[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种抗变形链球菌的核酸分子、多肽及在制备抗变形链球菌的药物应用。

[0002] 龋病是以细菌因素为主的多种因素引起的口腔微生态失衡为特征的口腔慢性感染性疾病，是人类最常见的细菌性疾病1.2，具有发病率高，治疗率低等特点，严重危害口腔和全身健康，加强和完善龋病的规范化治疗是全人群，全生命周期龋病管理面临的关键问题。目前龋病预防关注点集中于对牙菌斑的去除，而牙菌斑为大量共生微生物集中组成，因此“移除或杀灭所有”菌斑微生物的理念对于致病微生物创造了一个开放的非竞争性的环境。传统的方法预防或治疗龋病，无法从根本上解决牙体组织损伤及细菌赖药性等问题。微生态制剂及抗菌肽应运而生，通过抑制口腔病原菌以达到调节口腔微生态平衡的目的，是预防及治疗龋病的新方法。

[0003] 变异链球菌是口腔中的常驻菌群，在龋病发生的早期扮演着重要的角色，因此对变异链球研究，是对龋病的预防及治疗起着关键作用。因此有必要开发一种抗变形链球菌的药物。

[0024] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

[0025] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

[0026] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

[0027] 本发明的整体思路如下：

[0028] 通过免疫小鼠、融合及亚克隆筛选，获得一株单克隆抗体KLH336，[0029] 所述抗体包括重链可变区和轻链可变区：

[0030] 所述重链可变区具有如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的三个互补决定区；GFTFSDFY(SEQ ID NO：1)；SKNKFNGYTT(SEQ ID NO：2)；ARGNWDVDFDY(SEQ ID NO：3)。

[0031] 进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKGLEWIAASKNKFNGY TTVYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAVYYCARGNWDVDFDYWGQGTTLT VSS)；

[0032] 所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示：

[0033] (DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGDTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIK)；去除小鼠固定区域，轻链抗体可变区序列如SEQ ID NO：8所示，序列为QNIVHSNGDTYKVSFQGSHVPWT；

[0034] 进一步通过分析发现：

[0035] 所述重链可变区去除小鼠固定区域，氨基酸序列SEQ ID NO：6所示，序列为GFTFSDFYSKNKFNGYTTARGNWDVDFDY；通过实验发现氨基酸序列SEQ ID NO：6所示的多肽(称为抗变形链球菌的多肽)能够抑制链球菌增殖，从而可以用于制备抗变形链球菌的药物。

[0036] 编码抗变形链球菌的多肽的核酸分子如SEQ ID NO：7所示；

[0037] GGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACAGTAAAAACAAATTTAATGGTTATACAACAGC AAGAGGCAACTGGGACGTAGACTTTGACTAC。

[0038] 下面将结合实施例及实验数据对本申请的抗体及其制备方法与应用效果进行详细说明。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0039] 本实验所用细菌为国际参考株S.mut ans Ingbritt(血清型C)，在变形链球菌选择性培育基MSB中纯分，挑取单个典型菌落，与TSB中37度微氧培养24小时(95％N2,5％CO2),提取总蛋白并SDS‑PAGE鉴定。

[0040] 实施例1、抗变形链球菌的多肽与核酸分子的获得

[0041] 1、抗原制备

[0042] 本实验所用细菌为国际参考株S.mut ans Ingbritt(血清型C)，在变形链球菌选择性培育基MSB中纯分，挑取单个典型菌落，与TSB中37度微氧培养24小时(95％N2,5％CO2),提取总蛋白并SDS‑PAGE鉴定(结果如图4所示)。

[0043] 2、采用所述抗原免疫5只小鼠，共免疫四次，具体如表1所示。

[0044] 表1

[0045]

[0046] 3、融合及亚克隆筛选

[0047] 挑选血清免疫结果较好及验证结果较好的1‑2只小鼠，取脾脏进行细胞融合，通过HAT培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间进行2‑3轮间接ELISA筛选，得到符合要求的阳性单克隆细胞株后建株。

[0048] 4、单细胞株测序

[0049] 从杂交瘤细胞株中提取总RNA,并进行反转录PCR扩增cDNA。抗体的可变区序列通过亚型特异性引物进行PCR进行扩增，再进行经SMART(RNA转录物5‘端转换机制)技术改良的RT‑PCR。该技术是基于Moloney鼠白血病病毒(Moloney mouse leukemia virus，MMLV)逆转录酶的内在特性，以及在其3’端含3核糖鸟嘌呤(rGrGrG)的定制序列模板转换寡核苷酸(template‑switch oligo)上游引物的应用。为了扩增抗体可变区，设计了针对小鼠抗体kappa、lambda和IgG重链恒定区高度保守序列的RT‑PCR反向引物(表2和表3)[0050] 表2‑小鼠IgG反转录引物

[0051]

[0052] 表3‑小鼠IgG反转录引物

[0053]

[0054] 5、抗体可变区的RT‑PCR扩增过程如下：

[0055] Step 1、在表2的引物特异性结合在杂交瘤RNA上高度保守的恒定区后，MMLV逆转录酶引发聚合。

[0056] Step 2、MMLV逆转录酶在第一条链合成时到达RNA模板的5'端后，在cDNA转录本的3'端加上几个核苷酸，通常是脱氧胞嘧啶。添加的这些碱基允许在退火后结合模板转换寡核苷酸。

[0057] Step 3、当模板转换寡核苷酸的3‘核糖鸟嘌呤和cDNA脱氧胞嘧啶之间发生碱基配对时，MMLV逆转录酶转换模板并继续聚合。注意：此时是以模板转换寡核苷酸作为模板进行聚合，而不是杂交瘤RNA。

[0058] Step 4、MMLV逆转录酶引发聚合，直至模板转换寡核苷酸的5’端。最终得到为含有起始通用序列(universal sequence)的单链cDNA分子。

[0059] Step 5、最终得到为含有起始通用序列(universal sequence)的单链cDNA分子。

[0060] Step 6、以该单链cDNA为模板，合成双链cDNA。

[0061] Step 7、利用添加的通用序列进行PCR扩增。正向PCR引物(表3)与模板转换寡核苷酸具有相同的序列；反向PCR引物(表3)对每条链的恒定区(第2个高度保守序列处)具有特异性，嵌套在cDNA序列中以提高扩增特异性。

[0062] 产物分别亚克隆到T载上，并进行测序分析。编码抗体的cDNA一级结构示意图如图1所示。

[0063] 6、抗体亚型鉴定

[0064] 用Anti‑mouse IgGAb包被的Elisa板，培养上清分别加入ELISA板中，用不同HRP标记的抗鼠亚型二抗进行检测，分析抗体的亚型，结果见表4：

[0065] 表4抗体亚型测定结果

[0066]  1‑KLH‑336 2‑KLH‑336 3‑KLH‑336 4‑KLH‑336
IgG1 0.10 2.21 0.91 2.04
IgG2a 2.43 0.14 0.10 0.10
IgG2b 0.08 0.19 0.09 0.09
IgG2c 0.11 0.08 0.08 0.08
IgG3 0.10 0.07 0.08 0.08

[0067] 7、测序方法

[0068] 从杂交瘤细胞株中提取总RNA,用oligo‑dT为引物，进行RT‑PCR扩增总cDNA。以cDNA为模板,VH或VL可变区片段分别使用正向简并引物(根据V或L基因设计)和反向恒定区特异性引物(所用引物序列如下表所示)进行nested‑PCR扩增(见图2)。PCR产物连接到T载上，转化后进行菌落PCR(见图3)，挑选阳性克隆进行测序分析。

[0069] 表5轻链可变区片段的引物

[0070]名称 序列(5’‑3’)
引物1 GGTGATAICGTGAT(A/G)AC(C/A)CA(G/A)GATGAACTCTC(SEQ ID NO：17)引物2 GGTGATATC(A/T)TG(A/C)TGACCCAA(A/T)CTCCACTCTC(SEQ ID NO：18)引物3 GGTGATATCGT(G/T)CTCAC(C/T)CAA/G)TCTCCAGCAAT(SEQ ID NO：19)

[0071] 表6重链可变区轻链可变区片段的引物

[0072]名称 序列(5’‑3’)
引物1 GACGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAOCTAGCCTGGTG(SEQ ID NO：20)
引物2 AGGT(C/G)(A/C)AACTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG(SEQ ID NO：21)
引物3 AGGT(C/G)(AC)AGCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG(SEQ ID NO：22)
引物4 AGGT(C/G)CAGCTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG(SEQ ID NO：23)

[0073] 抗体重链测序结果如SEQ ID NO：4所示。抗体轻链测序结果如SEQ ID NO：5所示，6、抗变形链球菌的多肽的获得

[0074] 可直接合成氨基酸序列SEQ ID NO：6所示，序列为

[0075] GFTFSDFYSKNKFNGYTTARGNWDVDFDY，获得抗变形链球菌的多肽。

[0076] 在其他实施方式中可采用如SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸分子，构建表达质粒进行表达，获得抗变形链球菌的多肽的获得。

[0077] 实施例2、抗性实际效果的探究

[0078] 1、实验菌株：菌株为变形链球菌8148

[0079] 2、培养基的配制：采用MRS液体培养基(MRS broth MRS肉汤)，主要成分(g/L):蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，酵母粉4g，硫酸镁0.2g，硫酸镁0.05g，柠檬酸三桉2g.取48gMRS肉汤加1000ml蒸馏水高压灭菌锅灭菌。

[0080] 3、实验方法：取15只50ml离心管，每管加入10mlMRS液体培养基并接种100ul变形链球菌菌种。分成2组(PBS组、实验组)，实验组组分别加入50ug、200ug、500ug、1000ug、2000ug的实施例1制备得到的抗变形链球菌的多肽，置于37℃，120r/min摇床过夜培养，第二天测各个离心管菌体600nm波长下的吸光度值。

[0081] 表7吸光度检测数据

[0082]加样量/ul 10 20 50 100 200
PBS组 0.824 0.810 0.835 0.841 0.813
抗变形链球菌的多肽 0.687 0.632 0.502 0.421 0.409

[0083] 由表7可知，随着抗体添加量增加，链球菌8148的浓度OD值变低，可以证明本发明的抗变形链球菌的多肽能有效抑制链球菌生长，和对照组对比，抑菌效率达50％及以上。

[0084] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0085] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0086] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。