[0001] 本发明涉及抗体制备领域，尤其涉及一种抗HLA‑G抗体的制备及分析方法。

[0002] 人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen，HLA‑G)属于非经典HLA‑I类分子，在1987年由Geraghty首次克隆成功。目前，HLA‑G对机体免疫系统的抑制功能已经得到了证明，它可与T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等免疫细胞表面的抑制性受体免疫球蛋白样转录物、免疫球蛋白样转录和杀伤细胞免疫球蛋白样受体直接结合发挥生物学活性。在生理情况下，HLA‑G主要表达在绒毛外滋养层细胞、成人胸腺髓质组织、角膜细胞、胰岛和上皮样祖细胞等细胞和组织中等；在病理情况下，HLA‑G可以在肿瘤、器官移植和自身免疫性疾病等情况下产生。一方面HLA‑G的表达可以下调或抑制机体对妊娠和器官移植受者的免疫应答反应，诱导机体免疫耐受的形成，有利于妊娠的继续和移植器官的长期存活；另一方面，HLA‑G可以帮助肿瘤细胞避开宿主的免疫应答，使肿瘤易于发生转移，严重危害到患者的身体健康。

[0012] 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步非限制性的详细说明。需要指出的是，下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

[0013] 本发明提供了一种抗HLA‑G抗体的制备及分析方法。下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明

[0014] 1.免疫用抗原的制备

[0015] 第一步将合成的多肽偶联到载体蛋白质上。偶联产物过柱纯化，用蛋白质的直接定量(UV法)在280nm波长，直接测试蛋白蛋白质浓度后分装，‑40℃保存备用。多肽耦合偶联蛋白偶联蛋白(KLH、BSA、OVA等)，多肽‑KLH偶联物用于免疫小鼠，多肽‑BSA偶联物用于检测小鼠血清和杂交瘤上清及腹水抗HLA‑G单克隆抗体的效价。

[0016] 2.抗HLA‑G单克隆抗体的制备

[0017] 分离经3次免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0细胞采用聚乙二醇常规方法进行融合。对ELISA检测的阳性克隆使用有限稀释法进行亚克隆，直至有克隆生长的孔的阳性率达到100％。杂交瘤上清抗HLA‑G单克隆抗体效价检测采用间接ELISA。杂交瘤细胞经PBS缓冲液洗涤后重悬，以0.5×106～5×106个/只腹腔注射，经过9天后收集小鼠腹水，‑20℃保存备用。

[0018] 3.抗HLA‑G单克隆抗体特性分析

[0019] 抗HLA‑G单克隆抗体细胞株的遗传学的鉴定用普通染色体制片法制片后显微镜下染色体计数。抗体敏感性鉴定的测定用抗HLA‑G单克隆抗体的腹水按1∶53～1∶510稀释后做间接ELISA试验。抗HLA‑G单克隆抗体特异性分析用JEC‑3细胞株和外周血淋巴细胞(PBL)经40g/L多聚甲醛固定后进行流式细胞术(FCM)检测和荧光显微镜检测。

[0020] 结果分析：

[0021] 1.抗HLA‑G单克隆抗体的制备结果

[0022] 本研究中，共免疫6只BALB/c小鼠，融合前免疫双扩检测效价结果为：1∶16、1∶8、1∶2各2只。取其中1只效价为1∶16的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合、筛选、克隆、纯化后得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤。

[0023] 2.抗HLA‑G单克隆抗体特性分析结果

[0024] 杂交瘤的染色体众数为93。间接ELISA测定此抗HLA‑G单克隆抗体的敏感性为1×56。识别HLA‑G分子而不识别人的外周血淋巴细胞上的其他经典的人类白细胞抗原I类分子。以上初步说明此株具有HLA‑G特异性。