技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种重组巴斯德毕赤酵母菌及其应用。
相关背景技术
[0002] 海藻糖(Trehalose)是一种在自然界中广泛存在的非还原性二糖，由两个葡萄糖分子通过α‑1,1键连接。它在许多生物体内发挥着重要的抗逆境作用，如干旱、高盐和极端温度条件。
[0003] 麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)能特异性的切割与海藻糖端相邻的α‑1,4糖苷键。Michael等人解析了Sulfolobus solfataricusKM1来源的MTHase晶体结构，发现该酶有五个结构域：A、C、E为主要结构域，B和D为子结构域。MTHase通过二硫键作用成二聚体，麦芽寡糖基海藻糖是从E结构域表面进入，通过B和D结构到达(β/α)桶的C末端。Tp215、a6β‑β7通过氢键作用形成特殊空间位阻，该结构能够保证MTHase对海藻糖端的特异性识别，并特异性水解邻近海藻糖的α‑1,4糖苷键得到海藻糖。
[0004] 巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)具有高效分泌能力、快速生长等显著优势的蛋白系统，被广泛应用于食品和制药领域，正在被开发用于重组蛋白生产的宿主生物。
[0005] 因此，提供一种重组巴斯德毕赤酵母菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
具体实施方式
[0017] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018] 未优化的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列：
[0019] ATGAACCGACGATTCCCGGTCTGGGCGCCCCAGGCCGCGCAGGTGACGCTCGTCGTGGGCCAAGGCCGCGCCGAACTCCCGCTGACCCGCGACGAGAACGGATGGTGGGCTCTTCAGCAGCCGTGGGACGGCGGCCCCGACCTCGTCGACTACGGCTACCTCGTCGACGGCAAGGGCCCCTTCGCCGACCCGCGGTCGCTGCGGCAGCCGCGCGGCGTGCACGAGCTCGGCCGCGAATTCGACCCCGCCCGCTACGCGTGGGGCGACGACGGATGGCGCGGCCGAGACCTCACCGGAGCCGTGATCTACGAACTGCACGTCGGCACCTTCACCCCTGAGGGAACGCTGGACAGCGCCATCCGTCGCCTCGACCACCTGGTGCGCCTCGGCGTCGACGCGGTCGAGCTGCTGCCCGTCAACGCGTTCAACGGCACCCACGGCTGGGGCTACGACGGGGTGCTCTGGTACGCGGTGCACGAGCCCTACGGCGGCCCGGAGGCGTACCAGCGCTTCGTCGACGCCTGCCACGCCCGCGGCCTCGCCGTCGTGCAGGACGTCGTCTACAACCACCTGGGCCCGAGCGGCAACCACCTGCCCGACTTCGGCCCCTACCTCGGGTCGGGCGCCGCCAACACCTGGGGCGACGCGCTGAACCTCGACGGGCCGCTCTCCGACGAGGTGCGGCGGTACATCATCGACAACGCGGTGTACTGGCTGCGCGACATGCACGCCGACGGGCTGCGGCTCGACGCCGTGCACGCGCTGCGCGACGCCCGCGCGCTGCACCTGCTCGAAGAGCTCGCCGCCCGCGTCGACGAGCTGGCGGGCGAGCTCGGCCGGCCGCTGACGCTCATCGCCGAGAGCGACCTGAACGACCCGAAGCTGATCCGCTCCCGCGCGGCGCACGGCTACGGCCTCGACGCCCAGTGGGACGACGACGTGCACCACGCGGTGCACGCCAACGTGACCGGCGAGACCGTCGGCTACTACGCCGACTTCGGCGGGCTCGGCGCCCTCGTCAAGGTGTTCCAGCGCGGCTGGTTCCACGACGGCACCTGGTCGAGCTTCCGCGAGCGGCACCACGGCCGGCCGCTCGACCCCGACATCCCGTTCCGCCGGCTCGTCGCCTTCGCGCAGGATCACGACCAGGTCGGCAACCGAGCGGTCGGCGACCGCATGTCGGCGCAGGTCGGCGAGGGTTCGCTCGCCGCCGCGGCGGCGCTCGTGCTGCTCGGCCCGTTCACCCCGATGCTGTTCATGGGCGAGGAGTGGGGCGCGCGCACCCCGTGGCAGTTCTTCACCTCCCACCCCGAGCCCGAGCTGGGGGAGGCGACGGCGCGCGGGCGCATCGCCGAGTTCGCCCGCATGGGCTGGGACCCGGCAGTCGTGCCCGACCCGCAGGACCCGGCCACCTTCGCCCGCTCGCACCTGGACTGGTCCGAGCCCGAGCGGGAACCGCACGCGGGCCTGCTCGCCTTCTACACCGACCTGATCGCGCTGCGGCGCGAGCTGCCGGTCGATGCGCCGGCGCGCGAGGTGGATGCCGACGAGGCGCGCGGCGTCTTCGCGTTCAGCCGCGGCCCGCTGCGGGTCACGGTCGCGCTGCGCCCCGGACCGGTCGGGGTGCCCGAGCACGGGGGCCTCGTGCTCGCCTACGGCGAGGTGCGCGCCGGCGCCGCCGGACTGCACCTCGACGGGCCGGGAGCCGCGATCGTGCGCCTCGAGTGA；SEQ ID NO.1。
[0020] 未优化的麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列：
[0021] MNRRFPVWAPQAAQVTLVVGQGRAELPLTRDENGWWALQQPWDGGPDLVDYGYLVDGKGPFADPRSLRQPRGVHELGREFDPARYAWGDDGWRGRDLTGAVIYELHVGTFTPEGTLDSAIRRLDHLVRLGVDAVELLPVNAFNGTHGWGYDGVLWYAVHEPYGGPEAYQRFVDACHARGLAVVQDVVYNHLGPSGNHLPDFGPYLGSGAANTWGDALNLDGPLSDEVRRYIIDNAVYWLRDMHADGLRLDAVHALRDARALHLLEELAARVDELAGELGRPLTLIAESDLNDPKLIRSRAAHGYGLDAQWDDDVHHAVHANVTGETVGYYADFGGLGALVKVFQRGWFHDGTWSSFRERHHGRPLDPDIPFRRLVAFAQDHDQVGNRAVGDRMSAQVGEGSLAAAAALVLLGPFTPMLFMGEEWGARTPWQFFTSHPEPELGEATARGRIAEFARMGWDPAVVPDPQDPATFARSHLDWSEPEREPHAGLLAFYTDLIALRRELPVDAPAREVDADEARGVFAFSRGPLRVTVALRPGPVGVPEHGGLVLAYGEVRAGAAGLHLDGPGAAIVRLE；SEQ ID NO.2。
[0022] 密码子优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因序列：
[0023] ATGGAATTCATGAACAGAAGATTTCCAGTTTGGGCTCCACAAGCTGCTCAAGTTACTTTGGTTGTTGGTCAAGGTAGAGCTGAGTTGCCATTGACTAGAGATGAAAACGGTTGGTGGGCTTTGCAACAACCTTGGGATGGTGGTCCAGATTTGGTTGATTACGGTTACTTGGTTGATGGTAAAGGTCCATTTGCTGATCCTAGATCTTTGAGACAACCTAGAGGTGTTCATGAATTGGGTAGAGAATTTGATCCAGCTAGATACGCTTGGGGAGATGATGGATGGAGAGGTCGTGATTTGACTGGTGCTGTTATCTATGAGTTGCACGTTGGTACCTTTACTCCAGAAGGTACTTTGGACTCCGCTATTAGAAGATTGGATCATTTGGTTAGATTGGGTGTTGATGCTGTTGAATTGTTGCCTGTTAATGCTTTTAATGGTACTCACGGATGGGGTTATGATGGTGTTTTGTGGTACGCTGTTCATGAACCATACGGTGGACCTGAAGCTTACCAGAGATTTGTTGATGCTTGCCACGCAAGAGGTTTGGCTGTCGTCCAAGATGTCGTTTACAACCACTTGGGTCCTTCTGGAAATCATTTGCCAGATTTCGGTCCTTACTTGGGATCAGGAGCTGCTAACACTTGGGGAGATGCATTGAACTTGGATGGTCCTTTGTCTGATGAAGTTAGAAGATACATTATTGATAACGCAGTTTACTGGTTAAGAGATATGCATGCAGATGGTTTGAGACTTGATGCTGTTCACGCATTAAGAGATGCTAGAGCTTTGCATTTGTTGGAAGAATTGGCTGCTAGGGTTGATGAATTGGCTGGTGAGTTGGGTAGACCATTGACTTTAATTGCTGAATCTGATTTGAACGATCCTAAATTGATTAGATCTAGAGCTGCTCATGGTTACGGATTGGATGCTCAATGGGATGATGATGTTCATCATGCCGTCCATGCTAACGTTACTGGTGAAACTGTTGGTTATTACGCTGATTTTGGAGGTTTGGGAGCTTTGGTTAAGGTGTTTCAAAGAGGATGGTTCCATGATGGTACTTGGTCTAGTTTTAGAGAGAGACATCATGGTAGACCATTGGACCCAGATATTCCTTTTAGAAGATTGGTTGCTTTTGCTCAAGATCATGACCAAGTTGGTAATAGAGCTGTTGGAGATAGAATGTCTGCTCAAGTTGGTGAGGGTTCTTTGGCTGCTGCTGCCGCCTTAGTTTTGTTAGGTCCTTTTACTCCAATGTTATTCATGGGTGAAGAATGGGGTGCTAGAACTCCATGGCAATTTTTCACTTCTCATCCTGAACCAGAATTGGGTGAGGCTACTGCTAGAGGTAGAATTGCTGAGTTTGCTAGAATGGGATGGGATCCAGCTGTTGTTCCAGATCCACAAGATCCAGCTACTTTTGCTAGATCTCACTTGGATTGGTCTGAACCAGAAAGAGAGCCTCATGCTGGTTTGTTGGCTTTTTATACTGATTTGATTGCCTTGAGAAGAGAGTTGCCAGTTGATGCTCCAGCTAGAGAAGTTGATGCTGATGAAGCTAGAGGTGTTTTTGCTTTTAGTAGAGGTCCATTGAGAGTCACTGTTGCTTTGAGACCAGGTCCAGTTGGTGTTCCTGAACATGGTGGTTTGGTTCTGGCCTACGGTGAAGTTAGAGCTGGTGCTGCTGGTTTGCATTTGGACGGTCCAGGTGCTGCTATTGTTAGATTGGAA；SEQ ID NO.3。
[0024] 密码子优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶氨基酸序列：
[0025] MEFMNRRFPVWAPQAAQVTLVVGQGRAELPLTRDENGWWALQQPWDGGPDLVDYGYLVDGKGPFADPRSLRQPRGVHELGREFDPARYAWGDDGWRGRDLTGAVIYELHVGTFTPEGTLDSAIRRLDHLVRLGVDAVELLPVNAFNGTHGWGYDGVLWYAVHEPYGGPEAYQRFVDACHARGLAVVQDVVYNHLGPSGNHLPDFGPYLGSGAANTWGDALNLDGPLSDEVRRYIIDNAVYWLRDMHADGLRLDAVHALRDARALHLLEELAARVDELAGELGRPLTLIAESDLNDPKLIRSRAAHGYGLDAQWDDDVHHAVHANVTGETVGYYADFGGLGALVKVFQRGWFHDGTWSSFRERHHGRPLDPDIPFRRLVAFAQDHDQVGNRAVGDRMSAQVGEGSLAAAAALVLLGPFTPMLFMGEEWGARTPWQFFTSHPEPELGEATARGRIAEFARMGWDPAVVPDPQDPATFARSHLDWSEPEREPHAGLLAFYTDLIALRRELPVDAPAREVDADEARGVFAFSRGPLRVTVALRPGPVGVPEHGGLVLAYGEVRAGAAGLHLDGPGAAIVRLE；SEQ ID NO.4。
[0026] ERO1基因序列：
[0027] ATGAGGATAGTAAGGAGCGTAGCTATCGCAATAGCCTGTCATTGTATAACAGCGTTAGCAAACCCTCAAATCCCTTTTGACGGCAACTACACCGAGATCATCGTGCCAGATACCGAAGTTAACATCGGACAGATTGTAGATATTAACCACGAAATAAAACCCAAACTGGTGGAACTGGTCAACACAGACTTCTTCAAATATTACAAATTAAACCTATGGAAACCATGTCCGTTTTGGAATGGTGATGAGGGATTCTGCAAGTATAAGGATTGCTCTGTCGACTTTATCACTGATTGGTCTCAGGTGCCTGATATCTGGCAACCAGACCAATTGGGTAAGCTTGGAGATAACACGGTACATAAGGATAAGGGCCAAGATGAAAATGAGCTGTCCTCAAATGATTATTGCGCTTTGGATAAAGACGACGATGAAGATTTAGTATATGTCAATTTGATTGATAACCCTGAAAGATTCACCGGTTATGGTGGTCAGCAATCTGAATCTATTTGGACTGCGGTCTATGATGAGAACTGTTTCCAGCCGAATGAAGGATCACAATTGGGTCAAGTTGAAGACCTCTGTTTGGAGAAACAGATCTTTTACCGATTGGTTTCTGGTTTGCATTCTAGTATCTCCACCCACCTCACAAACGAATATCTGAATTTGAAAAATGGAGCATACGAACCAAATTTGAAACAGTTCATGATCAAAGTTGGGTATTTTACTGAAAGAATTCAAAACTTACATCTCAATTATGTCCTTGTATTGAAGTCACTAATAAAGCTACAAGAATACAATGTTATCGACAATCTACCTCTCGATGACTCTTTGAAAGCTGGTCTTAGCGGTTTAATATCTCAAGGAGCACAGGGTATTAACCAGAGCTCTGATGATTATCTATTTAACGAGAAGGTTCTTTTCCAAAATGACCAAAATGATGATTTGAAAAATGAATTCCGTGACAAATTCCGCAACGTGACTAGATTAATGGATTGTGTCCATTGCGAGAGATGCAAATTATGGGGAAAATTGCAAACTACAGGGTACGGGACTGCATTGAAGATTCTATTTGATTTGAAGAATCCTAATGACTCCATCAATTTAAAGAGAGTTGAGTTAGTTGCTCTAGTCAACACATTCCATAGATTGTCCAAATCTGTTGAAAGCATTGAAAACTTTGAAAAACTATATAAGATTCAACCGCCAACGCAGGATCGTGCATCAGCGTCGTCCGAATCCTTAGGCCTTTTCGATAACGAAGATGAACAAAATCTCCTCAACTCGTTTTCGGTTGATCAGGCAGTCATTTCATCGAAAGAGGCACCAGAAGAAATCAAAAGCAAACCTGTTGGAAAAGCCGCATATAAACAAAACAGTTGTCCATCATTGGGTTCAAAATCTATCAAAGAAGCATTCCATGAAGAACTTCACGCATTTATTGATGCAATTGGATTTATATTGAACTCTTACAGGACTTTGCCCAAGCTGTTGTACACACTTTTCCTCGTTAAATCATCTGAATTATGGGACATTTTCATTGGCACTCAAAGGCACCGAGATACCACATATAGAGTAGACTTG；SEQ ID NO.11。
[0028] ERO1氨基酸序列：
[0029] MRIVRSVAIAIACHCITALANPQIPFDGNYTEIIVPDTEVNIGQIVDINHEIKPKLVELVNTDFFKYYKLNLWKPCPFWNGDEGFCKYKDCSVDFITDWSQVPDIWQPDQLGKLGDNTVHKDKGQDENELSSNDYCALDKDDDEDLVYVNLIDNPERFTGYGGQQSESIWTAVYDENCFQPNEGSQLGQVEDLCLEKQIFYRLVSGLHSSISTHLTNEYLNLKNGAYEPNLKQFMIKVGYFTERIQNLHLNYVLVLKSLIKLQEYNVIDNLPLDDSLKAGLSGLISQGAQGINQSSDDYLFNEKVLFQNDQNDDLKNEFRDKFRNVTRLMDCVHCERCKLWGKLQTTGYGTALKILFDLKNPNDSINLKRVELVALVNTFHRLSKSVESIENFEKLYKIQPPTQDRASASSESLGLFDNEDEQNLLNSFSVDQAVISSKEAPEEIKSKPVGKAAYKQNSCPSLGSKSIKEAFHEELHAFIDAIGFILNSYRTLPKLLYTLFLVKSSELWDIFIGTQRHRDTTYRVDL；SEQ ID NO.12。
[0030] PDI基因序列：
[0031] ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTGTGGCAAGTATTTTGTCCGCTCTCACACTAGCACAAGCAAGTGATCAGGAGGCTATTGCTCCAGAGGACTCTCATGTCGTCAAATTGACTGAAGCCACTTTTGAGTCTTTCATCACCAGTAATCCTCACGTTTTGGCAGAGTTTTTTGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAAGTTGGGCCCTGAACTTGTTTCTGCTGCCGAGATCTTAAAGGACAATGAGCAGGTTAAGATTGCTCAAATTGATTGTACGGAGGAGAAGGAATTATGTCAAGGCTACGAAATTAAAGGGTATCCTACTTTGAAGGTGTTCCATGGTGAGGTTGAGGTCCCAAGTGACTATCAAGGTCAAAGACAGAGCCAAAGCATTGTCAGCTATATGCTAAAGCAGAGTTTACCCCCTGTCAGTGAAATCAATGCAACCAAAGATTTAGACGACACAATCGCCGAGGCAAAAGAGCCCGTGATTGTGCAAGTACTACCGGAAGATGCATCCAACTTGGAATCTAACACCACATTTTACGGAGTTGCCGGTACTCTCAGAGAGAAATTCACTTTTGTCTCCACTAAGTCTACTGATTATGCCAAAAAATACACTAGCGACTCGACTCCTGCCTATTTGCTTGTCAGACCTGGCGAGGAACCTAGTGTTTACTCTGGTGAGGAGTTAGATGAGACTCATTTGGTGCACTGGATTGATATTGAGTCCAAACCTCTATTTGGAGACATTGACGGATCCACCTTCAAATCATATGCTGAAGCTAACATCCCTTTAGCCTACTATTTCTATGAGAACGAAGAACAACGTGCTGCTGCTGCCGATATTATTAAACCTTTTGCTAAAGAGCAACGTGGCAAAATTAACTTTGTTGGCTTAGATGCCGTTAAATTCGGTAAGCATGCCAAGAACTTAAACATGGATGAAGAGAAACTCCCTCTATTTGTCATTCATGATTTGGTGAGCAACAAGAAGTTTGGAGTTCCTCAAGACCAAGAATTGACGAACAAAGATGTGACCGAGCTGATTGAGAAATTCATCGCAGGAGAGGCAGAACCAATTGTGAAATCAGAGCCAATTCCAGAAATTCAAGAAGAGAAAGTCTTCAAGCTAGTCGGAAAGGCCCACGATGAAGTTGTCTTCGATGAATCTAAAGATGTTCTAGTCAAGTACTACGCCCCTTGGTGTGGTCACTGTAAGAGAATGGCTCCTGCTTATGAGGAATTGGCTACTCTTTACGCCAATGATGAGGATGCCTCTTCAAAGGTTGTGATTGCAAAACTTGATCACACTTTGAACGATGTCGACAACGTTGATATTCAAGGTTATCCTACTTTGATCCTTTATCCAGCTGGTGATAAATCCAATCCTCAACTGTATGATGGATCTCGTGACCTAGAATCATTGGCTGAGTTTGTAAAGGAGAGAGGAACCCACAAAGTGGATGCCCTAGCACTCAGACCAGTCGAGGAAGAAAAGGAAGCTGAAGAAGAAGCTGAAAGTGAGGCAGACGCTCACGACGAGCTT；SEQ ID NO.13。
[0032] PDI氨基酸序列：
[0033] MQFNWNIKTVASILSALTLAQASDQEAIAPEDSHVVKLTEATFESFITSNPHVLAEFFAPWCGHCKKLGPELVSAAEILKDNEQVKIAQIDCTEEKELCQGYEIKGYPTLKVFHGEVEVPSDYQGQRQSQSIVSYMLKQSLPPVSEINATKDLDDTIAEAKEPVIVQVLPEDASNLESNTTFYGVAGTLREKFTFVSTKSTDYAKKYTSDSTPAYLLVRPGEEPSVYSGEELDETHLVHWIDIESKPLFGDIDGSTFKSYAEANIPLAYYFYENEEQRAAAADIIKPFAKEQRGKINFVGLDAVKFGKHAKNLNMDEEKLPLFVIHDLVSNKKFGVPQDQELTNKDVTELIEKFIAGEAEPIVKSEPIPEIQEEKVFKLVGKAHDEVVFDESKDVLVKYYAPWCGHCKRMAPAYEELATLYANDEDASSKVVIAKLDHTLNDVDNVDIQGYPTLILYPAGDKSNPQLYDGSRDLESLAEFVKERGTHKVDALALRPVEEEKEAEEEAESEADAHDEL；SEQ ID NO.14。
[0034] 实施例1麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆及载体构建
[0035] 根据毕赤酵母的密码子偏好性，对来源于Arthrobacter ramosus麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因(基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行密码子优化，获得一条密码子优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因(基因序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。设计引物MTHase‑F/R对合成的优化后的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因进行PCR扩增，获得带有同源臂的密码子优化后的MTHase片段；设计引物pPIC9k‑F/R对pPIC9k质粒进行PCR扩增获得pPIC9k载体片段，将MTHase片段和pPIC9k载体片段通过同源重组的方式进行连接，获得重组表达载体pPIC9K‑MTHase(载体图谱见图1)。引物序列如下：
[0036] MTHase‑F：5’
[0037] ‑AAAGAGAGGCTGAAGCTATGAACCGACGATTCCCGGTCT‑3’；SEQ ID NO.5；
[0038] MTHase‑R：5’
[0039] ‑CTAGGGAATTCTACGTATCACTCGAGGCGCACGATCG‑3’；SEQ ID NO.6；
[0040] pPIC9k‑F：5’‑TACGTAGAATTCCCTAGGGCGGCC‑3’；SEQ ID NO.7；
[0041] pPIC9k‑R：5’‑AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGAT‑3’；SEQ ID NO.8。
[0042] PCR扩增体系为：2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 15μL；引物‑F(10μM)1μL；引物‑R(10μM)1μL；模板1μL；ddH2O补足至30μL。
[0043] PCR扩增程序为：98℃预变性2min，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸10min。
[0044] 使用同源重组的方式进行连接：加入5μL同源重组酶(Vazyme公司ClonExpress IIOne Step Cloning Kit‑C112一步隆试剂盒)，1μL MTHase片段，2μL pPIC9k载体，用ddH2O补足重组体系至10μL，50℃，30min。将连接体系转入DH5α感受态细胞中。挑取单克隆菌落，提取重组表达质粒pPIC9K‑MTHase。
[0045] 将上述获得的重组表达质粒pPIC9K‑MTHase用线性化‑F/R引物进行线性化，引物序列如下：
[0046] 线性化‑F：5’‑CAAAGCGACTCCATCAAACTTGG‑3’；SEQ ID NO.9；
[0047] 线性化‑R：5’‑TTGAAGACACCTGTGTTAGAAGCT‑3’；SEQ ID NO.10。重组表达质粒pPIC9K‑MTHase的线性化片段通过电穿孔法(0.2cm，1.5kV，5ms)转化毕赤酵母GS115，电转结束后加入800μL 1M山梨醇溶液混匀后，涂布MD平板(13.4g/L YNB、0.0004g/L D‑生物素、20g/L D‑葡萄糖、20g/L琼脂)上筛选得到阳性重组菌株GS115/pPIC9K‑MTHase。
[0048] 实施例2添加分子伴侣提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶的蛋白表达
[0049] 设计引物ERO1‑F/R，以合成的ERO1基因序列(基因序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)为模板，扩增ERO1；设计引物PDI‑F/R，以合成的PDI基因序列(基因序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)为模板，扩增PDI片段；设计引物pPICZA‑F/R对pPICZA质粒进行PCR扩增，获得pPICZA载体片段。引物序列如下：
[0050] ERO1‑F：5’
[0051] ‑TTCGAAACGATGAGGATAGTAAGGAGCGTAGCTATC‑3’；SEQ ID NO.15；
[0052] ERO1‑R：5’‑GCGGCCGCTTACAAGTCTACTCTATATGTGGTATC‑3’；SEQ ID NO.16；
[0053] PDI‑F：5’‑TTCGAAACGATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTG‑3’；SEQ ID NO.17；
[0054] PDI‑R：5’‑GCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGT‑3’；SEQ ID NO.18；
[0055] pPICZA‑F：5’‑GCGGCCGCCAGCTTGGGCCCGA‑3’；SEQ ID NO.19；
[0056] pPICZA‑R：5’‑CGTTTCGAATAATTAGTTGTTTT‑3’；SEQ ID NO.20。
[0057] PCR扩增体系和程序同上。
[0058] 分别将ERO1、PDI片段与pPICZA载体片段连接，转入DH5α感受态细胞，获得重组载体pPICZA‑ERO1、pPICZA‑PDI。
[0059] 以pPICZA‑PDI为模板，片段‑F/R为引物，将带有AOX1启动子、PDI基因、AOX1终止子的片段1进行扩增。以pPICZA‑ERO1为模板，载体‑F/R为引物，扩增pPICZA‑ERO1载体片段。将片段1与pPICZA‑ERO1载体片段进行连接，转入DH5α感受态细胞，获得分子伴侣ERO1、PDI共表达载体pPICZA‑ERO1/PDI。引物序列如下：
[0060] 片段‑F：5’
[0061] ‑ATAGAGTAGACTTGTAAGATCTAACATCCAAAGACGAA‑3’；SEQ ID NO.21；
[0062] 片段‑R：5’
[0063] ‑CCCAAGCTGGCGGCCGCTCCACTTAATCTTCTGTACTC‑3’；SEQ ID NO.22；
[0064] 载体‑F：5’‑GCGGCCGCCAGCTTGGGCCCGA‑3’；SEQ ID NO.23；
[0065] 载体‑R：5’‑TTACAAGTCTACTCTATATGTGGT‑3’；SEQ ID NO.24。
[0066] 将上述获得的共表达载体pPICZA‑ERO1/PDI用线性化‑F1/R1引物进行线性化，获得pPICZA‑ERO1/PDI线性化片段。引物序列如下：
[0067] 线性化‑F1：5’‑CCCCCACACACCATAGCTTCAA‑3’；SEQ ID NO.25；
[0068] 线性化‑R1：5’‑GCTATGGTGTGTGGGGGATCCGC‑3’；SEQ ID NO.26。
[0069] PCR扩增体系和程序同上。
[0070] pPICZA‑ERO1/PDI线性化片段通过电穿孔法转化重组毕赤酵母GS115/pPIC9K‑MTHase感受态中，涂布含有氨苄卡那霉素抗性(50μg/mL)的YPD平板，筛选获得阳性共表达分子伴侣重组菌株GS115/MTHase‑EP。
[0071] 实施例3麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活测定
[0072] 分别将重组菌株GS115/pPIC9K‑MTHase、共表达分子伴侣重组菌株GS115/MTHase‑EP接种至5mL含50μg/mL氨苄卡那霉素的YPD试管培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中过夜培养，当试管培养基OD600为0.6时按0.5％接种量转接至200mL YPD摇瓶培养基中培养，培养温度为30℃，转速为250rpm，每隔24h向培养基中加入4mL 50％甲醇溶液，培养至72h。离心去除菌体，收集发酵上清液测酶活。
[0073] 酶活测定方法如下：
[0074] 10μL MTSase酶液(按照Chen C,Su L,Wu L,et al.Enhancedthe catalytic efficiency and thermostability of maltooligosyltrehalose synthase from Arthrobacter ramosus by directed evolution[J].Biochemical Engineering Journal,2020,162:107724获得)加到490μL 1％的麦芽六糖溶液中(20mmol/1pH6.0的磷酸盐缓冲液配制)，55℃反应2h，100℃煮沸10min终止反应。待溶液冷却后，12000rpm，4℃条件下离心5min，保留上清液作为反应底物。
[0075] 加入10μL重组菌株发酵上清液到190μL反应底物中，55℃反应10min，煮沸10min终止反应，取100μL反应液，加入900μL水和1mL DNS溶液，沸水中煮7min，加水补至10mL，最后测定在OD540处的吸光值。MTHase的酶活单位定义为：每一分钟转化生成1μmol麦芽四糖所需4
的酶量。酶活力(U/mL)＝麦芽四糖标曲斜率xΔA540 x 2x10 /麦芽四糖分子量(麦芽四糖浓度标准曲线制备：用20mmol/L pH 6.0的缓冲盐溶液分别配制0.2％、0.4％、0.6％、
0.8％、1％的麦芽四糖溶液，DNS比色法测定和记录在OD540处的吸光值，绘制麦芽四糖标准曲线)。
[0076] 结果显示，对照组GS115/pPIC9K‑MTHase酶活为248U/mg，共表达分子伴侣重组菌株GS115/MTHase‑EP酶活为420U/mg。
[0077] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
