[0001] 本发明涉及微生物学技术领域，特别涉及一株库德里阿兹威毕赤酵母菌及其应用。

[0002] 微生物已被用作前景广阔的细胞工厂，用于将木质纤维素、粗甘油等各种低成本基质生物转化为高价值的生物产品。然而，在工业生物工艺过程中，细胞工厂通常需要抵御复杂的环境压力，如有毒抑制剂和溶剂(原料预处理带来的)，以及酸、渗透压、温度、氧化等物理因素，这些因素对微生物的生长有显著的负面影响，并抑制代谢产物的产生。此外，与原核生物相比酵母细胞作为一种理想的真核生物底盘具有诸多优点：(1)酵母细胞具有完整的细胞器结构，尤其是过氧化物酶体，可以作为细胞区室化改造靶点；(2)酵母细胞具有完备的蛋白折叠、修饰以及分泌功能，并且不会产生包涵体；(3)酵母细胞对极端pH条件具有一定的耐受性；(4)可以实现高密度生长,发酵过程不受噬菌体威胁。

[0003] 甲醇作为一种非食品性可再生的一碳原料，与传统的糖基原料相比较，具有很高的还原度，能够为产物生物合成提供更多驱动力，是一种优质生物炼制原料，可作为碳源生产包括长链醇、有机酸和碳氢化合物在内的高附加值的化学物质。此外，甲醇还具有低成本、普遍性、不占用耕地等优势，在生物技术领域的应用前景受到了越来越多的关注。甲基营养酵母是一类能够利用甲醇或其他单碳化合物(如甲醛、甲酸、甲烷等)作为碳源和能源的酵母。目前，天然甲基营养酵母包括主要三大类：毕赤酵母属如被广泛用于生物技术领域的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、汉逊酵母属如多形汉逊酵母(Ogataea polymorpha)以及假丝酵母属如甲醇假丝酵母(Candida methanolica)。Wickersham,L.J.等人从变质的佛罗里达橙汁筛选出的多形汉逊酵母NCYC 495，已经被改造成工程菌株能够利用甲醇作为唯一碳源生产脂肪酸、多种蛋白类化合物以及乙醇等大宗化学品，多形汉逊酵母NCYC 495作为微生物细胞工厂具有很大的应用潜力。

[0004] 综上所述，木质纤维素因其成本低、可再生性好和环保性好等优点而被广泛应用于微生物发酵，但仍然存在许多瓶颈，如在木质纤维素预处理过程中出现的抑制剂所引起的毒性和水解酶的高成本。甲醇作为一种非食品性可再生的一碳原料，与传统的糖基原料相比较，具有很高的还原度，能够为产物生物合成提供更多驱动力，是一种优质生物炼制原料，可作为碳源生产包括长链醇、有机酸和碳氢化合物在内的高附加值的化学物质。但是，目前国内的研究主要集中在通过合成生物学等手段改造模式生物如酿酒酵母等成为能够利用甲醇作为唯一碳源的合成甲基营养酵母，而对天然甲基营养酵母的研究较少。因此，目前仍然迫切需要探索利用更低成本的生物发酵工艺原料(甲醇)的甲基营养酵母且具有高鲁棒性。

[0028] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0029] 本发明从新疆阿勒泰地区福海县周边牧场采集的驼奶中筛选、分离得到一株耐甲醇的菌株，经过26SDNA鉴定属于库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)，菌株命名为Pichia kudriavzevii 3‑1‑20。所述菌株不仅能耐受15％的甲醇浓度，还能耐受12％的乙醇浓度、5％的乙酸浓度、12％的氯化钠浓度，以及在28‑47℃、pH2‑9时能够正常生长。所述菌株可以生产乙醇，并且在37℃下，乙醇产量达到了9.608g/L。所述菌株可为高鲁棒性酵母细胞工厂的构建，合成甲基营养酵母的构建以及抗逆原件的开发利用提供菌种资源。

[0030] 本发明实施例所用培养基如下：

[0031] 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)：葡萄糖20.0g，蛋白胨20.0g，酵母浸出粉10.0g，pH6.0，蒸馏水定容至1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃高压灭菌20min。

[0032] 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)：蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH6.0，蒸馏水定容至1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃高压灭菌
20min。

[0033] 基础矿物质无机盐琼脂培养基(MSM)：硫酸铵5g、氯化钙0.1g、氯化钾0.15g、硫酸镁0.2g、硫酸亚铁0.001g、硫酸锌0.001g、硫酸锰0.001g，琼脂15.0g，pH6.0，蒸馏水定容至1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，115℃高压灭菌20min，冷却后加入经过0.22μm的滤膜除菌后的维生素溶液2.2mL以及甲醇50mL或100mL。

[0034] 本发明实施例中所述的库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)，2024年03月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2024481，地址在湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室。

[0035] 实施例1

[0036] 1.筛选驼奶

[0037] 本发明选自新疆阿勒泰地区福海县周边牧场生产的驼奶。供试的驼奶为牧民采用传统发酵法发酵的手工驼奶，采集后倒入灭菌蓝盖瓶中置于冰盒保存，当天带回实验室分别放入4℃和‑80℃冰箱保存备用。

[0038] 2.菌株的富集

[0039] 将驼奶样品以5％的接种量加入到经灭菌驼乳中，置于37℃恒温培养箱至发酵终点，后转至4℃冰箱中，后熟24h，将富集后的样品按照5％(v/v)的接种量接种到YPD液体培养基中，进行第二次富集，置于30℃摇床培养箱中200r/min条件下培养48h至菌液出现明显浑浊。

[0040] 3.酵母菌株的分离纯化

[0041] 利用15×150mm的试管将富集的菌液用pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液稀释，选择合‑2 ‑7适的稀释梯度(10 ‑10 )在YPD琼脂培养基(添加100μg/ml氨苄青霉素)上涂布，将涂布后的培养皿放在30℃培养箱恒温培养48h。挑取每个YPD琼脂培养基中颜色、形态、大小、质地和边缘不同的单菌落，在YPD琼脂培养基上继续划线纯化，反复纯化3次，直至菌落形态无差异，共筛选出酵母菌株96株，将纯化好的酵母菌斜面保存备用。

[0042] 4.耐甲醇菌株筛选

[0043] 将分离纯化得到的96株酵母菌株接种到YPD液体培养基中，培养3天后，取5μL培养液接种到含不同甲醇浓度为唯一碳源的MSM琼脂培养基中；其中，含甲醇MSM培养基中的甲醇浓度以5％(v/v)的梯度进行递增，筛选出耐甲醇强度较高菌株为止。

[0044] 通过不同甲醇浓度共筛选得到4株耐甲醇菌株，在含不同甲醇浓度的MSM琼脂培养基中的生长情况如表1所示。

[0045] 表1菌株在不同甲醇含量浓度下的生长状况

[0046]

[0047]

[0048] 注：+表示生长；‑表示不生长

[0049] 从表1可知，菌株2‑8‑15、3‑1‑20、3‑4‑3和3‑4‑6最高耐受甲醇含量分别为10％、15％、10％和10％。其中，菌株3‑1‑20对甲醇的耐受性最强。

[0050] 5.耐甲醇菌株形态观察

[0051] 对耐甲醇酵母菌株的菌落形态、液体培养特征进行观察，并且对菌体的细胞形态结构进行描述。

[0052] 纯化后的耐甲醇菌株3‑1‑20，于30℃培养24h后，菌株的形态如图1所示，耐甲醇菌株3‑1‑20菌落呈白色(表面粉末状)，干燥，椭圆形，凸起，1‑3mm，边缘光滑，菌落质地黏稠、易挑取。

[0053] 耐甲醇菌株3‑1‑20在YPD液体培养基培养24h后，扫描电镜下形态特征如图2所示，耐甲醇菌株3‑1‑20单细胞呈椭圆状，通过出芽生殖，部分菌体可见芽体。

[0054] 6.耐甲醇菌株的分子生物学鉴定

[0055] 将筛选得到的耐甲醇菌株纯培养物进行26S rDNA Dl/D2区序列扩增：挑取单菌落于PCR管中进行菌落PCR，选择真菌通用引物NL1和NL4。

[0056] 其中，真菌通用引物序列(5′‑3′)如下：

[0057] NL1：见SEQ ID NO.2；

[0058] NL2：见SEQ ID NO.3；

[0059] PCR反应体系如表2所示：

[0060] 表2PCR反应体系

[0061]

[0062] PCR程序为：98℃，3min；94℃，15s；55℃，15s；72℃，1min；循环30次；72℃，10min。

[0063] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，对PCR扩增产物进行测序，测序序列通过NCBI数据库上的BLAST进行比对，从而确定种属信息。

[0064] 将分离纯化后的耐甲醇菌株3‑1‑20菌落进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR产物电泳检测如图3所示，PCR产物中出现目标条带(574bp)，且条带清晰，说明成功PCR产物扩增成功。将PCR扩增产物进行测序，测序序列通过NCBI数据库上的BLAST进行比对，比对结果如表3所示。

[0065] 表3菌株BLAST对比结果

[0066]

[0067] 由表3可知，菌株3‑1‑20和Pichia kudriavzevii NRRL Y‑5396相似度为99.47％。

[0068] 7.耐甲醇菌株3‑1‑20系统发育树

[0069] 将筛选出的耐甲醇菌株的26S rDNA Dl/D2区序列NCBI数据库进行BLAST对比，挑选一致性较高的序列，构建系统发育树。耐甲醇菌株3‑1‑20的26S rDNA Dl/D2区序列与NCBI数据库进行对比，菌株挑选一致性较高的序列，利用MEGA 11的邻位相连法(Neighbor‑Joining)构建系统发育树。构建的系统发育树如图4所示，菌株3‑1‑20与毕赤酵母属(Pichia)的相似性较高，确定耐甲醇菌株3‑1‑20的分类命名为库德里阿兹威毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)，菌株命名为库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20(Pichia kudriavzevii 3‑1‑20)。

[0070] 实施例2库德里阿兹威毕赤酵母菌株3‑1‑20的生长曲线

[0071] 绘制库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20的生长曲线：配置YPD液体培养基，每个处理三个重复，取提前摇好的酵母悬浊液按1％(v/v)接种量进行接种，于30℃、200r/min，震荡培养，分别在0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h以及48h取样进行测定OD600值(600nm波长)。用Excel 2021进行作图，制库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20的生长曲线。

[0072] 结果如图5所示，库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20在0‑12h为适应期；12‑24h为快速生长变期；24‑36h生长缓慢，36‑48h为生长稳定期。

[0073] 实施例3测定库德里阿兹威毕赤酵母菌株3‑1‑20对乙酸、乙醇、氯化钠等的耐受能力

[0074] 在YPD琼脂培养基中分别加入不同浓度已过滤除菌的乙酸、乙醇、氯化钠等溶液，‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5设置三个平行，将提前摇好的酵母悬浊液分别稀释10 、10 、10 、10 、10 倍，以3μL的接种量接种到YPD琼脂培养基中，于30℃恒温培养箱中培养120h后进行观察并记录。

[0075] 分别在不同浓度梯度甲醇、乙醇、乙酸、氯化钠等物质的YPD琼脂培养基，30℃培养120h后，观察菌株3‑1‑20的生长状况，结果如图6所示，库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20能够耐受15％甲醇、12％乙醇、5/L乙酸以及120/L氯化钠。

[0076] 实施例4测定库德里阿兹威毕赤酵母菌株3‑1‑20对温度、pH的耐受能力[0077] 将提前摇好的酵母悬浊液以1％(v/v)的接种量接种至YPD液体培养基中，于不同的温度梯度(28℃‑47℃)200rpm/min震荡培养48h后取样进行测定OD值(600nm波长)，以测定耐甲醇菌株的温度耐受能力；将提前摇好的酵母悬浊液以1％的接种量接种至不同pH梯度(pH 2‑pH 11)的YPD液体培养基，于30℃，200rpm/min震荡培养48h后取样进行测定OD值(600nm波长)，以测定耐甲醇菌株的pH耐受能力。

[0078] 库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20分别在不同温度以及pH梯度下，200rpm/min震荡培养48h后，测量菌液的OD600值，结果如图6所示，菌株3‑1‑20在47℃时能够存活，在pH2‑9时能够正常生长，但是在pH10时几乎不生长。

[0079] 实施例5库德里阿兹威毕赤酵母菌株3‑1‑20对生产乙醇能力

[0080] 将库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20活化培养3代后，利用pH 7.2‑7.4的磷酸盐缓冲液将目的菌株稀释到OD600值0.8，按2％(v/v)接种到YPD液体培养基中，于30℃100rpm/min震荡培养72h，测定发酵液中乙醇含量及菌液浓度，设置三个平行。发酵液中乙醇含量通过重铬酸钾法测定。

[0081] 库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20在YPD液体培养基中，100rpm/min震荡培养至72h后，测定发酵液中的乙醇含量，结果如表4所示，库德里阿兹威毕赤酵母菌3‑1‑20于30℃条件下，能够生产3.304g/L乙醇；于37℃条件下，能够生产9.608g/L乙醇。

[0082] 表4菌株产乙醇能力(g/L)

[0083]

[0084] 综上所述，本发明提供的库德里阿兹威毕赤酵母菌具有较高的鲁棒性，能耐受15％的甲醇浓度、12％的乙醇浓度、5％的乙酸浓度、12％的氯化钠浓度，在pH2‑9及28‑47℃条件下能正常生长，且能够在37℃条件下生产乙醇。并且在37℃下，乙醇产量达到了
9.608g/L。为高鲁棒性酵母细胞工厂的构建，合成甲基营养酵母的构建以及抗逆原件的开发利用提供了菌种资源。

[0085] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0086]