[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种能够锚定解脂耶氏酵母的大肠杆菌及其应用方法。

[0002] 赤藓糖醇是一种白色、无臭、不吸湿、热稳定的结晶性粉末，赤藓糖醇入口清凉，且具有低热量、非致龋、抗氧化、保护内皮等优势，因此其被广泛应用于多种食品，如烘焙食品、发酵牛奶、糖果和巧克力等。真菌和细菌均能合成赤藓糖醇，目前赤藓糖醇的生产菌种主要是解脂耶氏酵母。鉴于赤藓糖醇重要的应用价值和巨大的市场需求，选育高产、低成本、遗传稳定性好的生产菌株已成为该行业的关键目标，但目前尚无高效的赤藓糖醇生产菌株高通量选育方法，因此选育发酵性能优良的赤藓糖醇生产菌株仍是一项富有意义的工作。

[0003] 生物传感器是一组微生物体内广泛存在的响应系统，用于识别并响应细胞内特定的代谢物，并将其转化为特定的响应信号，如荧光。转录调控因子在各类生物传感器中为最主要的一类，它可以响应细胞内特定代谢物的浓度，并控制响应信号蛋白的表达。当转录因子被诱导后，响应信号蛋白产生的响应信号与代谢物浓度呈正相关，常用的响应信号蛋白是荧光蛋白，利用荧光作为响应信号的主要优势是可以通过荧光激活细胞分选进而实现细胞水平的高通量筛选，这在分析大量突变酶或突变菌方面大大提高了效率。目前生物传感器已被广泛用于胞内代谢产物的定性与定量分析，也被应用于工业生产中的化学物质检测。

[0004] 为了进一步提高传感器的响应效率，酵母细胞表面工程中酵母细胞具有将启动子转换为信号的能力。基于酵母自身优势，酵母表面展示系统被认为是安全、高效、具有应用价值的系统。酵母细胞展示技术的一个重要任务是研究一种高效的锚定蛋白，它要求细胞生产大量锚定蛋白的同时还能在细胞表面高效显示，从而为目标蛋白与底物的结合提供更多的空间。在酵母细胞中锚定蛋白与细胞连接方式存在两种类型，一种为蛋白与细胞壁非共价衔接，另一种为蛋白与细胞壁共价衔接。共价型衔接细胞壁的锚定蛋白依据其衔接形式，可划分为GPI型和Pir型；非共价连接的细胞壁蛋白主要为Flo1p的N端絮凝系统。GPI型锚定蛋白在细胞表面展示异源蛋白的表达中起着重要作用，对酵母展示技术的研究是必不可少的。GPI型锚定蛋白融合方式分为N‑末端融合与C‑末端融合，具备代表性的则为α‑凝集素和a‑凝集素。酵母细胞中GPI锚定蛋白的糖脂部分与疏水性蛋白的C‑末端连接，以确保膜与蛋白稳定结合。融合蛋白完成后，蛋白前体物质被锚定在内质网中，其余蛋白留在内质网腔内。最终通过锚定蛋白的作用将具有一定功能的蛋白固定在细胞表面，酿酒酵母作为酵母细胞表面显示平台的优质酵母，已在展示各种酶中得到应用。新的锚定蛋白的挖掘已成为研究热点，Vaart开发了许多细胞壁蛋白，如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p，Sed1p，Ycr89w，Tirl等，这些蛋白被证实可作为N端显示平台的连接蛋白。Yang等人研究了新的表面展示系统，包括Dan4p，Sed1p，Pry3p，Tos6p，Cwp2p，Srp2p和α‑凝集素，并研究了这些展示系统的显示效率，结果发现Aga1p和Dan4p更适合固定较大的蛋白质。目前，在噬菌体和细菌展示系统构建生物传感器的研究较多，而在酵母中的研究相对较少。比如在大肠杆菌中展示谷氨酸脱氢酶构建生物传感器，通过与碳纳米材料组装成正负电极，实现对酶的浓度的检测。

[0005] 中国专利文献CN 111996132 A(申请号202010708696.9)发明提供了一种解脂耶氏酵母细胞表面展示方法，涉及生物化工技术领域，以解脂耶氏酵母菌为底盘细胞，以pYCSD为载体，使用XPR2 pre分泌信号肽引导目的蛋白质向胞外分泌，使用解脂耶氏酵母内源的YlCWP1(110)作为细胞表面锚定信号，使用柔性连接肽(G4S)2连接目的基因和YlCWP1(110)，从而减少对目的蛋白表达和折叠的影响。将目的基因克隆到pYCSD的克隆位点，转化解脂耶氏酵母，实现目的蛋白在解脂耶氏酵母细胞的表面展示。

[0006] 中国专利文献CN 117737066 A(申请号202311769795.8)发明提供了一种转录调控序列及其应用，该转录调控序列是对现有技术中所公开的转录调控序列进行突变获得，相比于现有技术，采用突变后的转录调控序列所制备的重组大肠杆菌能够在筛选赤藓糖醇生产菌株的过程中有效降低背景荧光强度，且荧光响应信号是现有技术的6.5倍，显著提高了赤藓糖醇生产菌株的筛选效率。

[0007] 研究开发一种能够快速检测赤藓糖醇浓度并且能够高效筛选赤藓糖醇生产菌株的锚定蛋白基因工程菌。

[0057] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

[0058] 本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。

[0059] 生物材料来源：

[0060] 锚定蛋白agα1基因：来源于酿酒酵母(Brewer's yeast)，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

[0061] 锚定蛋白egt2基因：来源于酿酒酵母(Brewer's yeast)，核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

[0062] 锚定蛋白cwp2基因：来源于酿酒酵母(Brewer's yeast)，核苷酸序列为SEQ ID NO.3，该序列中含有乳糖操纵子序列。

[0063] 锚定蛋白dan4基因：来源于酿酒酵母(Brewer's yeast)，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

[0064] 锚定蛋白sed1基因：来源于酿酒酵母(Brewer's yeast)，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

[0065] 锚定蛋白cwp2基因氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

[0066] 冰核蛋白INP基因氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

[0067] E.coli BL21(DE3)细胞，于Vazyme购买。

[0068] 解脂耶氏酵母Y.lipolytica 5‑14为Yarrowia lipolytica(CICC1457)。

[0069] 实施例中涉及的培养基：

[0070] LB液体培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。

[0071] LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上加入20g/L的琼脂。

[0072] YPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。

[0073] YPD固体培养基：在YPD液体培养基的基础上加入20g/L的琼脂。

[0074] 发酵培养基：葡萄糖300g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。

[0075] 实施例1：锚定蛋白载体的构建

[0076] 锚定蛋白荧光表达载体pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan4的合成：

[0077] 中国专利文献CN 117737066 A(申请号202311769795.8)中公开了转录调控序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码阻遏蛋白的基因序列如SEQ ID NO.10所示；编码荧光蛋白的标记基因序列如SEQ ID NO.11；包含所述基因的重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12。本申请中将该质粒载体命名为“pET‑22b(+)‑eryD”。

[0078] 锚定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4或sed1的核苷酸序列、冰核蛋白INP的核苷酸序列由基因合成获得。

[0079] 来源于酿酒酵母的5种锚定蛋白agα1、egt2、cwp2、dan4、sed1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，锚定蛋白基因sed1、agα1、egt2、cwp2或dan4与冰核蛋白INP核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，进行融合表达均插入到核苷酸序列SEQ ID NO.12的SalⅠ和BamHI酶切位点间，使用FastDigest SalⅠ、FastDigest BamHI对其进行双酶切，去磷酸化后，使用T4 DNALigase分别与sed1、agα1、egt2、cwp2或dan4与INP的融合基因片段连接；构建锚定蛋白荧光表达载体pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan4的结构示意图如图1，图2，图3，图4，图5所示。

[0080] cwp2与INP的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0081] 实施例2：锚定蛋白荧光表达菌株的构建

[0082] (1)重组质粒的转化

[0083] ①取重组质粒pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan410μL，分别加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

[0084] ②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min；

[0085] ③将上述感受态细胞接入到500μL LB培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；

[0086] ④取上述菌液200μL，将大肠杆菌菌液涂布于带有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的LB固体培养基；

[0087] ⑤固体培养基于37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12‑16h。

[0088] (2)阳性克隆的鉴定：

[0089] 菌落PCR鉴定

[0090] 挑取上述培养出的单菌落，将大肠杆菌接种至1mL含有100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6‑8h，吸取2μL菌液，按照50μL PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆。

[0091] 通过菌落PCR分别验证pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2、pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan4质粒上的sed1、agα1、egt2、cwp2、dan4基因，本实验所有设计的引物序列如表1所示，其中，PCR扩增sed1、agα1、egt2、cwp2、dan4基因的产物琼脂糖凝胶电泳图如图6，7，8所示：

[0092] 表1：引物序列

[0093]

[0094] 最终构建得到锚定蛋白荧光表达菌株：

[0095] 即为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1、E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1、E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2、E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2、E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan4。

[0096] 实施例3：锚定蛋白荧光表达菌株的细胞表面展示

[0097] (1)菌种活化：将实施例2构建的锚定蛋白荧光表达菌株以1％的接种量接种至50mL含有100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h，将解脂耶氏酵母Y.lipolytica 5‑14于30℃、200r/min的摇床中摇瓶培养24h；

[0098] (2)菌体转接：取上述锚定蛋白荧光表达菌株活化菌株菌液1mL接入50mL含有100μg/mL氨苄霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为0.8，加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5mM，37℃、200rpm培养12h，获得发酵液，解脂耶氏酵母Y.lipolytica5‑14再以10％(v/v)的接种量转接至含50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，继续放于30℃、200r/min的振荡培养箱中摇瓶发酵12小时，获得发酵液；

[0099] (3)收集菌液：别取1mL大肠杆菌重组菌株的发酵液与1mL Y.lipolytica的发酵液在30℃共培养12h，在显微镜观察并比较5种重组大肠杆菌细胞表面展示的效果；

[0100] 解脂耶氏酵母表面的糖脂能与重组大肠杆菌表达的锚定蛋白形成共价连接，通过在显微镜下观察发现，锚定蛋白sed1、agα1、egt2、cwp2和dan4成功将重组大肠杆菌锚定在解脂耶氏酵母细胞表面上，如图9‑13所示，且锚定蛋白cwp2的锚定效率最高。

[0101] 图9为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑sed1在Y.lipolytica上的锚定效果。

[0102] 图10为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑agα1在Y.lipolytica上的锚定效果。

[0103] 图11为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑egt2在Y.lipolytica上的锚定效果。

[0104] 图12为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2在Y.lipolytica上的锚定效果。

[0105] 图13为E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑dan4在Y.lipolytica上的锚定效果。

[0106] 实施例4：利用重组大肠杆菌作为生物传感器来检测赤藓糖醇浓度

[0107] 将大肠杆菌作为生物传感器，E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2于37℃、200r/min的摇床中培养24h后，作为种子液以10％(v/v)的接种量接种至分别含有浓度为
0mmol/L和500mmol/L的赤藓糖醇的0.5mg/mL IPTG的LB液体培养基中，于37℃、200r/min的摇床中培养24小时，发酵过程中每12h通过酶标仪检测一次发酵液中的荧光强度。图14表示大肠杆菌生物传感器E.coli BL21/pET‑22b(+)‑eryD‑INP‑cwp2在24h时表现出背景荧光强度低，在添加赤藓糖醇的情况下，其荧光强度更强，赤藓糖醇的浓度响应信号是原始菌株的
10.5倍。

[0108] 实施例5：利用重组大肠杆菌作为生物传感器来筛选解脂耶氏酵母高产赤藓糖醇突变菌

[0109] 将解脂耶氏酵母于在紫外下照射120s，接种于YPD液体培养基中，放于30℃、200r/min的振荡培养箱中培养24h，再以10％(v/v)的接种量转接到解脂耶氏酵母发酵培养基中，继续放在30℃、200r/min的摇床中发酵培养12小时，获得解脂耶氏酵母的发酵液。获得解脂耶氏酵母突变菌液；

[0110] 将实施例4中未添加赤藓糖醇制备的重组大肠杆菌发酵液与解脂耶氏酵母稀释后的发酵液按照1：10比例混合均匀，采用微流控细胞培养及分选系统对形成的微液滴进行培养48h，检测微液滴的荧光强度，分选荧光强度提高的菌株。将荧光强的突变菌接种至YPD固体平板，在30℃恒温培养箱中培养2d。用无菌接种环挑取两个不同形状的突变菌，接种至YPD液体培养基中，30℃、200r/min的条件下培养24h，将其作为种子液接种至发酵培养基，3
在100m的发酵罐中30℃发酵75h，用HPLC检测赤藓糖醇产量。图15展示了解脂耶氏酵母突
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变菌Y.lipolytica 5‑14‑E6在100m 的发酵罐中发酵产赤藓糖醇的发酵结果，发酵75h时，工程菌突变菌株Y.lipolytica 5‑14‑E6的赤藓糖醇产量为178g/L。

[0111] 本发明提供的大肠杆菌基因工程菌，能够用于快速检测赤藓糖醇浓度，也能够用于筛选解脂耶氏酵母高产赤藓糖醇的菌株。