技术领域
[0001] 本发明涉及一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体I33L/S213G/N214D(简称差向异构酶突变体I33L/S213G/N214D)及其应用，属于酶工程技术领域。
相关背景技术
[0002] D‑阿洛酮糖(D‑psicose)是自然界中含量极少的一种六碳糖，D‑阿洛酮糖是一种低能量、不消化的食糖替代品，其具有降低血糖的功效，目前被国外许多制药企业当做甜味添加剂使用。此外，因D‑阿洛酮糖可以通过美拉德反应使得食物具有较好的持水性，在食品领域用处广泛。D‑阿洛酮糖还具有：(1)降低血糖，可作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；(2)降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积；(3)抗氧化活性，具有很强的活性氧(ROS)清除能力及谷胱甘肽还原能力；(4)神经保护和抗炎作用等。
[0003] D‑阿洛酮糖是果糖的C‑3位置的差向异构体，而D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(D‑allulose‑3‑epimerase，DAEase)是一类能将果糖进行C‑3位置差向异构化生产D‑阿洛酮糖的酶，目前大约有20多种DAEase。目前多数研究针对酶的单方面性能(如耐热或耐碱)的研究，而对转化率的研究很少。
[0004] 中国专利文献CN 106148311 A(申请号：201610818847.X)公开一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，以来源于Burkholderia sp.MR1的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶为模板，至少为以下突变中的一个：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。该发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点。
[0005] 中国专利文献CN 108239633 A(申请号：201611217802.3)公开了一种催化活性得到提高的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，野生型D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶来自于类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)，其突变包括以下至少3个位点发生突变：第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。
[0006] 中国专利文献CN 110438112 A(申请号：201910757830.1)公开了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，该D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶来自集胞藻属(Synechocystis)，其突变体所发生突变的氨基酸的突变位点为第39位的I突变为A，可选的突变位点还包括如下任意一个：第158位的Q突变为S，第186位的L突变为V。
[0007] 现有技术中的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体的催化活性有一定的提高，但是提高幅度有限；针对不同来源的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶进行基因工程改造，以获得性质更加优良的突变体，仍然具有重大研究意义和实际应用价值。
具体实施方式
[0028] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
[0029] 实施例中D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶原始酶的来源：
[0030] D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，其NCBI检索号为WP_010974125，DPEase的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
[0031] 载体pET‑20b(+)由齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室提供，本领域技术人可以根据现有技术构建，也可由该重点实验室购买获得，也可购买现有市售产品；大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)购于诺唯赞生物科技股份有限公司。
[0032] 实施例1
[0033] 含有突变体基因的重组质粒构建
[0034] 以含有D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase编码基因的重组质粒pET‑20b(+)‑DPEase(由金斯瑞公司合成)为模板，进行反向PCR扩增，对D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase的第33位异亮氨酸(I)，第213位丝氨酸(S)，第214位氨基酸(N)对应的密码子进行NNK突变；
[0035] 所述反向PCR扩增的引物序列如下：
[0036] DPEase‑33‑F:5’‑GAAAGTTGCAAAGCTGGGTTTTGATATCNNKGAAGTGGCTGCGCA TCAC‑3’SEQ ID NO.5；
[0037] DPEase‑33‑R:5’‑GATATCAAAACCCAGCTTTGCAACTTTCTCGATATACGGACCGAAC TTC‑3’SEQ ID NO.6。
[0038] DPEase‑213‑F:5’‑CTGGGTCACTTTCACACCGGCGAANNKGACCGCCGTGTTCCGGG TAAAG‑3’SEQ ID NO.7；
[0039] DPEase‑213‑R:5’‑TTCGCCGGTGTGAAAGTGACCCAGCAGTGGGCCCGCCGTTCTAA TC‑3’SEQ ID NO.8。
[0040] DPEase‑214‑F:5’‑CACTTTCACACCGGCGAACCGNNKCGCCGTGTTCCGGGTAAAG‑3’[0041] SEQ ID NO.9；
[0042] DPEase‑214‑R:5’‑CGGTTCGCCGGTGTGAAAGTGACCCAGCAGTGGGCCCGCCGTTC‑3’SEQ ID NO.10。
[0043] 所述反向PCR扩增的反应体系见表1：
[0044] 表1.反向PCR扩增的反应体系
[0045]
[0046] 所述反向PCR扩增的程序如下：
[0047] 95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
[0048] 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度约为4500bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物‑20℃保存，备用；
[0049] 将制得的胶回收产物进行纯化和消解，由于pET‑20b(+)质粒来源于具有Dam甲基化修饰功能的大肠杆菌中，可以被DpnI酶切碎，而含有突变位点的质粒不具有甲基化所以不被DpnI酶切碎，经过DpnI酶消解处理后制得含有突变体基因的重组质粒库pET‑20b(+)‑DPEase‑I33NNK/S213NNK/N214NNK；
[0050] 所述的消解体系见表2：
[0051] 表2.胶回收产物的消解体系
[0052]
[0053] 所述的消解程序如下：
[0054] 37℃反应120min，75℃15min，4℃保存；
[0055] 琼脂糖凝胶电泳检验消解产物，长度约为4500bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物‑20℃保存，备用。
[0056] 实施例2
[0057] 制备大肠杆菌感受态细胞
[0058] (i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜；
[0059] (ii)吸取0.1mL培养的菌液至10mL的LB液体培养基中，200r/min、37℃培养至OD600达0.6～0.8；
[0060] (iii)吸取1mL OD600达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；
[0061] (iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成大肠杆菌感受态细胞；
[0062] (v)将制备好的大肠杆菌感受态细胞分装100μL每管，‑80℃保存，备用。
[0063] 实施例3
[0064] 重组大肠杆菌BL21(DE3)的制备
[0065] 首先利用核酸超微量分光光度计测定质粒pET‑20b(+)‑DPEase‑I33NNK/S213NNK/N214NNK浓度，达到300μg/mL浓度后，采用化学转化法转化到实施例2制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到的细胞使用复苏培养基37℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性重组菌落。
[0066] 其中，复苏培养基每升组分如下：
[0067] 蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，余量水。
[0068] 阳性重组菌的培养及鉴定：
[0069] 挑取上述阳性重组菌落，接种到含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，培养完成后，交由上海生物工程有限公司进行测序验证。测序正确后，得到重组大肠杆菌。
[0070] 经测序验证，对突变成功的菌株进行保存，保存的菌株包括33位点、213位点、214位点突变为另外54种氨基酸的菌株，进行后续转化率筛选，获得最佳突变体。
[0071] 实施例4
[0072] 突变体转化率测试
[0073] 将实施例3制备的含有质粒pET‑20b(+)‑DPEase‑I33NNK/S213NNK/N214NNK的重组大肠杆菌(54种)接种至含5mL液体LB培养基的20mL试管中(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中，200r/min、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至含
30mL发酵培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，糊精20g/L，余量水)的100mL三角瓶中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超
2+
声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入pH8.0、终浓度为2mmol/L Mn 、300g/L的果糖溶液中，在
55‑70℃条件下水浴反应20h，通过高效液相色谱进行D‑阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D‑阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
[0074] 结果见图1，与原始酶DPEase(在温度为55℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％；在温度为60℃、pH为8.0，最高转化率为17.1％；在温度为65℃、pH为8.0，最高转化率为13.4％)相比，突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑I33L/S213G/N214D的转化率最高，最适条件下的最高转化率达到了40.4％，与原始酶DPEase相比提高了7.5％。同时得到的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑I33L/S213P/N214C的转化率为23.9％、DPEase‑I33L/S213P/N214M的转化率为26.9％、DPEase‑I33L/S213P/N214S转化率为24.6％、DPEase‑I33L/S213E/N214D的转化率为25.9％、DPEase‑I33L/S213P/N214D的转化率为11.4％、DPEase‑I33L/S213D/N214D的转化率为17.5％、DPEase‑I33L/S213A/N214D的转化率为9.2％，其余的三突变体转化率均小于10％，低于原始酶DPEase的转化率水平。
[0075] 上述筛选到的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑I33L/S213G/N214D的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0076] 实施例5
[0077] 突变体DPEase‑I33L/S213G/N214D最适温度和温度稳定性测定
[0078] (1)最适反应温度测定
[0079] 吸取5mL实施例4制备的DPEase‑I33L/S213G/N214D粗酶液，加入到5mL 200g/L的2+
果糖溶液中(果糖终浓度为100g/L，Mn 终浓度为2mmol/L，使用KOH调节pH＝8)。使用温度计校准45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃水浴锅，每个温度下三个平行样品。在上述水浴锅中反应1h后立即沸水浴10min确保酶失活不再进行反应。通过高效液相色谱进行D‑阿洛酮糖和果糖浓度检测，计算D‑阿洛酮糖转化率，以最适反应温度下的转化率作为相对转化率100％。
[0080] 结果见图2，原始酶DPEase的最适反应温度均为55℃，突变体DPEase‑I33L/S213G/N214D的最适反应温度为65℃。
[0081] (2)温度稳定性测定
[0082] 将5mL实施例4制备的DPEase‑I33L/S213G/N214D粗酶液分别放置在50℃、60℃、70℃、80℃下进行孵育，每个温度下同时放置21管样品，在20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min时分别在不同的孵育温度中取出三管酶液，加入5mL 200g/L的果糖
2+
溶液中(果糖终浓度为100g/L，Mn 浓度为2mmol/L，使用KOH调节pH＝8)，在55℃水浴锅中反应1h后立即沸水浴10min确保酶失活不再进行反应。通过高效液相色谱进行D‑阿洛酮糖和果糖浓度检测，计算残余酶活，其中，在50℃、pH 8下，每分钟D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶生成1μmol D‑阿洛酮糖的量定义为1个酶活单位。以粗酶液不孵育直接加入果糖溶液反应测得的酶活作为相对酶活100％计算残余酶活。
[0083] 结果见图3，突变体DPEase‑I33L/S213G/N214D较原始酶DPEase，在较高温度下的温度稳定性有明显提高。此外，分析不同pH下D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的活性，发现突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑I33L/S213G/N214D在酸性条件下(pH 5.0)的耐受性较原始酶提高了5％。
[0084] 对比例1
[0085] 对D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase第244位氨基酸(E)对应的密码子进行NNK突变：
[0086] 以重组质粒pET‑20b(+)‑DPEase为模板，进行反向PCR扩增，按照实施例1的方法，制备得到含有突变体基因的重组质粒库pET‑20b(+)‑DPEase‑244NNK；
[0087] 所述反向PCR扩增的引物序列如下：
[0088] F1‑1:5’‑CGCAGTGATTATGNNKCCGTTTGTGAAGACTGGTGG‑3’SEQ ID NO.11；
[0089] R1‑1:5’‑TAGTTAATATCACGCAGGGCCAGACCG‑3’SEQ ID NO.12。
[0090] 参照实施例3的方法，制备含有质粒pET‑20b(+)‑DPEase‑244NNK的重组大肠杆菌，并参照实施例4的方法，将上述重组大肠菌接种至5mL液体LB培养基中，200rpm、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至发酵培养基中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入到pH8.0、终浓度为300g/L的果糖溶液中，在55℃条件下水浴反应，每4h取一次样共取5次，通过高效液相色谱进行D‑阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D‑阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
[0091] 结果见图4，与原始酶DPEase(在温度为55℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％)相比，突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑244NNK的最高转化率达到了20％，低于原始酶DPEase。
[0092] 对比例2
[0093] 对D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase第150位氨基酸(E)对应的密码子进行NNK突变：
[0094] 以重组质粒pET‑20b(+)‑DPEase为模板，进行反向PCR扩增，按照实施例1的方法，制备得到含有突变体基因的重组质粒库pET‑20b(+)‑DPEase‑150NNK；
[0095] 所述反向PCR扩增的引物序列如下：
[0096] F1‑2:5’‑CAACCTGTGTATTNNKGTGCTCAATCGCTTCGAAAA‑3’SEQ ID NO.13；
[0097] R1‑2:5’‑AGATCATTGGCGAAATCCG‑3’SEQ ID NO.14。
[0098] 参照实施例3的方法，制备含有质粒pET‑20b(+)‑DPEase‑150NNK的重组大肠杆菌，并参照实施例4的方法，将上述重组大肠菌接种至5mL液体LB培养基中，200rpm、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至发酵培养基中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入到pH8.0、终浓度为300g/L的果糖溶液中，在55℃条件下水浴反应，每4h取一次样共取5次，通过高效液相色谱进行D‑阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D‑阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
[0099] 结果见图5，与原始酶DPEase(在温度为55℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％)相比，突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑150NNK的最高转化率达到了25％，低于原始酶DPEase。
[0100] 综上，对比例1中D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑244NNK与对比例2中D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑150NNK是分别选取了D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase的第244氨基酸和第150个氨基酸来进行NNK突变，但得到的突变体对于D‑阿洛酮糖的转化率均低于原始酶DPEase。此外，第213氨基酸突变为天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)或者脯氨酸(P)，同时保留I33L/N214D突变，得到的突变体转化率也远低于原始酶DPEase。
[0101] 本发明所保护的‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体DPEase‑I33L/S213G/N214D是对原始酶DPEase的第33个氨基酸进行突变，由原始的异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，213个氨基酸进行突变，由原始的丝氨酸(S)突变为甘氨酸(G)，第214个氨基酸进行突变，由原始的天冬酰胺(N)突变成天冬氨酸(D)，突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体‑I33L/S213G/N214D与原始酶DPEase相比，D‑阿洛酮糖在最适条件下的转化率提高了7.5％。此外，突变后的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体的耐热性和耐酸性均有显著提升，突变体‑I33L/S213G/N214D最适催化温度由原始酶DPEase的55℃提高至65℃，在酸性条件下(pH5.0)的耐受性提高了5％。
[0102] 序列表
[0103] SEQ ID NO.1原始酶DPEase的氨基酸序列
[0104] MKHGIYYSYWEHEWSAKFGPYIEKVAKLGFDIIEVAAHHINEYSDAELATIRKSAKDNGIILT[0105] AGIGPSKTKNLSSEDAAVRAAGKAFFERTLSNVAKLDIHTIGGALHSYWPIDYSQPVDKAG[0106] DYARGVEGINGIADFANDLGINLCIEVLNRFENHVLNTAAEGVAFVKDVGKNNVKVMLDT[0107] FHMNIEEDSFGDAIRTAGPLLGHFHTGESNRRVPGKGRMPWHEIGLALRDINYTGAVIMEPF[0108] VKTGGTIGSDIKVWRDLSGGADIAKMDEDARNALAFSRFVLGGSEQ ID NO.2原始酶DPEase的核苷酸序列
[0109] ATGAAACACGGAATATACTATTCATATTGGGAGCACGAATGGTCAGCGAAGTTCGGTCCG[0110] TATATCGAGAAAGTTGCAAAGCTGGGTTTTGATATCATCGAAGTGGCTGCGCATCACATT[0111] AACGAGTACTCCGACGCGGAGCTGGCTACCATCCGCAAAAGCGCTAAAGATAACGGCAT
[0112] CATCCTGACCGCTGGCATCGGCCCGTCGAAAACCAAAAACCTGTCTAGCGAGGACGCT
[0113] GCGGTGCGTGCAGCGGGGAAAGCGTTCTTTGAGCGCACCCTGAGTAATGTCGCCAAGC
[0114] TGGACATCCACACGATTGGCGGAGCCTTACATAGCTATTGGCCTATTGACTACTCTCAGC[0115] CGGTTGATAAAGCAGGCGACTACGCACGTGGTGTTGAAGGTATCAACGGTATCGCGGAT
[0116] TTCGCCAATGATCTGGGCATCAACCTGTGTATTGAGGTGCTCAATCGCTTCGAAAATCAT[0117] GTTCTTAACACCGCTGCGGAAGGCGTTGCGTTCGTCAAGGACGTTGGTAAGAACAACG
[0118] TGAAGGTCATGCTGGACACGTTTCACATGAATATTGAGGAAGACAGCTTTGGTGACGCG
[0119] ATTAGAACGGCGGGCCCACTGCTGGGTCACTTTCACACCGGCGAATCAAACCGCCGTGT
[0120] TCCGGGTAAAGGTCGTATGCCGTGGCATGAGATCGGTCTGGCCCTGCGTGATATTAACTA[0121] TACCGGCGCAGTGATTATGGAACCGTTTGTGAAGACTGGTGGCACCATTGGTTCCGATAT[0122] TAAAGTGTGGCGTGACTTGAGCGGTGGTGCGGATATCGCCAAGATGGATGAAGACGCCC
[0123] GTAATGCATTGGCGTTCAGCCGTTTCGTGTTGGGCGGTTAASEQ ID NO.3突变酶DPEase‑I33L/S213G/N214D的氨基酸序列
[0124] MKHGIYYSYWEHEWSAKFGPYIEKVAKLGFDILEVAAHHINEYSDAELATIRKSAKDNGIIL[0125] TAGIGPSKTKNLSSEDAAVRAAGKAFFERTLSNVAKLDIHTIGGALHSYWPIDYSQPVDKAG[0126] DYARGVEGINGIADFANDLGINLCIEVLNRFENHVLNTAAEGVAFVKDVGKNNVKVMLDT[0127] FHMNIEEDSFGDAIRTAGPLLGHFHTGEGDRRVPGKGRMPWHEIGLALRDINYTGAVIMEPF[0128] VKTGGTIGSDIKVWRDLSGGADIAKMDEDARNALAFSRFVLGGSEQ ID NO.4突变酶DPEase‑I33L/S213G/N214D的核苷酸序列
[0129] ATGAAACACGGAATATACTATTCATATTGGGAGCACGAATGGTCAGCGAAGTTCGGTCCG[0130] TATATCGAGAAAGTTGCAAAGCTGGGTTTTGATATCTTGGAAGTGGCTGCGCATCACATT[0131] AACGAGTACTCCGACGCGGAGCTGGCTACCATCCGCAAAAGCGCTAAAGATAACGGCAT
[0132] CATCCTGACCGCTGGCATCGGCCCGTCGAAAACCAAAAACCTGTCTAGCGAGGACGCT
[0133] GCGGTGCGTGCAGCGGGGAAAGCGTTCTTTGAGCGCACCCTGAGTAATGTCGCCAAGC
[0134] TGGACATCCACACGATTGGCGGAGCCTTACATAGCTATTGGCCTATTGACTACTCTCAGC[0135] CGGTTGATAAAGCAGGCGACTACGCACGTGGTGTTGAAGGTATCAACGGTATCGCGGAT
[0136] TTCGCCAATGATCTGGGCATCAACCTGTGTATTGAGGTGCTCAATCGCTTCGAAAATCAT[0137] GTTCTTAACACCGCTGCGGAAGGCGTTGCGTTCGTCAAGGACGTTGGTAAGAACAACG
[0138] TGAAGGTCATGCTGGACACGTTTCACATGAATATTGAGGAAGACAGCTTTGGTGACGCG
[0139] ATTAGAACGGCGGGCCCACTGCTGGGTCACTTTCACACCGGCGAAGGTGACCGCCGTG
[0140] TTCCGGGTAAAGGTCGTATGCCGTGGCATGAGATCGGTCTGGCCCTGCGTGATATTAACT[0141] ATACCGGCGCAGTGATTATGGAACCGTTTGTGAAGACTGGTGGCACCATTGGTTCCGATA[0142] TTAAAGTGTGGCGTGACTTGAGCGGTGGTGCGGATATCGCCAAGATGGATGAAGACGCC
[0143] CGTAATGCATTGGCGTTCAGCCGTTTCGTGTTGGGCGGTTAA。
