模板后，用超薄琼脂糖凝胶回收PCR产物。采用MBI公司的T4 DNA连接酶连接，10μL连接反应体系如下：T4 DNA ligase溶液1μL、T4 DNA ligase Buffer溶液1μL、spt15突变片段7μL、pYES2NTc线性载体1μL。转化大肠杆菌E.coliDH5α，转化后E.coliDH5α涂布LB(含Amp100μg/ml)培养基。转化平板的菌落接种于5ml(含Amp100μg/ml)的LB液体培养基，然后提取质粒。同时送于英韦创津测定序列，测序鉴定是否为突变基因。
[0088] 6.重组酿酒酵母获得
[0089] 将经测序后得到的定点饱和突变基因库的重组质粒、pYES2NTc‑spt15分别利用电击法转化入酿酒酵母INVSC1中，转化方法如下：
[0090] ①将待转入的酿酒酵母菌株INVSC1活化，然后接种于YPD培养基中，以30℃、250rpm的速度培养16h。
[0091] ②将菌种再次接种于于250ml的新鲜的YPD培养基，30℃、160rpm的速度培养16h(OD6001.2～1.5)。
[0092] ③将培养后的菌液放于冰上15min，保证其不再生长。收集上清液，在4℃的条件下以最高转的速度离心5min。将培养液倒入试管中，倒出时将管倒置1min，确保培养液全部流出。
[0093] ④将已放置灭菌锅中灭菌的蒸馏水重悬菌体，以最大的转速离心1min左右即可。
[0094] ⑤重复上一步的操作，再次重悬菌体，4℃、4000rpm离心5min。
[0095] ⑥用20ml冰预冷的D‑山梨醇(1M)重悬菌体。在4℃、4000rpm的条件下离心5min。
[0096] ⑦加入600μL冰预冷的D‑山梨醇(1M)再次重悬菌体，充分混匀，放在冰上，供当天用。
[0097] ⑧吸取合适量的感受态菌体，与5μL的质粒充分混合，然后放入电转杯中，最后进行冰浴5min。
[0098] ⑨选择酵母参数，点击Pulse转化。
[0099] ⑩将转化后的混合液立即加入当天制作好的600μL冰预冷的D‑山梨醇(1M)，将混合物倒入1.5ml离心管中。30℃静置1～2h。取500μL转化后的菌液涂布于G418100μg/ml、D‑山梨醇(1M)的YPD培养基，于30℃在培养箱倒置培养3天。将电击后的酿酒酵母进行质粒提取。含有定点饱和突变基因库重组质粒、pYES2NTc‑spt15质粒的重组菌株使用缺少尿嘧啶的筛选培养基筛选转化子，得到所需的重组酿酒酵母菌株。
[0100] 7.对照重组菌株的构建
[0101] 运用基因组提取试剂盒，提取酿酒酵母S.cerevisiae INVSC1基因组。
[0102] 根据己知的G418标记基因序列编号设计引物G418‑R、G418‑F，参照已知的酶切图谱，正向引物加入酶切位点，向引物加入NotⅠ酶切位点，引物如下：G418‑F5'‑CGGCTCCAGCCGCGCCAGATTAGC‑3'(SEQ ID NO:14)
[0103] G418‑R 5'‑CCCATATGAGCTCGTTTTCGACACTGGA‑3'(SEQ ID NO:15)。
[0104] 按照pYES2NTc‑spt15质粒的重组菌株构建方法进行对照菌株的构建。对照重组菌株采用PCR的方法进行鉴定，以G418‑F和G418‑R引物扩增G418标记基因。
[0105] 结果
[0106] 1.目标基因的克隆及重组质粒的构建
[0107] 以S.cerevisiae INVSC1的基因组DNA为模板，利用设计的引物进行PCR反应，PCR产物电泳检测在0.75kb左右有一明显条带(图2)，与预计的目的片段大小相符合，无特异性产物。将PCR产物经纯化回收后的spt15基因和克隆载体pMD18‑T连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，利用蓝白斑筛选出阳性转化子pMD18‑spt15，PCR产物电泳检测在3kb左右有一明显条带(图2)，质粒测序结果表明得到的spt15序列正确，测定报告显示扩增片段为spt15基因片段，和基因库中基因序列同源性100％(GenBank基因编号M29459.1，蛋白质编号AAA34458.1)。
[0108] 在质粒pMD18‑spt15上经PCR扩增，经NotⅠ/BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化。回收后的spt15基因与经NotⅠ/BamHⅠ双酶切并回收后的pYES2NTc线性载体连接，经过PCR和酶切验证获得重组质粒pYES2NTc‑spt15，验证结果如图2所示，表明表达载体pYES2NTc‑spt15构建正确。
[0109] 2.定点饱和基因突变库及重组酿酒酵母的获得
[0110] 以重组质粒pYES2NTc‑spt15为模板，进行反向重叠延伸PCR，经过DpnⅠ酶消化、回收后自连接，然后转化进大肠杆菌E.coli DH5α中，用卡那霉素抗性平板筛选转化子。通过易错PCR对spt15基因进行随机突变，NotⅠ/BamHⅠ双酶切对所有制粒进行验证，表明突变的基因spt15已克隆到载体pYES2NTc上。测序后，基因序列与原酿酒酵母spt15基因序列的比对结果显示，在第127位赖氨酸共获得12个不同的点突变，其他位点未发生突变。12个点突变结果见表1。
[0111] 将含有野生型spt15及G418抗性标记基因及突变的spt15基因重组质粒，利用电击法转化入酿酒酵母INVSC1中。使用缺少尿嘧啶的筛选培养基筛选转化子，得到一系列重组酿酒酵母菌株。因为重组质粒pYES2NTc‑G418只有抗性标记基因，没有其他外源基因，所以该酵母菌株做为对照菌株，为INVSC1‑Neo，携带pYES2NTc‑spt15和pYES2NTc‑spt3质粒的酵母因分别多了野生型spt15的基因编码区，能过量表达spt15基因，命名为INVSC1‑spt15菌株。spt15突变基因按序号分别命名为系列重组酿酒酵母INVSC1‑spt15‑X，其中X为F、V、R、M、L、G、T、S、Q、D、N、I(见表1)。
[0112] 表1定点饱和突变位点密码子和氨基酸
[0113]
[0114]
[0115] 实施例2
[0116] 重组酿酒酵母耐性筛选方法
[0117] 1.耐乙酸重组酵母菌株的筛选
[0118] 设置乙酸浓度梯度分别为4g/L、5g/L、6g/L、8g/L，首先将YPD培养基高温灭菌，冷却至50℃左右时，按照设置梯度添加一定量的乙酸。然后将对照组菌株分别划线接种至上述梯度平板中，将平板倒置，在30℃的条件下在培养箱生长，培养2d，观察生长情况。判断菌株在培养箱中的生长情况，对照菌株在含乙酸的平板上不能生长的浓度即为最高耐乙酸浓度。以此浓度为标准，制作平板，将重组后的菌株分别划线接种至平板中，30℃培养2d，筛选能在此浓度平板中生长的重组菌株。依次提高乙酸浓度，直到筛选出最高耐乙酸浓度的重组菌株。将筛选到的耐乙酸重组菌株和对照菌株在YPD斜面上活化培养后，分别接种至种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度，使接种量保持一致，接种至含乙酸(耐乙酸最高浓度)和不含乙酸的100mL发酵培养基中，30℃下200r/min培养，在发酵过程中，每隔一段时间取一定的发酵液，将其稀释后用分光光度计在600nm下测定其OD值，比较其生长情况，与含有空载体的对照菌株相比，在耐乙酸最高浓度的发酵培养基中生长良好的为乙酸耐性提高的突变体。实验做三次，每次保证条件一样，所有结果都具有可重复性。
[0119] 2.耐高渗重组酵母菌株的筛选
[0120] 设置NaCl的梯度为6％、7％、8％，根据设计梯度在YPD培养基中添加一定量的NaCl，培养基进行高温灭菌后，将对照组菌株分别划线接种至上述四个梯度平板中，将不同梯度的平板倒置至培养箱中培养，温度设置为30℃，在此条件使菌株生长2d，观察菌株在平板上的生长情况。根据不同梯度平板中的生长情况，对照菌株不能在NaCl平板中生长的浓度即为耐NaClhhi最高浓度。以此浓度为标准，制作平板，将重组后的菌株分别划线接种至平板中，30℃培养2d，筛选能在此浓度平板中生长的菌株。依次提高NaCl浓度，直到筛选出最高耐NaCl浓度的重组菌株。将筛选到的耐NaCl重组菌株和对照菌株在YPD斜面上活化培养后，分别接种于种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度，使接种量保持一致，接种至含NaCl(耐NaCl最高浓度)和不含NaCl的100mL发酵培养基中，30℃、200r/min的条件下发酵48h，在发酵过程中，每隔一段时间取一定的发酵液，将其稀释后用分光光度计在600nm下测定其OD值，比较其生长情况，与含有空载体的对照菌株相比，在耐NaCl最高浓度的发酵培养基中生长良好的为高渗耐性提高的突变体。
[0121] 3.耐高温重组酵母菌株的筛选
[0122] 将对照组菌株划线接种于高温灭菌后的YPD培养中，然后将培养基分别放置于温度为37℃、40℃、42℃的培养箱中培养2d，观察其生长情况。根据菌株在不同温度的培养箱中的生长情况，在培养箱中不能生长的最高温度即为最高耐性温度。以此温度为标准，将重组后的菌株分别划线接种至平板中，依次提高培养箱温度，直到筛选出最高耐高温温度的重组菌株。将筛选到的耐高温重组菌株和对照菌株在YPD斜面上活化培养后，分别接种于种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度，使接种量保持一致，接种至含100mL发酵培养基中，在其耐最高温度和30℃条件下，以200r/min的速度发酵48h，在不同温度的发酵条件下，每隔一定的时间取定量的发酵液，将取出的发酵液稀释后，分别用分光光度计在600nm下测定其OD值，比较各菌株在不同条件下的生长情况，与含有空载体的对照菌株相比，在耐最高温度的的发酵培养基中生长良好的为温度耐性提高的突变体。
[0123] 4.耐乙醇重组酵母菌株的筛选
[0124] 设置添加乙醇的梯度为13％、15％、17％，将YPD培养基高温灭菌后，待其冷却至常温时添加一定量的乙醇，分别制作平板，将对照组菌株分别划线接种至上述三个梯度平板中，将含有不同乙醇梯度的平板倒置至培养箱中，于30℃的条件下培养2d，观察其生长情况。根据菌株在不同乙醇梯度平板中的生长情况，确定对照菌株的耐乙醇最高浓度。以此浓度为标准，制作平板，将重组后的菌株分别划线接种至平板中，30℃培养2d，筛选能在此浓度平板中生长的重组菌株。依次提高乙醇浓度，直到筛选出最高耐乙醇浓度的重组菌株。将筛选到的耐乙醇重组菌株和对照菌株在YPD斜面上活化培养后，分别接种于种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度，使接种量保持一致，接种至耐乙醇最高体积分数和不含乙醇的100mL发酵培养基中，30℃、200r/min的条件下发酵48h，在发酵过程中，每隔一段时间取一定的发酵液，将其稀释后用分光光度计在600nm下测定其OD值，与含有空载体的对照菌株相比，在耐乙醇最高体积分数的发酵培养基中生长良好的为乙醇耐性提高的突变体。
[0125] 结果
[0126] 1.耐乙酸重组酵母菌株的筛选
[0127] 1.1耐乙酸重组菌株初筛
[0128] 将对照菌株分别接种到乙酸浓度为4，5，6，7g/L的YPD培养基中，检测其乙酸耐性。结果如图3中A所示，对照菌株INVSC1‑Neo可以在含量为5g/L的培养基中生长，但当平板中乙酸含量大于6g/L时，对照菌株基本不能生长，说明对照菌株INVSC1‑Neo耐乙酸的最高浓度是5g/L。突变重组菌株在含量为5g/L的培养基中均能生长，但当接种到乙酸含量为6g/L的培养基中时，如图3中B所示，只有INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q两个菌株可以生长，其它重组酵母菌株及重组酵母菌株均不能生长。因此实验表明这两个菌株获得了一定的乙酸耐性，可耐受的最高乙酸浓度为6g/L。
[0129] 1.2耐乙酸重组菌株复筛
[0130] 将平板筛选到的INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q及INVSC1‑Neo对照菌株接种于种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度，使接种量保持一致，分别接种至乙酸浓度为6g/L和不含乙酸的培养基中培养，用分光光度计在600nm的条件下测定其OD值。
[0131] 结果如表2所示。从表中可以看出，重组菌株INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q及对照菌株INVSC1‑Neo的OD值在对数期的增长最明显，各菌株在不同的生长条件下增长情况不一致
[0132] 表2重组菌株在含乙酸培养基中的OD值
[0133]
[0134]
[0135] 根据测定结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得出耐乙酸重组酵母菌株的耐性生长曲线，如图4所示。
[0136] 酵母菌在乙酸胁迫下的耐性生长曲线表明，INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q可以耐受浓度为6g/L的乙酸，在乙酸浓度为6g/L的条件下生长良好，而INVSC1‑Neo对照菌株在乙酸浓度为6g/L的条件下不能生长，OD值基本无变化，这与平板初筛结果的结果是一致的。INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑Q及INVSC1‑Neo对照菌株在未加酸的条件下的生长情况明显优于加酸的条件。从图4中可以看出，在培养基加乙酸浓度为6g/L的条件下，培养48h时INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q的乙酸耐受性分别是INVSC1‑Neo的3.64倍和4.79倍，其中INVSC1‑spt15‑Q对乙酸的耐受性比INVSC1‑spt15‑G略高。说明INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q在乙酸浓度为6g/L的条件下获得了一定的耐性。因此，通过初筛和复筛，最终选取INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑Q两个重组菌株，耐乙酸的最高浓度是6g/L。
[0137] 2耐高渗(NaCl)重组酵母菌株的筛选
[0138] 2.1耐高渗(NaCl)重组菌株初筛
[0139] 将对照菌株分别接种到NaCl含量为6％、7％、8％、9％的培养基中，检测其氯化钠耐性。如图5中A所示，对照菌株INVSC1‑Neo可以在NaCl质量分数为7％的培养中生长，但此时对照菌株INVSC1‑Neo划线尾部已基本没有菌落，在NaCl质量分数大于7％的条件下无法生长，表明对照菌株INVSC1‑Neo耐氯化钠的的最高浓度是7％。突变重组菌株在NaCl质量分数为7％的培养基中均能生长，当接种到NaCl质量分数为9％的培养基中时，如图5中B所示，只有INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S两个菌株可以生长，其它重组酵母菌株及对照菌株均不能生长，因此实验表明这两个菌株获得了一定的高渗耐性，可耐受质量分数为9％的NaCl。
[0140] 2.2耐高渗(NaCl)重组菌株复筛
[0141] 将平板筛选到的INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S及INVSC1‑Neo对照组菌株接种于种子培养基中，30℃、200r/min过夜培养。调节菌液浓度,使接种量保持一致，分别接种至NaCl质量分数为9％和不含NaCl的发酵培养基中培养，按一定的时间取样，测定其在600nm条件下的OD值。
[0142] 结果如表3所示。从表3中可以看出，INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S及INVSC1‑Neo对照菌株在NaCl质量分数为0和9％YPD培养基中OD值不一致，重组菌株的OD值在对数期差别最大。
[0143] 表3重组菌株在含NaCl培养基中的OD值
[0144]
[0145]
[0146] 根据测定结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得出耐高渗重组酵母菌株的耐性生长曲线图，如图6所示。
[0147] 重组酵母菌在NaCl胁迫下的耐性生长曲线(图6)可以看出，重组菌株INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S在氯化钠质量分数为9％的培养基中生长良好，可以耐受9％质量分数的氯化钠，在此条件下其生长情况明显优于INVSC1‑Neo对照菌株的生长情况。该结果与平板初筛的结果无差异，均为INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S可在氯化钠质量分数为9％的条件下生长。从图3‑5中可以看出，在培养基加NaCl质量分数为9％的条件下，培养48h时，重组菌株INVSC1‑spt15‑G和INVSC1‑spt15‑S对NaCl的耐受性分别是INVSC1‑Neo对照菌株的1.16倍和1.75倍。INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S及INVSC1‑Neo对照菌株在未加NaCl的条件下的生长情况优于加NaCl的条件，说明重组菌株INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S在氯化钠质量分数为9％的条件下，获得一定的耐性。
[0148] 3.耐高温重组酵母菌株的筛选
[0149] 3.1耐高温重组酵母菌株初筛
[0150] 将对照菌株开始在35℃的条件下培养，依次增加温度梯度，直到培养温度为41℃时，如图7中A所示，对照菌INVSC1‑Neo能在此条件下生长，但当培养箱温度大于41℃时则不能生长，因此确定对照菌INVSC1‑Neo的耐高温条件为41℃。以培养温度41℃为标准，依次提高培养温度，如图7中B所示，只有INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M两个菌株可以在培养温度为43℃的条件下生长，而其它菌株在此条件下则无法生长。因此实验表明重组菌株中耐温能力最强的是INVSC1‑spt15‑I，最高耐受温度为43℃，超过此温度则无法生长。通过平板初筛，得到INVSC1‑spt15‑I两个耐高温的重组酵母菌株，可耐受的最高温度是43℃。
[0151] 3.2耐高温重组酵母菌株复筛
[0152] 将平板筛选到的INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M及对照组菌株INVSC1‑Neo接种于种子培养基中，在30℃、200r/min的条件下过夜培养。测定其在不同温度下发酵培养的OD值，结果显示INVSC1‑spt15‑I、INVSC1‑spt15‑M及对照菌株INVSC1‑Neo的OD值在培养条件分为43℃的条件下无差异，与平板筛选的结果不同。说明在发酵培养基温度为43℃时，与对照菌株INVSC1‑NeoI相比，INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M没有显示出耐高温的优越性。
[0153] 其它条件不变，将培养条件分别设置为42℃和30℃，以200r/min的转速在发酵培养基中培养。
[0154] 结果如表4所示，从表4中可以看出，INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M及对照菌株INVSC1‑Neo在温度为30℃和42℃培养基中OD值均随着时间的增加在增长，但增长情况有明显差异，尤其在对数期差异最明显。
[0155] 表4重组菌株在不同温度培养基中的OD值
[0156]
[0157]
[0158] 根据测定结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得出耐高温重组酵母菌株的耐性生长曲线图，如图8所示。
[0159] 重组酵母菌在高温胁迫下的耐性生长曲线(图8)中可以看出，在温度为30℃的YPD培养基中，INVSC1‑spt15‑I、INVSC1‑spt15‑M及对照菌株INVSC1‑Neo的生长情况明显优于温度为42℃的培养基，其生长情况无明显差异。图8中显示重组菌株INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M可以耐受42℃的高温，即重组菌株INVSC1‑spt15‑I、INVSC1‑spt15‑M可以在此条件中生长，而对照菌株INVSC1‑Neo在42℃的高温的条件下则不能生长。图8中显示在发酵培养基温度为42℃的条件下，INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M的耐受性分别是对照菌株INVSC1‑Neo的1.58倍和1.45倍。通过初筛和复筛实验，最后选取的耐高温重组菌株INVSC1‑spt15‑I和INVSC1‑spt15‑M，可耐受的最高温度是42℃。
[0160] 4耐乙醇重组酵母菌株的筛选
[0161] 4.1耐乙醇重组酵母菌株初筛
[0162] 将对照菌株INVSC1‑Neo分别接种到乙醇体积分数为12％、14％、16％的YPD培养基中，检测其乙醇耐性，结果表明仅14％、16％浓度的乙醇组各菌株的生长呈明显的差异。如图9中A所示，对照菌可以在乙醇体积分数为14％的培养基中生长。当接种到乙醇体积分数为16％的培养基中，如图9中B和C所示，只有重组菌株INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S和INVSC1‑spt15‑D菌株可以生长，因此该实验表明只有这三个菌株获得了一定的乙醇耐性。
[0163] 4.2耐乙醇重组酵母菌株复筛
[0164] 将平板筛选到的经种子培养后，分别接种至乙醇体积分数为16％和不含乙醇的发酵培养基中培养，用分光光度计测定其OD值，结果如表5所示。从表5中可以看出，INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D和INVSC1‑Neo在乙醇体积分数为0和16％YPD培养基中的OD值随着时间的增加在增长，但是增长情况有差异，尤其在对数期差异最明显。
[0165] 表5重组菌株在含乙醇培养基中的OD值
[0166]
[0167] 根据测定结果，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，得出耐乙醇重组酵母菌株的耐性生长曲线图，如图10所示。
[0168] 从重组酵母菌在乙醇胁迫下的耐性生长曲线(图10)可以看出，重组菌株INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D可以耐受体积分数为16％的乙醇，在培养基加体积分数为16％乙醇的条件下，培养48h时，INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D的乙醇的耐受性分别是INVSC1‑Neo对照组的2.76倍、4.17倍和3.08倍。按耐受性由高到低排列菌株依次为：INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D、INVSC1‑spt15‑G。从耐性曲线中更能明显看出INVSC1‑spt15‑G、INVSC1‑spt15‑S、INVSC1‑spt15‑D在高体积分数的乙醇培养基中生长情况明显低于未加乙醇培养基的生长情况。
[0169] 利用基因工程手段得到酿酒酵母的spt15定点饱和突变基因，并连接到表达载体pYES2NTc上，构建突变库。对其进行测序后一共得到了12个单点突变基因，将含有12个点突变基因与野生型基因spt15，spt3及对照基因Neo基因的重组质粒分别用电击法转入酿酒酵母INVSC1中，得到15个重组的酿酒酵母菌株。
[0170] 通过对重组酵母菌株在耐乙酸、耐高渗、耐高温、耐乙醇条件下的初筛和复筛，获得spt15‑G和spt15‑Q两个突变基因，可以提高酵母对乙酸的抗逆性；获得spt15‑G和spt15‑S两个突变基因，可以提高酵母对氯化钠的抗逆性；获得spt15‑I和spt15‑M两个突变基因，可以提高酵母对高温的抗逆性；获得spt15‑G、spt15‑S和spt15‑D三个突变基因，可以提高酿酒酵母对乙醇的抗逆性。
[0171] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
