[0001] 本发明涉及可与备解素(properdin，P因子)结合的抗体或其抗原结合部分。根据本发明的抗体还用于制备用于通过抑制旁路补体途径来治疗疾病的药物。

[0002] 数十年来，科学家们致力于开发治疗补体介导的疾病的药物。到20世纪末，许多抗补体剂已在体外和动物模型中显示出前景，但很少有药物候选物针对人而有进展，并且那
些针对人有进展的药物候选物没有被进一步开发。当时正在测试的临床前分子中具有这样
的抗体，其针对阻断其功能的补体组分。例如，使用体外和体内动物疾病模型二者来容易地
确定使用抗小鼠C5和抗人C5单克隆抗体对C5功能的阻断。到21世纪初，人源化抗人C5单克
隆抗体依库珠单抗(eculizumab)在临床开发中取得进展并于2007年被FDA批准用于罕见但
为毁灭性的疾病，阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal haemoglobinuria，
PNH)。这种抗补体治疗的临床验证是补体药物发现的里程碑；这一突破与产生自全基因组
关联研究(genome wide association study，GWAS)的突破性数据相组合，证明了补体在广
泛传播疾病中的关键作用，推动了抗补体药物发现的复兴。这使我们走到了今天，该领域中
许多新药正在后期临床开发中取得进展，并且还有许多其他药物处于发现或临床前阶段。
(1)

[0003] 然而，针对眼部适应证开发的药物候选物(即靶向D因子(Factor D，FD)的mAb，兰帕利珠单抗(lampalizumab))提出的高期望未能在III期试验中转化为有意义的临床响应，
这表明与药物生物可利用性或效力相关的个体挑战仍有待解决。最近FDA批准了长效形式
的依库珠单抗(ALXN1210/雷夫利珠单抗(ravulizumab)，Ultomiris，Alexion)，其特征在于
延长的血浆滞留并且仅需要每8周而不是每两周施用一次，这是改善患者管理的重要步骤，
但不能被认为是该领域中真正的新药进入。在目前仅单补体特异性药物的临床可用性显然
不能满足所有补体相关的临床适应证的情况下，对疾病定制治疗方法的需求变得越来越迫
切。(2)

[0004] 然而，值得注意的是，对靶向补体途径的药物的开发与许多挑战相关，包括必须从中选择的蛋白质的绝对数量、每个这样的靶标的循环蛋白或膜结合蛋白的数量、补体在抗
击感染中的天然核心作用和对其调节得太强烈的安全性影响、以及对合适疾病或药物适应
证的确定。在许多疾病中，补体在发病机制中发挥驱动作用，而在其他疾病中，补体是疾病
的‘加剧剂’，诱导由不同疾病触发因素引发的病理状况增加，从而引发炎症和组织损伤。

[0005] 然而，随着补体在除裂解之外的作用以及其在与其他生物系统(例如凝血)的交互作用中的作用变得更清楚，补体系统中潜在药物的数目正在扩大。正在开发靶向补体系统
中的三种途径中的每一种的药物，并且这些药物包括小分子、肽、生物制剂、抗体和基于DNA的治疗剂。

[0006] 由于补体途径的级联性质及其所包含的大量蛋白质(可溶性和膜结合性二者的)，选择不同的干预点可导致不同的治疗作用。在大多数触发因素的情况下，补体途径被外来
或改变的表面所激活。在经典途径中，C1q对免疫复合物(和其他非免疫球蛋白部分)的识别
激活了相关的丝氨酸蛋白酶C1r和C1s，所述丝氨酸蛋白酶C1r和C1s切割血浆蛋白C2和C4以
在激活表面上形成C3转化酶复合物(C4b2a)。当凝集素途径的模式识别蛋白(甘露糖结合凝
集素[mannose‑binding lectin，MBL]、无花果酶(ficolin)、胶原凝集素(collectin))与病原体表面上的碳水化合物模式结合并诱导MBL相关的丝氨酸蛋白酶切割C2/C4时，实现了相
同的结果。旁路途径通过与蛋白酶、B因子和D因子(FB、FD)以及表面结合的C3b的相互作用
形成另一种类型的C3转化酶。在所有三种补体途径中，汇集点是产生一种或另一种激活C3
的C3转化酶，导致了受影响的细胞表面上的至少两个重要事件。一个是C3b在靶表面上的沉
积(使其成为巨噬细胞调理作用的候选物)和过敏毒素C3a的同时释放。另一个是C3bBb(C3
转化酶)的形成及其通过备解素的稳定化以用于组装切割C5的C5转化酶。旁路途径是保持
组成型活性的唯一途径，提供了在正确触发因素的可用性的情况下准备进行放大的恒定的
最小背景活性。尽管所释放的过敏毒素C5a是主要通过与C5a受体1(C5aR1)结合而发挥作用
的最强的化学引诱剂和促炎调节剂之一，但C5b片段可诱导膜攻击复合物(membrane 
attack complex，MAC)的组装，从而破坏被攻击细胞或诱导被攻击细胞的裂解。(1)

[0007] 超过20种靶向补体级联的不同组分和效应物途径的治疗剂目前正处于针对多种适应证的临床开发中。(2)

[0008] 旁路途径的扩增环是补体激活后的主要驱动力并且通常决定C5转化酶形成的开始，从而启动后续C5切割和末端途径激活。即使在其中病理机制由凝集素或经典途径介导
的疾病中，阻断旁路途径也可由于降低通过该扩增环产生的作用而提供治疗益处。因此，对
仅扩增环的经设计的特定干预被认为是药物开发中有吸引力的提议，因为这将使凝集素和
经典途径保持至少部分功能以抵抗感染；同时阻断旁路途径将控制对正常组织的附带损
伤。

[0009] 在扩增环内存在多个可成药靶标，例如C3(或C3b)、FB、FD和FP(备解素)，并且在药物开发中全部被靶向。(1)

[0010] 尽管药物的进展引起了后期临床开发，但是即使在依库珠单抗推出十多年之后，补体药物市场仍然缺乏任何针对级联中替代靶标的新批准的治疗剂。新出现的对抗C5治疗
响应不足的情况以及对多种触发因素和复杂遗传特征可能以尚未明确定义的方式使患者
的基础补体活性复杂化的认识，表明在目前用依库珠单抗治疗的疾病的抗补体治疗期间需
要更全面的患者分层和稳健的监测。

[0011] 尽管通过引入针对这些患者的第一病因学治疗证实了依库珠单抗显著改变PNH的前景，但出现了未满足的临床需求，包括某些患者中抗C5的遗传驱动的难治性表型、C3调理
的PNH细胞在血管外室中的残留溶血、以及在某些病例中观察到的引起与药物给药水平无
关的强烈补体激活(即急性感染)的药代动力学/药效学(PK/PD)突破性溶血。(2)。

[0012] 重要的是注意抗C5治疗与危及生命和致命的脑膜炎球菌感染的风险相关，所述脑膜炎球菌感染如果不及早发现和治疗，可能会迅速危及生命或致命。(3)

[0013] 因此完全可想象，在补体介导的大多数疾病情况下，完全抑制来源于所有补体途径的MAC形成不是必需的，并且下调(而不是关闭)补体可能足以赋予治疗作用，同时允许保
留足够部分的补体活性以防止严重感染。这样的治疗的目的是逆转调节异常并恢复体内平
衡。在这种情况下，扩增环代表了优异的靶标。通过提高环调节或降低转化酶的可用性来降
低通过扩增环的循环可使得能够对治疗进行微调来改善病理学，同时保留补体在免疫防御
中的保护作用。这对于治疗社区中的老年人和易感染个体将是显著的优势。数种AP特异性
药物正处于2期开发中，包括FB和FD的抑制剂。其他具有调节特性的药物即将出现(on the 
horizon)；递送调节剂的功能结构域(例如FH)可直接调节转化酶酶类，如在临床前分子
AMY201(Amyndas)中，所述AMY201是经工程化来以优越的效力与靶表面结合的FH的截短的
重组形式。最后，可阻断补体的天然修饰物；备解素使AP转化酶酶类稳定并且MASP3激活FD，使用药物例如CLG561(抗备解素，Novartis)或OMS906(临床前抗MASP3，Omeros)在这些水平
上进行干扰可促使补体系统趋向恢复稳态。(4)

[0014] 本发明涉及靶向备解素(P因子)以抑制旁路途径的抗体。

[0015] 针对备解素的单克隆抗体是本领域中已知的并且已在例如WO 2006131874、WO 2009110918、WO 201109494、WO 2013006449和WO 2018140956中描述。已开发了结合激活的
备解素的多种抗体，但据所知，尚未有任何一个被批准。存在一种靶向备解素的抗体
CLG561，它处于早期临床阶段，在该阶段中已与抗C5抗体组合对其进行了评价。(5)

[0016] 因此，仍存在对有效调节备解素活性并从而控制旁路补体途径的未满足的需求。因此，本发明提供了可被开发以治疗相关疾病的抗备解素抗体。

[0086] 本发明的公开内容涉及可用于治疗目的的新的抗备解素抗体。

[0087] 在一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分以高亲和力与人备解素结合。

[0088] 在一个实施方案中，本发明提供了抗备解素抗体或其抗原结合部分，其包含：

[0089] (a)具有以下通式(I)的CDRH1：G‑Y‑X1a‑X2a‑X3a‑X4a‑X5a‑X6a‑X7a；

[0090] (b)具有以下通式(II)的CDRH2：X1b‑I‑X2b‑X3b‑X4b‑X5b‑X6b‑X7b；

[0091] (c)具有以下通式(III)的CDRH3：X1c‑X2c‑X3c‑X4c‑X5c‑X6c‑X7c‑X8c‑X9c‑X10c‑X11c‑X12c‑X13c‑X14c；

[0092] (d)具有以下通式(IV)的CDRL1：X1d‑X2d‑X3d‑X4d‑X5d‑X6d‑X7d‑X8d‑X9d‑X10d‑X11d‑X12d‑X13d‑X14d‑X15d‑X16d‑X17d；

[0093] (e)具有以下通式(V)的CDRL2：X1e‑X2e‑X3e‑X4e‑X5e‑X6e‑X7e，和

[0094] (f)具有以下通式(VI)的CDRL3：X1f‑X2f‑X3f‑X4f‑X5f‑X6f‑X7f‑X8f‑X9f‑X10f‑X11f[0095] 其中，

[0096] X1a是选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0097] X2a是选自苯丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；

[0098] X3a是选自苏氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0099] X4a是选自天冬氨酸、丝氨酸和组氨酸的氨基酸；

[0100] X5a是选自酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0101] X6a和X7a中的每一个可以是存在的或不存在的，并且当存在时，是酪氨酸氨基酸；

[0102] X1b是选自缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和谷氨酸的氨基酸；

[0103] X2b是选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的氨基酸；

[0104] X3b是选自苏氨酸、脯氨酸和酪氨酸的氨基酸；

[0105] X4b是选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0106] X5b是选自酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0107] X6b是选自甘氨酸、天冬氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0108] X7b是选自天冬氨酸、酪氨酸和天冬酰胺的氨基酸；

[0109] X1c是选自天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸；

[0110] X2c是选自亮氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0111] X3c是选自天冬氨酸、酪氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0112] X4c是选自甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；

[0113] X5c是选自酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0114] X6c是选自谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和天冬酰胺的氨基酸；

[0115] X7c是选自丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的氨基酸或者可以是不存在的；

[0116] X8c是选自甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸的氨基酸或者可以是不存在的；

[0117] X9c是选自天冬氨酸和苯丙氨酸的氨基酸或者可以是不存在的；

[0118] X10c和X11c中的每一个可以是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自酪氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0119] X12c、X13c和X14c中的每一个可以是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自甲硫氨酸、天冬氨酸和酪氨酸的氨基酸；

[0120] X1d是选自精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸和谷氨酸的氨基酸；

[0121] X2d是选自脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；

[0122] X3d是选自丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸和色氨酸的氨基酸；

[0123] X4d是选自谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0124] X5d是选自天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0125] X6d是选自异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0126] X7d是选自天冬酰胺、亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸的氨基酸；

[0127] X8d是选自天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸的氨基酸；

[0128] X9d是选自酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、缬氨酸、组氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0129] X10d是选自亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0130] X11d是选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸；

[0131] X12d是可以是不存在的；

[0132] X13d是选自苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和赖氨酸的氨基酸或者可以是不存在的；

[0133] X14d、X15d、X16d和X17d中的每一个可以是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自酪氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和丙氨酸的氨基酸；

[0134] X1e是选自天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0135] X2e是选自天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸的氨基酸；

[0136] X3e是选自天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0137] X4e是选自赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0138] X5e是选自精氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0139] X6e是选自苯丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0140] X7e是选自丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸；

[0141] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的轻链CDR3(在下文中称为CDRL3)具有X1f‑X2f‑X3f‑X4f‑X5f‑X6f‑X7f‑X8f‑X9f‑X10f‑X11f的氨基酸序列，其中[0142] X1f是选自组氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；

[0143] X2f是选自谷氨酰胺、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0144] X3f是选自酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；

[0145] X4f是选自亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸；

[0146] X5f是选自丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0147] X6f是选自丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸；

[0148] X7f是选自酪氨酸、脯氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0149] X8f是选自苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和精氨酸的氨基酸；

[0150] X9f是选自苏氨酸和谷氨酸的氨基酸或者可以是不存在的；

[0151] X10f是选自丙氨酸和亮氨酸的氨基酸或者无氨基酸，以及

[0152] X11f是缬氨酸氨基酸或者可以是不存在的。

[0153] 在一个实施方案中，抗备解素抗体恒定区的氨基酸序列包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2/G4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，优选IgG1或IgG4。

[0154] 在另一个实施方案中，本发明的一种或更多种抗备解素抗体具有修饰的或降低的ADCC和/或CDC活性或者无ADCC和/或CDC活性。在其中一个实施方案中，抗备解素抗体或其
抗原结合部分降低了引起ADCC和CDC安全问题的可能性。

[0155] 在其中一个实施方案中，本发明的一种或更多种抗备解素抗体具有降低的ADCP活性或无ADCP活性。

[0156] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分对备解素抗原‑8 ‑10
的KD为10 M或更小，更优选10 M或更小。KD值是抗体对其靶抗原的结合亲和力的量度。

[0157] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分与来自除人以外的物种的备解素发生交叉反应。

[0158] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分对人备解素具有更高的结合特异性。

[0159] 在其中一个实施方案中，与具有常规Fc片段的抗备解素抗体相比，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分在对象中具有提高的半衰期。

[0160] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分阻断备解素在介导旁路补体途径激活中的功能。

[0161] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分阻止备解素与靶细胞的结合。

[0162] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分可以阻止C3b与靶细胞表面的结合提高。

[0163] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分调节靶细胞表面上的MAC形成，并从而阻止细胞的裂解。

[0164] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分可以使过敏毒素C3a和C5a的形成最小化。

[0165] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分防止靶细胞的补体介导的裂解。

[0166] 在一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分具有改善的循环半衰期。

[0167] 在另一个实施方案中，抗备解素抗体或抗原结合部分能够与猴备解素结合，使得能够通过提供相关的动物药理学和毒理学模型而使药物开发变得容易。

[0168] 在其中一个实施方案中，本发明提供了包含特异性结合人备解素(因子P)的抗备解素抗体和可接受载体的组合物。

[0169] 在另一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分可用于治疗其中备解素的活性是有害的疾病，例如感染、多种癌症、自身免疫病症和其中补体活性被放大的
其他病症例如PNH、aHUS。

[0170] 发明详述

[0171] 在一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分以高亲和力与人备解素结合。

[0172] 抗备解素抗体的氨基酸序列

[0173] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的重链CDR1(在下文中称为CDRH1)具有通式(I)：G‑Y‑X1a‑X2a‑X3a‑X4a‑X5a‑X6a‑X7a的氨基酸序列，其中，[0174] X1a是选自丝氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0175] X2a是选自苯丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；

[0176] X3a是选自苏氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0177] X4a是选自天冬氨酸、丝氨酸和组氨酸的氨基酸；

[0178] X5a是选自酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0179] X6a和X7a中的每一个可以是存在的或不存在的，并且当存在时，是酪氨酸氨基酸。

[0180] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的重链CDR2(在下文中称为CDRH2)具有X1b‑I‑X2b‑X3b‑X4b‑X5b‑X6b‑X7b的氨基酸序列，其中，

[0181] X1b是选自缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和谷氨酸的氨基酸；

[0182] X2b是选自丝氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的氨基酸；

[0183] X3b是选自苏氨酸、脯氨酸和酪氨酸的氨基酸；

[0184] X4b是选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0185] X5b是选自酪氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0186] X6b是选自甘氨酸、天冬氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0187] X7b是选自天冬氨酸、酪氨酸和天冬酰胺的氨基酸。

[0188] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的重链CDR3(在下文中称为CDRH3)具有X1c‑X2c‑X3c‑X4c‑X5c‑X6c‑X7c‑X8c‑X9c‑X10c‑X11c‑X12c‑X13c‑X14c的氨基酸序列，其中，

[0189] X1c是选自天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸；

[0190] X2c是选自亮氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0191] X3c是选自天冬氨酸、酪氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0192] X4c是选自甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；

[0193] X5c是选自酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0194] X6c是选自谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和天冬酰胺的氨基酸；

[0195] X7c是选自丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0196] X8c是选自甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0197] X9c是选自天冬氨酸和苯丙氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0198] X10c和X11c中的每一个是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自酪氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0199] X12c、X13c和X14c中的每一个是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自甲硫氨酸、天冬氨酸和酪氨酸的氨基酸。

[0200] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的轻链CDR1(在下文中称为CDRL1)具有X1d‑X2d‑X3d‑X4d‑X5d‑X6d‑X7d‑X8d‑X9d‑X10d‑X11d‑X12d‑X13d‑X14d‑X15d‑X16d‑X17d的氨基酸序列，其中，

[0201] X1d是选自精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸和谷氨酸的氨基酸；

[0202] X2d是选自脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；

[0203] X3d是选自丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸和色氨酸的氨基酸；

[0204] X4d是选自谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0205] X5d是选自天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0206] X6d是选自异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0207] X7d是选自天冬酰胺、亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸的氨基酸；

[0208] X8d是选自天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和酪氨酸的氨基酸；

[0209] X9d是选自酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、缬氨酸、组氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0210] X10d是选自亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0211] X11d是选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的氨基酸；

[0212] X12d是选自赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺的氨基酸或无氨基酸；

[0213] X13d是选自苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和赖氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0214] X14d、X15d、X16d和X17d中的每一个是存在的或不存在的，并且当存在时，是独立地选自酪氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和丙氨酸的氨基酸。在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的轻链CDR2(在下文中称为CDRL2)具有X1e‑X2e‑X3e‑X4e‑X5e‑X6e‑X7e的氨基酸序列，其中，

[0215] X1e是选自天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0216] X2e是选自天冬酰胺、丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸的氨基酸；

[0217] X3e是选自天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0218] X4e是选自赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和丝氨酸的氨基酸；

[0219] X5e是选自精氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0220] X6e是选自苯丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的氨基酸；

[0221] X7e是选自丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸。

[0222] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的轻链CDR3(在下文中称为CDRL3)具有X1f‑X2f‑X3f‑X4f‑X5f‑X6f‑X7f‑X8f‑X9f‑X10f‑X11f的氨基酸序列，[0223] X1f是选自组氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；

[0224] X2f是选自谷氨酰胺、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸；

[0225] X3f是选自酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；

[0226] X4f是选自亮氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸的氨基酸；

[0227] X5f是选自丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

[0228] X6f是选自丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的氨基酸；

[0229] X7f是选自酪氨酸、脯氨酸和亮氨酸的氨基酸；

[0230] X8f是选自苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸和精氨酸的氨基酸；

[0231] X9f是选自苏氨酸和谷氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0232] X10f是选自丙氨酸和亮氨酸的氨基酸或无氨基酸；

[0233] X11f是缬氨酸氨基酸或无氨基酸。

[0234] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3选自以下在表2中给出的氨基酸序列。

[0235] 表2：抗备解素抗体CDR区的氨基酸序列

[0236]

[0237]

[0238]

[0239] 因此，在另一个实施方案中，本发明提供了抗备解素抗体或其抗原结合部分，其包含：包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列的重链可变区；以及包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列的轻
链可变区，其中：

[0240] (a)重链可变区CDRH3，其包含选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列及其保守修饰；(b)轻链可变区CDRL3，其包含选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列及其保守修饰。

[0241] 在另一个优选实施方案中，重链可变区CDRH2包含选自SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的氨基酸序列及其保守修饰；并且轻链可变区CDRL2包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33和
34的氨基酸序列及其保守修饰。

[0242] 在另一个优选实施方案中，重链可变区CDRH1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4和5的氨基酸序列及其保守修饰；并且轻链可变区CDRL1包含选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28和29的氨基酸序列及其保守修饰。

[0243] 在另一个实施方案中，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其包含：

[0244] (a)重链可变区CDRH1，其包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4和5的氨基酸序列；

[0245] (b)重链可变区CDRH2，其包含选自SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11的氨基酸序列；

[0246] (c)重链可变区CDRH3，其包含选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列；

[0247] (d)轻链可变区CDRL1，其包含选自SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列；

[0248] (e)轻链可变区CDRL2，其包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33和34的氨基酸序列；和[0249] (f)轻链可变区CDRL3，其包含选自SEQ ID NO：35、36、37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列；其中抗体特异性结合备解素，优选人备解素。

[0250] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR选自下表3中给出的氨基酸序列。

[0251] 表3：抗备解素抗体可变区的氨基酸序列

[0252]

[0253]

[0254]

[0255]

[0256] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的重链可变区包含含有选自下表4给出的氨基酸序列的CDRH1、CDRH2和CDRH3。

[0257] 表4：抗备解素抗体HCVR序列的CDR区

[0258]

[0259] 在其中一个实施方案中，本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的轻链可变区具有选自下表5给出的CDRL1、CDRL2和CDRL3的氨基酸序列的组合。

[0260] 表5：抗备解素抗体LCVR序列的CDR区

[0261]

[0262]

[0263]

[0264] 因此，本发明提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗备解素抗体或其抗原结合部分，其中：

[0265] (a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和55的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

[0266] (b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。

[0267] 优选地，本发明提供了包含重链可变区和轻链可变区的抗备解素抗体或其抗原结合部分，其中：

[0268] (a)重链可变区包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和55的氨基酸序列；

[0269] (b)轻链可变区包含选自SEQ ID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的氨基酸序列。

[0270] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的优选组合包含：

[0271] (a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDRH1；

[0272] (b)包含SEQ ID NO：7的重链可变区CDRH2；

[0273] (c)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDRH3；

[0274] (d)包含SEQ ID NO：20的轻链可变区CDRL1；

[0275] (e)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDRL2；和

[0276] (f)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDRL3。

[0277] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0278] (a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDRH1；

[0279] (b)包含SEQ ID NO：7的重链可变区CDRH2；

[0280] (c)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDRH3；

[0281] (d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDRL1；

[0282] (e)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDRL2；和

[0283] (f)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDRL3。

[0284] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0285] (a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDRH1；

[0286] (b)包含SEQ ID NO：7的重链可变区CDRH2；

[0287] (c)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDRH3；

[0288] (d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDRL1；

[0289] (e)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDRL2；和

[0290] (f)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDRL3。

[0291] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0292] (a)包含SEQ ID NO：2的重链可变区CDRH1；

[0293] (b)包含SEQ ID NO：8的重链可变区CDRH2；

[0294] (c)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDRH3；

[0295] (d)包含SEQ ID NO：20的轻链可变区CDRL1；

[0296] (e)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDRL2；和

[0297] (f)包含SEQ ID NO：36的轻链可变区CDRL3。

[0298] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0299] (a)包含SEQ ID NO：3的重链可变区CDRH1；

[0300] (b)包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDRH2；

[0301] (c)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDRH3；

[0302] (d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDRL1；

[0303] (e)包含SEQ ID NO：33的轻链可变区CDRL2；和

[0304] (f)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDRL3。

[0305] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0306] (a)包含SEQ ID NO：4的重链可变区CDRH1；

[0307] (b)包含SEQ ID NO：10的重链可变区CDRH2；

[0308] (c)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDRH3；

[0309] (d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDRL1；

[0310] (e)包含SEQ ID NO：34的轻链可变区CDRL2；和

[0311] (f)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDRL3。

[0312] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0313] (a)包含SEQ ID NO：5的重链可变区CDRH1；

[0314] (b)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDRH2；

[0315] (c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDRH3；

[0316] (d)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDRL1；

[0317] (e)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDRL2；和

[0318] (f)包含SEQ ID NO：41的轻链可变区CDRL3。

[0319] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0320] (a)包含SEQ ID NO：5的重链可变区CDRH1；

[0321] (b)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDRH2；

[0322] (c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDRH3；

[0323] (d)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDRL1；

[0324] (e)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDRL2；和

[0325] (f)包含SEQ ID NO：41的轻链可变区CDRL3。

[0326] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的CDR的另一种优选组合包含：

[0327] (a)包含SEQ ID NO：1的重链可变区CDRH1；

[0328] (b)包含SEQ ID NO：6的重链可变区CDRH2；

[0329] (c)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDRH3；

[0330] (d)包含SEQ ID NO：19的轻链可变区CDRL1；

[0331] (e)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDRL2；和

[0332] (f)包含SEQ ID NO：35的轻链可变区CDRL3。

[0333] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的一种优选组合包含：

[0334] (a)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的重链可变区；和

[0335] (b)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的轻链可变区。

[0336] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0337] (a)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的重链可变区；和

[0338] (b)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的轻链可变区。

[0339] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0340] (a)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的重链可变区；和

[0341] (b)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的轻链可变区。

[0342] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0343] (a)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的重链可变区；和

[0344] (b)包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列的轻链可变区。

[0345] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0346] (a)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区；和

[0347] (b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链可变区。

[0348] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0349] (a)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区；和

[0350] (b)包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列的轻链可变区。

[0351] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0352] (a)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区；和

[0353] (b)包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列的轻链可变区。

[0354] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0355] (a)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的重链可变区；和

[0356] (b)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的轻链可变区。

[0357] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0358] (a)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的重链可变区；和

[0359] (b)包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的轻链可变区。

[0360] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0361] (a)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的重链可变区；和

[0362] (b)包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链可变区。

[0363] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0364] (a)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链可变区；和

[0365] (b)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链可变区。

[0366] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0367] (a)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的重链可变区；和

[0368] (b)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的轻链可变区。

[0369] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0370] (a)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的重链可变区；和

[0371] (b)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的轻链可变区。

[0372] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的另一种优选组合包含：

[0373] (a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链可变区；和

[0374] (b)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的轻链可变区。

[0375] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分的HCVR和LCVR的又一种优选组合包含：

[0376] (a)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的重链可变区；和

[0377] (b)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的轻链可变区。

[0378] 根据本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4或IgG2抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并且任选地被修饰以影响功能，例如，以消除残留的效应物功能(例如ADCC和CDC活性)。人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存
在。在一种形式中，抗体包含约150至160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链
二硫键结合在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成由共价偶联
的轻链和重链(半抗体)构成的约75至80kDa的分子。后一种形式即使在亲和纯化之后也极
难分离。第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率是由于但不限于与抗体的铰链区
同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸替换可将第二种形式(6)的
出现显著降低至通常使用人IgG1铰链所观察到的水平。包含本发明的CDR或可变区的全长
抗体在其以IgG4形式开发时还包含所述单个氨基酸替换(即S228P)。

[0379] 在另一个实施方案中，根据本发明的靶向备解素抗原的抗体或其抗原结合部分本质上是鼠的、嵌合的、人的或人源化的，优选本质上是嵌合的或人的或人源化的，更优选本
质上是人源化的。

[0380] 优选地，本申请的抗体，优选单克隆抗体，包括非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式。人源化或CDR移植mAb特别地可用作用于人的治疗剂，因为它们不像小鼠抗体一样迅速从循环中清除，并且通常不引起不良免疫反应。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其
中的一个或更多个氨基酸残基。制备人源化抗体的方法通常是本领域公知的。例如，人源化
基本上可按照Winter和同事(7、8、9和10)的方法，通过用啮齿动物框架或CDR序列替换人抗
体的相应序列来进行。在一些实施方案中，非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是其中具有
所期望的特异性、亲和力和结合能力的非人抗体(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类抗体)的
CDR区氨基酸残基被移植到人抗体的框架支架上的人抗体(接受体抗体)。

[0381] 在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或更多个框架区氨基酸残基也被非人抗体的相应氨基酸残基替代(所谓的“回复突变”)。另外，噬菌体展示文库可用于改变抗体序列中
选定位置的氨基酸。人源化抗体的特性也受人框架的选择的影响。此外，可修饰人源化和嵌
合抗体以包含在接受体抗体或供体抗体中不存在的残基，以进一步改善抗体特性，例如如
亲和力或效应物功能。

[0382] 在另一个方面中，根据本发明的抗备解素抗体具有提高的FcRn结合和提高的半衰期，以及修饰的或降低的ADCC和/或CDC活性或者无ADCC和/或CDC活性。与已知的抗备解素
抗体相比，根据本发明的抗备解素抗体可以以降低的剂量和更好的给药方案(因为半衰期
提高)来给予对象。在其中一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体具有含P329G和/或
M428L和N434S突变的IgG4的恒定区的氨基酸序列。在IgG4恒定区中具有提及的所有三个突
变的抗备解素抗体的恒定区在本文中称为IgG4(GLS)。在一个方面中，根据本发明的抗备解
素抗体具有降低的ADCP活性或无ADCP活性。

[0383] 在其中一个实施方案中，根据本发明的抗备解素抗体是单克隆抗体或双特异性抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。

[0384] 抗体的制备

[0385] 根据本发明的抗体是使用本领域公知的标准方法在小鼠中产生的。本发明的单克隆抗体被转化成用于治疗用途的人源化版本。被给予了本文中提供的指导的本领域普通技
术人员可容易地产生本文中讨论的杂交瘤细胞系。在从经免疫接种小鼠的脾RNA扩增可变
重(VH)和可变轻(VL)基因之后，进行了抗备解素scFv噬菌体展示文库的开发。如本文中所
述，VH和VL二者均与肽接头连接并克隆到噬菌体展示载体中。进行了针对特定备解素结合物
的淘选和筛选。

[0386] CDR和框架区中的进一步修饰

[0387] 本发明涵盖在本文中所述的CDR和/或可变区中具有一个或更多个突变的抗体，其可具有与针对本文中提供的抗体所述的类似的功能特征和生物活性。这些突变是本领域技
术人员已知的并且完全在本发明的范围内。

[0388] 恒定区中的进一步修饰

[0389] 本发明涵盖在铰链区、CH2或CH3区具有一个或更多个突变的抗体，所述突变可能是例如改善抗体在对象中的循环半衰期、完全消除免疫效应物功能、增强效应物功能等所
期望的。这些突变是本领域技术人员已知的(11，12)。

[0390] 免疫缀合物和双特异性抗体

[0391] 还可开发包含本发明的抗体或其抗原结合部分的免疫缀合物，所述抗体或其抗原结合部分与另一种治疗剂例如细胞毒素或放射性同位素连接。可开发包含本发明的抗体或
其抗原结合部分的双特异性分子，所述抗体或其抗原结合部分与具有与所述抗体或其抗原
结合部分不同的结合特异性的第二功能部分连接。在其中一个实施方案中，根据本发明的
第二功能部分可与选自C3、C5、C5a、C5b、C3a、C3b、因子B、因子H和C1q的抗原结合。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。

[0392] 编码抗备解素抗体的核酸分子、载体和宿主细胞

[0393] 在一个实施方案中，本发明提供了编码抗体或其抗原结合部分的核酸分子以及包含这样的核酸的表达载体和包含这样的表达载体的宿主细胞。在本申请中，pZRCIII载体用
于克隆和表达本发明的抗备解素抗体。pZRCIII载体在专利文件WO 2012/046255A2中进行
了描述。根据本发明的宿主细胞是原核或真核细胞，优选地宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)
细胞或哺乳动物细胞，例如CHO细胞。

[0394] 本发明的抗备解素与其他药物的组合

[0395] 本发明提供了包含至少两种或更多种抗体或其抗原结合部分的组合，其中至少一种抗体或其抗原结合部分是本发明的抗备解素抗体。根据本发明的组合可包含与本发明的
抗备解素抗体或其抗原结合部分组合的选自以下的第二抗体或其抗原结合部分：抗C3抗
体、抗C5抗体、抗C5a抗体、抗C5b抗体、抗C3a抗体、抗C3b抗体、抗因子B抗体、依库珠单抗、兰帕利珠单抗、雷夫利珠单抗、抗备解素抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含抗备
解素抗体或其抗原结合部分和肽的组合，或者包含抗备解素抗体或其抗原结合部分和细胞
因子(优选白介素)的组合。

[0396] 药物组合物

[0397] 可开发药物组合物，其包含与可药用载体一起配制的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分的一种或组合。这样的组合物可包含(例如两种或更多种不同的)本发明的抗
体、或免疫缀合物或双特异性分子中的一种或组合。例如，本发明的药物组合物可包含与靶
抗原上的不同表位或不同靶抗原上的不同表位结合、或者具有互补活性的抗体(或免疫缀
合物或双特异性抗体)的组合。

[0398] 治疗用途

[0399] 根据本发明的抗备解素抗体或其抗原结合部分或者组合、或者根据本发明的双特异性抗体或免疫缀合物可在用于治疗通过旁路补体途径的组分和/或通过旁路补体途径激
活之后产生的因子直接或间接地介导的疾病的治疗方法中使用。

[0400] 在本发明的一个实施方案中，抗体可用于在患有疾病的对象，包括人中通过体内旁路途径抑制补体激活，所述疾病例如但不限于血液学病症、慢性肾病症、眼部炎性病症、
多种癌症、自身免疫病和炎症。

[0401] 在本发明的一个实施方案中，抗体可用于在患有疾病和病症的对象，包括人中通过体内旁路途径抑制补体激活，所述疾病和病症例如但不限于非典型溶血性尿毒综合征、
造血干细胞(haematopoietic stem cell，HSC)移植相关TMA(transplant‑associated 
TMA，TA‑TMA)；妊娠相关HELLP(溶血、肝酶升高、低血小板)综合征；以及感染相关或药物相关TMA、动脉粥样硬化、阵发性睡眠性血红蛋白尿、缺血再灌注(ischaemia‑reperfusion，I/R)器官损伤、年龄相关性黄斑变性(age‑related macular degeneration，AMD)、地理性萎
缩、急性心肌梗死后的缺血再灌注、过敏性紫癜性肾炎(Henoch‑Schonlein purpura 
nephritis)、免疫复合体血管炎、类风湿性关节炎、动脉炎、动脉瘤、卒中、心肌病、脓毒症相关炎症、血液透析引起的炎症、C3肾小球病、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克和肠缺血、移植排斥、心脏手术、经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous 
transluminal coronary angioplasty，PTCA)、自然流产、神经元损伤、严重急性呼吸综合
征例如冠状病毒疾病2019(COVID‑19)、中东呼吸综合征、病毒性肺炎、脊髓损伤、重症肌无力、亨廷顿病(Huntington’s disease)、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化、吉兰巴雷综合征
(Guillain Barre syndrome)、帕金森病(Parkinson’s disease)、阿尔茨海默病
(Alzheimer’s disease)、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、慢性阻塞性肺病、输血相关的急性肺损伤、急性肺损伤、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s disease)、心肌梗死、心肺转流术后炎症(post‑cardiopulmonary bypass inflammation)、器官移植、牙周病、心肺转流术、感染性休克(septic shock)、移植排斥、异种移植、烧伤、系统性红斑狼疮、膜性肾炎、贝格尔病(Berger’s disease)、银屑病、类天疱疮、皮肌炎、抗磷脂综合征、炎性肠病、血液透析、白细胞去除术(leukopheresis)、血浆去除术(plasmapheresis)、肝素诱导的体外膜氧合LDL
沉淀、体外膜氧合和黄斑变性。通过向对象施用抗体来实现对旁路补体途径激活的体内抑
制。

[0402] 本发明通过以下非限制性实施例进行举例说明，所述实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。

[0403] 实施例

[0404] 提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何进行本文中要求保护的方法和抗体的公开内容和描述。以下实施例仅旨在纯粹举例说明，并不旨在限制本公开内
容的范围。本发明的其他抗体可使用如提供的实施例中所述的方法在适当修改的情况下来
开发。这样的修改对于本领域技术人员是公知的。

[0405] 实施例1：用人备解素抗原对小鼠进行免疫接种以用于产生结合物

[0406] 四只健康的雌性BALB/c小鼠被用于免疫接种研究。其中两只被保持为安慰剂对照，在其中仅使用PBS进行免疫接种。另外两只小鼠用人备解素进行免疫接种。为了表明该
抗原制剂能够在高度敏感的物种中诱导抗备解素抗体，使用一只兔作为另一个对照，其用
于用相同的抗原制剂进行免疫接种以监测在免疫接种过程的不同阶段的免疫应答。在开始
免疫接种研究之前，所有动物均在动物研究设施中适应2天。使用可商购的人备解素蛋白
(Quidel目录#A412)进行免疫接种。蛋白质乳剂通过以下制备：将400μg人备解素(在400μL PBS中)和400μL完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)以800μL的总体积在经
硅化处理的5mL螺旋盖玻璃小瓶中混合，并将混合物涡旋10至15分钟用于制备乳剂。在第0
天，在每只小鼠背部的四个部位处皮下注射单剂量的在200μl体积中的100μg乳化蛋白(0.5
μg/μL)。

[0407] 同时，在第0天，在兔背部的4个部位处皮下注射在400μL中的200μg蛋白质乳剂(0.5μg/μL)。

[0408] 使用不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)进行随后的免疫接种(加强剂)。在每个免疫接种之后，以15天的间隔给予动物4次加强剂。通过将200μg备解素(在400μL PBS中)和400μL不完全弗氏佐剂(IFA)混合来制备蛋白质乳剂。将混合物在经硅
化处理的5mL螺旋盖玻璃小瓶中涡旋10至15分钟用于制备乳剂。小鼠中的各加强剂剂量均
作为单剂量的在200μL中的50μg蛋白质乳剂来施用。兔中的加强剂剂量用在400μL中的100μg蛋白质来给予。每天监测小鼠和兔的健康。为了测试针对人备解素抗原产生的抗体效价，
在每次加强剂之前4至5天从兔中收集血液。从血液中制备血清并将其用于ELISA以测定人
备解素特异性抗体。在第4次加强剂剂量之后15天处死小鼠并收集脾，用于杂交瘤的产生或
用于制备用于噬菌体文库产生的总RNA。

[0409] 实施例2：在小鼠免疫接种之后产生抗备解素结合物

[0410] 杂交瘤的产生

[0411] 在第四次加强剂之后，处死小鼠，取出脾并切成小块并使其通过细胞过滤器。随后将细胞重悬在具有10％FBS的冷的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640中并在
300g下离心5分钟。将细胞沉淀物重悬在具有1％FBS的RPMI 1640中，通过50μM注射器过滤
器(BD#340603)过滤并通过离心收集。

[0412] 使用基于聚乙二醇的方案进行杂交瘤融合，如前所述(13，14)。单细胞悬液如上所述从经免疫接种的小鼠的脾中制备，并用于与Sp2/0骨髓瘤细胞(ATCC)融合。使用聚乙二醇
(M.W.1500，Sigma)融合Sp2/0与脾细胞(1∶5比例)。在融合之后，将细胞在补充有10％胎牛
血清(Gibco)的RPMI培养基(Sigma)和1×次黄嘌呤‑氨基蝶呤‑胸苷培养基(hypoxanthine‑
6
aminopterin‑thymidine medium，HAT)(Sigma)中调整至0.5×10 个细胞/mL的浓度，以用
于选择杂交瘤。将200微升的该细胞悬液添加至96孔培养板的每个孔以产生微型池
(minipool)。在约十天之后，在ELISA中测试培养物上清液与纯化的人天然备解素的结合。
备解素反应性微型池进一步扩展至24孔和6孔板以及T型烧瓶。在ELISA中测试来自所选微
型池的培养物上清液的抗备解素抗体样品与人备解素的结合。

[0413] 根据ELISA中人备解素反应性的结果，进一步筛选出(short‑list)11个微型池以进行单细胞有限稀释。对于有限稀释任务，将微型池以96孔培养板中1个细胞/孔的稀释度
平板接种在补充有10％胎牛血清的RPMI培养基中。允许细胞进一步生长并扩展至24孔和6
孔板以及T型烧瓶。在ELISA中再次测试细胞培养物上清液与人备解素的结合。使104种所选
择的杂交瘤克隆在无血清生产培养基(BD细胞mAb培养基，Quantum Yield；BD Bioscience)
中生长，并收集培养物上清液用于通过蛋白A亲和色谱来纯化抗体。在基于SPR的测定中，进
一步测试了这些经纯化的抗体候选物的结合亲和力。发现命名为103B2(VH SEQ ID 54；VL 
SEQ ID 66)、124F9(VH SEQ ID 53；VL SEQ ID 65)、137D4(VH SEQ ID 52；VL SEQ ID 64)和
149F8(VH SEQ ID 51；VL SEQ ID 63)的四种杂交瘤来源抗备解素克隆是整个组中表现最好
的。

[0414] 发现所有4种克隆显示出针对人备解素的在nM范围内的良好的亲和力(表6)。将抗备解素杂交瘤mAb 103B2、124F9、137D4和149F8以及来自噬菌体展示文库的其他抗备解素
结合物进一步人源化，并在实施例6中描述。

[0415] 表6：针对人备解素的抗备解素抗体的动力学速率常数

[0416]样品ID ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
103B2 6.96E+05 5.09E‑04 7.31E‑10
124F9 4.50E+05 3.62E‑03 8.04E‑09
137D4 3.53E+05 3.02E‑04 8.54E‑10
149F8 1.04E+06 7.87E‑03 7.60E‑09

[0417] 通过噬菌体展示法产生ScFv文库

[0418] 对于scFv文库产生，遵循实施例1中所述的免疫接种方案。在第4次加强之后15天收获来自一只处死小鼠的脾，并将其直接转移到50mL聚丙烯管中的10mL生理盐水中。随后
在经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的1.6mL离心管中称量脾。如下使用Trizol法分离总的RNA。
维持4℃的温度，首先在培养皿中用手术刀片切碎脾，直至形成均匀的脾细胞悬液。将
2mLtrizol添加至90至130mg脾，随后用移液管混合并且随后通过涡旋混合。重复切碎过程，
直至形成脾细胞与trizol的均匀混合物。在此之后，将氯仿(200μL)添加至匀浆，混合并在
室温下孵育5分钟。随后将匀浆离心并取上清液并添加等量的异丙醇用于沉淀RNA。将RNA悬
液再次离心，并将沉淀物用冰冷的70％乙醇洗涤。在洗涤3次之后，将包含总的RNA的沉淀物
重悬在经DEPC处理的水中，并在4℃下放置过夜以进行溶解。

[0419] 随后按照制造商的说明( mRNA分离系统，目录：Z5300，Promega)从TM
总RNA中分离mRNA。使用SuperScript  III第一链合成系统(目录号：18080051，
Invitrogen)按照制造商的说明将分离的mRNA用于cDNA制备。

[0420] VH和VL的扩增：使用PCR法按照制造商的说明将引物组(小鼠IgG文库引物组，目录号：F2010，Progen)用于扩增来自cDNA的重链和轻链可变区。经扩增的VH和VL片段在琼脂糖
凝胶上进行分析并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen目录号28706)从凝胶中纯化。

[0421] 随后将经纯化的VH和VL相继顺序地克隆到噬菌粒载体(pSEX81，目录号：PR3005，Progen)中。在第一连接中，将VH片段和载体二者用NcoI和HindIII进行限制性消化，从凝胶
中纯化并连接在一起。将连接产物转化到电感受态TG1细胞(目录号：60502‑1，Lucigen)中。
将包含VL片段和VH片段的载体DNA用MluI和NotI限制酶再次进行限制性消化，纯化并连接在
一起。如上将包含VH和VL片段二者的载体转化到电感受态细胞中。将经转化细胞平板接种在
包含氨苄青霉素(100μg/mL)的2×YT琼脂板上。将由此产生的经转化细胞的文库从琼脂板
上刮下并在‑80℃下储存在50％甘油中直至进一步使用。

[0422] 实施例3：scFv噬菌体从scFv文库的产生及其纯化

[0423] 将来自上述文库的甘油储液的细胞以0.06OD600的初始浓度接种到包含具有羧苄青霉素或氨苄青霉素(100μL/mL)的2×YT培养基的烧瓶中。使培养物在37℃下在以250rpm
摇动的情况下生长，直至它们达到多至约0.4至0.6的OD600。随后将辅助噬菌体VCSM13
(Agilent，目录号200251)或M13KO7(GE Healthcare，目录号27152401)以20的感染复数
(multiplicity of infection，MOI)添加至培养物，并且首先在不摇动的情况下在37℃下
孵育40分钟，随后在37℃下在摇动的情况下孵育另外40分钟。随后将卡那霉素添加至培养
基并使培养物在26℃下在150rpm下生长过夜。在4000g下对过夜的噬菌体培养物进行离心
并弃去细胞沉淀物。将比例为1∶5的PEG(20％)/NaCl(2.5M)溶液添加至上清液以沉淀噬菌
体。将重悬的溶液在冰上孵育20分钟，随后在4℃下在14,000g下离心15分钟。弃去上清液，
并将沉淀物重悬在1mL具有0.01％叠氮化钠的无菌PBS中。将噬菌体储存在4℃下直至进一
步使用。

[0424] 实施例4：对表达抗备解素scFv的噬菌体的生物淘选

[0425] 针对抗备解素结合物，筛选实施例3中制备的ScFv文库(1×1012pfu)。针对备解素抗原的第一轮淘选是使用经抗原固定的免疫管(Quidel，USA)进行的，该免疫管是通过使其
与碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中的5μg/mL备解素溶液一起在4℃下孵育过夜来准备的。将
免疫管用PBS洗涤3次，并随后在恒定旋转的情况下在25℃下与PBS中的噬菌体一起孵育2小
时。将管用4mL含吐温20(0.1％)的PBS洗涤十次，并随后用PBS洗涤10次。将结合的噬菌体用
甘氨酸‑HCL pH 2.1(0.1M)进行洗脱。洗脱的噬菌体通过感染TG1大肠杆菌细胞来拯救，进
行平板接种，并如实施例3中所述产生噬菌体。

[0426] 第二轮和第三轮淘选是在经备解素抗原包被的免疫管上以这样的方式进行的：分11 10
别使用来自第一轮淘选(1×10 CFU)和第二轮淘选(1×10 CFU)的输出噬菌体作为用于第
二轮和第三轮淘选的输入噬菌体。将在第三轮淘选之后的噬菌体如前所述感染到TG1细胞
中，并将噬菌粒DNA分离以用于在合适的表达载体中克隆scFv。

[0427] 实施例5：筛选单独的scFv克隆作为可溶性抗体片段蛋白

[0428] 将来自在3轮淘选之后产生的富集文库的scFv基因克隆到表达载体pOPE101(Progen，Germany)中，使得可产生单独的scFv克隆作为经HIS标记的融合产物。载体DNA
(pOPE101)和噬菌粒DNA二者均用限制酶(NcoI和NotI)消化，以分别分离载体和scFv基因。
将经限制性消化的载体和scFv基因二者连接并转化到TG1电感受态细胞中。将经转化细胞
平板接种到包含羧苄青霉素抗生素的2×YT琼脂板上。单独的克隆是从2×YT琼脂板中挑选
出的，并在具有5mL包含羧苄青霉素或氨苄青霉素(100μL/mL)的2×YT培养基的15mL管中在
32℃下在200rpm下培养过夜。第二天，将培养物以1∶200的体积比重新接种到包含羧苄青霉
素(100μg/mL)和葡萄糖(0.1％)的新鲜2×YT培养基中。使培养物生长直至OD600达到约0.6
至0.8。在这之后，将1mM异丙基β‑D‑1‑硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)添加至培养物，并在30℃下在200rpm下生长过夜。将过夜的培养物在10,800g下旋转15分钟并去除上清液。将细胞沉
淀物以原始培养物的1/20体积重悬在缓冲液(30mM Tris‑Cl，pH 7.0，20％蔗糖和1mM 
EDTA)中，并在冰上孵育30分钟。将重悬的沉淀物在10,800g下离心15分钟，并收集上清液作
为包含可溶性经His标记的scFv的周质级分。该周质级分用于免疫测定以研究备解素结合。

[0429] 将备解素抗原包被在聚苯乙烯板上(100ng/100μL/孔)，在4℃下过夜。在洗涤板两次之后，添加周质级分(1/10v/v)并在25℃下孵育1小时。用PBST洗涤板4次，随后添加100μL(1∶5000v/v)小鼠抗HIS抗体(GE Healthcare，目录号27471001)，持续1小时。如前所述再次洗涤板，并将HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(Santa Cruz Biotech，目录号SC‑2031)添加(1∶
5000)至板并在25℃下孵育另外1小时。在该孵育结束时，在四次洗涤之后添加底物3，3’，5，
5’‑四甲基联苯胺(TMB)。在显色5分钟之后，使用TECAN M1000pro测量450nm处
的吸光度。如果OD信号是背景(空白孔)的至少三倍(即信背比≥3)，则单独的克隆被认为是
阳性的。

[0430] 实施例6：杂交瘤和噬菌体展示文库来源的鼠抗备解素单克隆抗体的人源化

[0431] 通过CDR移植法将鼠结合物人源化，其中用人抗体的FR区替代来自鼠抗体的框架区(FR1‑4)。在移植之前，基于鼠蛋白质序列与人种系抗体的最接近匹配来鉴定来自人抗体
的FR。在本发明中，将鼠结合物的VH和VL(SEQ ID No 49和62)人源化，并随后与IgG4恒定区
重组以获得全长人源化抗体。之后，将FR中的少数氨基酸残基突变回鼠序列中存在的原始
氨基酸以恢复其功能活性(SEQ ID 55和56)。(15，16)

[0432] 类似地，其他鼠抗体的VH(SEQ ID No 50、51、52、53和54)和VL(SEQ ID No 63、64、65和66)通过CDR移植使用它们与人种系数据库中的人FR的最佳匹配模板来人源化，以获得
人源化VH(SEQ ID No 44、45、46、47和48)和VL(SEQ ID No 57、58、60和61)。

[0433] 实施例7：双组装的pZRCIII hyg抗备解素IgG4载体的构建

[0434] 从Geneart，Germany获得化学合成基因，其包括：具有XhoI和KpnI突出端的一个λ轻链基因[E12 LC(SEQ ID No.87)]和三个κ轻链基因[P13(SEQ ID No.84)；P14 LC(SEQ ID 
No.85)；P15 LC(SEQ ID No.86)]，以及具有SalI和ApaI突出端的五个重链可变区[P12HC
(SEQ ID No.88)、P13HC(SEQ ID No.89)、P14HC(SEQ ID No.90)、P15HC(SEQ ID No.91)和
E12HC(SEQ ID No.92)](在pMA/pMK载体中克隆)。

[0435] 在用XhoI和KpnI消化之后，将所有四种轻链基因(SEQ ID 84、85、86和87)从这些构建体中分离。将pZRCIIIHyg‑IgG4克隆载体用XhoI和KpnI消化，并将线性化的载体单独地
与经消化的LC基因连接。pZRCIII载体如专利文献WO 2012/046255A2中所述用IgG4恒定区
制备。将连接产物在大肠杆菌Top10F’中转化，并基于抗生素抗性对转化体评分。将克隆通
过限制性消化和Sanger法的DNA测序进行分析。这些在转录组装体1中包含轻链基因的中间
载体被命名为pZRCIII Hyg P13LC、pZRCIII Hyg P14LC、pZRCIII Hyg P15LC和pZRCIII 
Hyg E12LC。

[0436] 将从中间LC载体pZRCIII Hyg P13LC、pZRCIII Hyg P14LC、pZRCIII Hyg P15LC和pZRCIII Hyg E12LC制备的质粒DNA用SalI和ApaI消化，以允许对重链可变区进行克隆，该
重链可变区与已经存在于载体中的IgG4恒定区(SEQ ID No.93)同框。将包含重链可变区的
pMA/pMK质粒DNA(获自Geneart)用SalI和ApaI消化。将这些经消化的重链可变区与用SalI
和ApaI消化的中间载体以以下列组合连接——P13 LC(SEQ ID 84)与P12 HC(SEQ ID 88)；
P13 LC(SEQ ID 84)与P13 HC(SEQ ID 89)；P14LC(SEQ ID 85)与P14HC(SEQ ID 90)；P15 
LC(SEQ ID 86)与P15 HC(SEQ ID 91)，和E12 LC(SEQ ID 87)与E12 HC(SEQ ID 92)。将连
接产物在大肠杆菌Top10F’中转化，并基于卡那霉素抗性对转化体评分。基于限制性消化和
Sangers测序确认克隆，并将其命名为pZRCIII Hyg P13LC‑P12HC(相应的VH和VL的氨基酸序
列分别是SEQ ID No.45和57；在本文中称为P12)、pZRCIII Hyg P13LC‑P13HC(相应的VH和VL的氨基酸序列分别是SEQ ID No.46和57；在本文中称为P13)、pZRCIII Hyg P14LC‑P14HC
(相应的VH和VL的氨基酸序列分别是SEQ ID No.47和60；在本文中称为P14)、pZRCIII Hyg 
P15LC‑P15HC(相应的VH和VL的氨基酸序列分别是SEQ ID No.48和61；在本文中称为P15)以
及pZRCIII Hyg E12LC‑E12HC(相应的VH和VL的氨基酸序列分别是SEQ ID No.44和56；在本
文中称为P11)。

[0437] 实施例8：具有经IgG4(GLS)修饰的恒定区的双载体的制备

[0438] 预计ADCC或CDC效应物功能对于抗备解素mAb是不需要的。为了具有至少这些效应物功能，将三个突变即P329G、M428L和N434S并入到在上述实施例中制备的抗备解素mAb构
建体中。包含并入IgG4恒定区中的所有三个上述突变的mAb候选物被称为IgG4(GLS)。如以上
实施例中所述的pZRCIII hyg P15LC‑P15HC载体构建体的恒定区被IgG4(GLS)(SEQ ID 
No.94)替换。为了制备IgG4(GLS)恒定区片段(SEQ ID NO.96)，通过诱变PCR将三个突变即
P329G、M428L和N434S并入IgG4恒定区。用限制酶ApaI和NotI消化在5’端有ApaI突出端和在
3’端有NotI突出端的约976个碱基对的该经纯化的PCR片段(SEQ ID No.94)和pZRCIII Hyg 
P15 LC‑P15HC。用ApaI和NotI对载体的消化释放出约976bp的IgG4恒定区和约12,174bp的
较大片段，其包含剩余的载体元件。将约12,174bp片段进行凝胶提取和纯化。类似地，将经
消化的PCR产物纯化并与经纯化的载体片段连接。将连接产物在大肠杆菌Top10F’中转化。
基于卡那霉素抗性对转化体评分。将连接产物在大肠杆菌Top10F’中转化。基于卡那霉素抗
性对转化体评分。通过限制性消化和Sanger测序确认克隆，并将其命名为pZRCIII Hyg 
P15LC‑P15HC(IgG4GLS)[相应的VH和VL的氨基酸序列分别是SEQ ID No.48和61；相应的Fc区
的氨基酸序列为SEQ ID NO.96；本文称为P15(GLS)]。

[0439] 实施例9：表达人源化抗备解素抗体(IgG4载体)的CHO‑S细胞系的产生

[0440] 本实施例描述了表达全长人源化抗备解素抗体的转染池(transfected pool)的生成。使用下述载体构建体进行转染。

[0441] IgG4哺乳动物载体构建体

[0442] pZRCIII Hyg P13LC‑P12HC、pZRCIII Hyg P13LC‑P13HC、pZRCIII Hyg P14LC‑P14HC、pZRCIII Hyg P15LC‑P15HC、pZRCIII Hyg E12LC‑E12HC和pZRCIII Hyg P15LC‑
P15HC(IgG4 GLS)。在转染之前用AscI限制酶将质粒线性化。中国仓鼠卵巢是用于表达单克
隆抗体的合适宿主之一。Freestyle CHO‑S细胞(Invitrogen)被用作用于转染的宿主。在转
染之前约24小时接种细胞(50万个/mL)，以获得在指数期的细胞。使用Neon转染系统
(Invitrogen)，遵循制造商的说明，通过电穿孔技术进行转染。转染之后，将细胞平板接种
在包含1mL预先温热的ProCHO5无血清培养基(Lonza，Switzerland)的24孔细胞培养板中。
将细胞在5％CO2的存在下于37℃下在加湿培养箱中进行孵育。在24孔培养板中的ProCHO5
培养基中在600μg/mL潮霉素(Invitrogen)的存在下对这些转染池进行选择。在选择过程期
间，定期监测所有池的细胞数量，并提供定期更换的培养基。一旦完成选择，就将细胞进一
步扩展至培养板、T型烧瓶和培养管(TPP)。

[0443] 在摇瓶(Corning)中对所有所选择的池进行补料‑分批培养，以用于所有抗备解素6
抗体候选物的重组蛋白产生。将细胞以0.3×10 个细胞/mL的密度接种在来自Lonza的
Power CHO‑2 CD生产培养基中。将烧瓶在37℃温度、在5％CO2水平下以110RPM的摇动速度
在加湿的Kuhner摇床中进行孵育。在使用来自Hyclone，GE的化学成分确定的补料进行的对
所有池的培养期间，遵循固定的每日补料方案。在培养72小时之后开始补料并持续到收获
该批次。

[0444] 收集培养物上清液用于通过蛋白A亲和色谱进行的抗体纯化。将这些经纯化的抗体候选物在体外进一步测试。

[0445] 实施例10：使用表面等离子体共振法确定抗备解素候选物与备解素结合的动力学速率常数

[0446] 使用ProteOn XPR36(Bio‑Rad)通过基于表面等离子共振的测量结果确定抗备解素候选物与天然的经纯化人备解素(Quidel；目录号：A412)结合的动力学速率常数。所有结
合测量均在25℃下在PBS(pH 7.4，0.005％表面活性剂P20)中进行。为了测量备解素与mAb
的结合速率常数，使用胺偶联化学将人备解素固定在GLC传感器芯片上。制备亲和纯化的
mAb的五种稀释液，并以100μL/分钟的流量注射至流动池上。使用在ProteOn系统中集成的
数据拟合程序对传感图形式的数据进行分析。在表7中提供了受试抗体的就KD值而言的结
合亲和力。

[0447] 表7：针对人备解素的人源化抗备解素抗体的动力学速率常数

[0448]

[0449] 实施例11：抗备解素抗体针对重组人新生儿Fc受体(Recombinant  Human neonatal Fc receptor，rhFcRn)的动力学速率常数的确定

[0450] 使用ProteOn XPR36(Bio‑Rad)通过基于表面等离子共振的测量确定抗体与重组人新生儿Fc受体(hFcRn)结合的动力学常数。遵循制造商的说明将重组rhFcRn受体(Sino 
Biologics)固定在GLC芯片上。为了测量结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，制备了经
亲和纯化的抗体的五种稀释液，并以100μL/分钟的流量注射，其中结合时间为180秒并且解
离时间为600秒。反应在25℃下在PBS(pH 6.0，0.005％表面活性剂P20)中进行。每次样品运
行之后，使用PBS(pH 7.4)使芯片表面再生。使用ProteOn系统中的数据拟合程序对传感图
形式的数据进行分析。rhFcRn与P15抗体和P15(GLS)抗体结合的动力学常数在表8中示出。
观察到P15(GLS)具有针对rhFcRn的更高的亲和力(KD)。

[0451] 表8：人源化抗备解素抗体针对hFcRn的动力学速率常数

[0452]

[0453] 实施例12：通过ELISA确定鼠抗备解素mAb与天然人备解素的结合

[0454] 将F16 Maxisorp Immuno module(Nunc)96微孔板的孔通过添加100μL的250ng/mL经纯化的人P因子(Quidel)而在4℃的加湿室中包被过夜。在通过轻弹该板来除去包被溶液
之后，将300μL的封闭溶液——PBST(包含0.05％吐温20的PBS)中的5％脱脂乳添加至每个
孔，持续1小时，以封闭非特异性位点。一小时之后，然后将孔用洗涤缓冲液(PBST中的0.5％脱脂乳)洗涤。收集来自每个融合孔的50微升培养物上清液并用ELISA测定稀释剂(PBS中的
0.5％脱脂乳)稀释。在孵育一小时之后，将孔用洗涤缓冲液洗涤。然后通过与在测定稀释剂
中以1∶5000稀释度制备的经辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合的山羊
抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology，Inc)的反应来检测结合的鼠抗体。随后使用PBST
洗涤4次。然后将包含0.1％3，3，5，5四甲基联苯胺(Sigma)和0.0003％过氧化氢(Sigma)的
过氧化物酶底物溶液添加至孔用于显色，持续30分钟。通过添加100μL的1M H2SO4终止反应。
用ELISA读取器(Tecan Lifesciences)读取反应混合物在450nm处的OD。

[0455] 实施例13：通过ELISA确定人源化抗备解素mAb与天然人备解素的结合

[0456] 在人源化之后，合成抗体基因，将其转染、表达和纯化，如之前在实施例7和9中所说明的。测试经纯化的抗体蛋白候选物即P13、P14和P15对人备解素抗原的结合特异性。简
言之，为了测试抗备解素抗体与天然人备解素的结合，将板用在碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 
9.6)中的人备解素抗原(Quidel目录号.A412)以浓度为50ng/50μL/孔进行包被。将板在4℃
下孵育过夜，然后洗涤并用5％脱脂乳(1×PBS，pH 7.4)封闭。将封闭的板用1×PBS洗涤，并
随后将经纯化的mAb添加至抗原包被的孔(0.5至1μg/100μL/孔)，并在摇动条件下在37℃下
孵育1小时。将板用PBST(1×PBS中的0.1％吐温20，pH 7.4)洗涤三次。将辣根过氧化物酶
(HRP)缀合的山羊抗人IgG(SantaCruz，目录号.sc2453)以1∶10000稀释度添加至每个孔
(100μL/孔)，然后在摇动条件下在37℃下孵育1小时。将板用PBST(1×PBS中的0.1％吐温
20，pH 7.4)洗涤，然后用1×PBS洗涤2次。随后，将邻苯二胺二盐酸盐(o‑phenylenediamine dihydrochloride，OPD)/H2O2(100μL/孔)添加至孔，然后在15分钟之后用100μL的1N H2SO4中止反应并在450nm处读取板。如果信背比＞3倍，则认为克隆对于备解素结合呈阳性(图
1)。在SPR(表面等离子共振)中测试阳性克隆的亲和力，并在溶血测定中比较功能活性。

[0457] 实施例14：对筛选出的抗备解素候选物进行溶血测定以确定单独mAb的功能活性

[0458] 使用兔红细胞裂解测定检测抗备解素抗体候选物抑制旁路补体途径的能力，在该测定中，经典补体途径已使用EGTA阻断，并且兔RBC的裂解仅通过NHS中的旁路途径进行，其
中在兔RBC表面形成MAC(17)。预期所期望的抗备解素抗体候选物根据它们对备解素的亲和
力和它们的结合位点来不同程度地抑制该旁路途径。因此，预期根据本发明开发的抗备解
素抗体候选物在人血清存在下可阻止兔RBC的裂解。计算每种抗体的在给定抗体稀释度/浓
度下针对给定单克隆抗体的溶血作用抑制百分比，并在所有稀释度下进行测试并在个体候
选物之间进行比较。

[0459] 将新鲜的兔RBC收集在Alsever溶液中并用测定缓冲液(150mM NaCl、20mM HEPES、25mM MgCl2和20mM EGTA)洗涤5次。将经洗涤的RBC以所需浓度重悬在测定缓冲液中。将不
同浓度的每种抗备解素抗体样品(人源化抗备解素抗体——NBE003‑3、P11、P13、P14、P15和鼠抗备解素抗体——124F9、149F8、103B20)与人血清(25％)一起在37℃下孵育30分钟。然
后将这些添加至固定数量的兔红细胞，并在37℃下进一步孵育50分钟。然后将经处理的细
胞离心，并通过在405/595波长处测量吸光度来测量上清液的所释放的血红蛋白。在本发明
的抗备解素抗体或阴性抗体对照(IgG2)存在下所释放的血红蛋白减少的百分比针对通过
在无任何测试抗体的情况下将兔RBC与人血清一起孵育所获得的裂解来计算。该裂解被认
为是100％。如图2a(针对人源化抗备解素单克隆抗体)和2b(针对鼠抗备解素单克隆抗体)
所示，所有受试的抗备解素mAb均以剂量依赖性方式抑制人血清介导的兔RBC溶血作用。这
些结果表明，根据本发明制备的抗备解素单克隆抗体可显著抑制旁路补体途径。

[0460] 实施例15：筛选出的抗备解素候选物对猴血清的交叉反应性溶血测定

[0461] 在兔RBC裂解测定中，通过阻断猴血清中补体的活性来检测抗备解素抗体候选物与猴备解素交叉反应的能力。基本上如实施例14中所述使用猴血清代替NHS进行功能测定。
预期具有与猴备解素交叉反应的能力的本发明的抗备解素mAb通过阻断由旁路补体途径介
导的MAC形成来阻止兔RBC的裂解。

[0462] 将新鲜的兔RBC收集在Alsever溶液中并用测定缓冲液(150mM NaCl、20mM HEPES、25mM MgCl2和20mM EGTA)洗涤5次。将经洗涤的RBC以所需浓度重悬在测定缓冲液中。将不
同浓度的每种抗备解素抗体mAb(NBE003‑3、P14和P15)与猴血清(25％)一起在37℃下孵育
30分钟。然后将这些添加至固定数量的兔红细胞，并在37℃下进一步孵育50分钟。然后将经
处理的细胞离心，并通过在405/595波长处测量吸光度来测量上清液的所释放的血红蛋白。
在本发明的抗备解素抗体存在下所释放的血红蛋白减少的百分比针对在无任何抗体的猴
血清的存在下所观察到的红细胞裂解来计算。该裂解被认为是100％。如图3a中所示，本发
明的抗备解素抗体在猴血清的存在下阻止兔RBC的溶血作用。

[0463] 还检测了抗备解素抗体候选物P15(GLS)在六种不同猴血清中阻断补体活性的能力。如以上所述使用兔RBC和来自六只不同猴子的血清进行功能测定。使用浓度范围为10至
0.17μg/ml的P15(GLS)进行裂解抑制。如图3b中所示，本发明的抗备解素抗体P15(GLS)在猴
血清存在下阻止兔RBC的溶血作用。这些结果确认了单克隆抗体与猴备解素在猴血清中的
交叉反应性。本发明的抗体也可直接用于药物开发过程期间所需的动物药理学和毒理学研
究，而无需使用替代抗体。

[0464] 实施例16：对所选择的候选物进行LPS AP测定以确定抗备解素抗体的功能性

[0465] 血清中的旁路补体途径可被来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活(18)。经纯化的LPS可用于在ELISA板表面产生旁路补体途
径介导的MAC形成(19，20)。在该测定系统中测试了本发明的抗备解素抗体候选物抑制这样
的MAC形成的能力。

[0466] 将微量滴定板(Nunc)用在PBS中的LPS(来自伤寒沙门氏菌(S.typhosa))(Sigma，目录号：L6386)以2μg/50μL/孔进行包被。然后将板在4℃下孵育过夜。洗涤之后，将板用1×PBS洗涤2次，并在37℃下用1％BSA(300μL/孔)封闭1小时。同时，将NHS(12.5％，在包含
150mM NaCl、20mM MgCl2和6.25mM EGTA的HEPES缓冲液(20mM)中)与抗备解素mAb(P14、P15
或P15(GLS))或同种型对照抗体在37℃、在摇动条件下预孵育1小时。然后将血清和抗体的
该预孵育混合物转移至上述经洗涤的、经LPS包被的板，并孵育1小时，以允许旁路补体途径
的激活和MAC形成。将板用1×PBS洗涤3次，并添加以1∶5000稀释(体积)的小鼠抗人MAC抗
体，并在37℃下孵育60分钟。将板再用1×PBS洗涤3次，并将100μL(1∶10000v/v)HRP缀合的
抗小鼠IgG(SantaCruz，目录号.sc‑58935)添加至每个孔，并在37℃下孵育60分钟。最后将
板用1×PBS洗涤6次，并在添加TMB/H2O2之后进行ELISA显色，持续15分钟，并在使用100μL/
孔1N H2SO4中止反应之后在450nm处获取OD。

[0467] 该测定表明本发明的抗备解素mAb(P14、P15和P15(GLS))抑制了NHS中LPS介导的补体途径的在EGTA存在下保持功能性的组分；并且观察到该抑制是剂量依赖性的(图4)。

[0468] 实施例17：使用抗CD55和抗CD59的人RBC裂解抑制测定

[0469] 在正常健康个体中，血清不导致自身RBC裂解。尽管这是旁路补体途径的组成型活性性质，但也可能是因为血清中(例如，H因子)和与血浆接触的细胞的表面上(例如，CD55和
CD59)都存在的天然补体抑制因子的存在。已知不存在这些抑制因子会导致严重的疾病病
理状况(例如，PNH和aHUS等)。

[0470] 使用获自正常健康个体的血清和RBC进行的溶血测定按照以上所述用于兔RBC裂解测定的那些进行设置，不同之处在于补体途径的调节受到抗CD55和抗CD59抗体的添加的
抑制的事实。在这些抑制剂的存在下，来自其他方面正常的健康志愿者的血清由于抑制作
用的去除和补体途径的激活，能够在体外裂解志愿者自身的RBC。

[0471] 所报道的(21)研究表明，对于本文所述的实验，遵循了补体调节的类似机制(有微小的变化)。简言之，将正常的人RBC(每次反应2500万个细胞)添加至由以下构成的溶液
2+
(100μL终体积)，在室温下孵育1小时：补充有Mg (25mM)‑EGTA(20mM)的明胶弗洛拿缓冲液
(GVB++)(Sigma‑Aldrich)，以及抗人CD55(克隆BRIC216)和抗人CD59(克隆MEM‑43)抗体(终
浓度：10μg/mL，如图5中所示；AbD Serotec)。将NHS(75μL)与本发明的抗备解素抗体或对照mAb(均为5μg/mL)添加至RBC以使最终反应体积至200μL，并在37℃下孵育4小时。将反应混
合物离心(1500rpm持续5分钟)以使未裂解的红细胞下沉。红细胞裂解的程度是通过所回收
的上清液的等分试样在405/595nm处的OD来测量的。裂解抑制百分比是通过将该OD值相对
于在NHS存在下所裂解的红细胞(与抗CD55和抗CD59抗体一起预孵育)的OD值归一化来计算
的。这种在不存在任何抗备解素抗体或对照抗体情况下的裂解被认为是100％裂解。本发明
的人源化抗体(P14、P15和P15(GLS))能够在PNH样条件下显著抑制人RBC的裂解，如图5中所
示。

[0472] 实施例18：链霉蛋白酶处理的人RBC裂解抑制测定

[0473] 在正常细胞的细胞表面表达的调节剂对补体的天然调节也可通过用蛋白酶如链霉蛋白酶处理细胞而被消除(22)。之前已使用蛋白酶来修饰正常的人RBC，以将其转化为补
体敏感性PNH样细胞。如之前所述使用经链霉蛋白酶处理的正常的人RBC进行溶血测定。链
霉蛋白酶处理导致了正常的人RBC由于旁路补体途径的激活而被其自身的血清裂解。

[0474] 将正常的人红细胞(每次反应2500万个细胞)添加至由补充有Mg2+(25mM)‑EGTA(20mM)的明胶弗洛拿缓冲液(GVB++)(Sigma‑Aldrich)构成的溶液(100μL终体积)。将这些
RBC在37℃下用链霉蛋白酶(5mg/mL)处理30分钟。将在不同浓度(5、2.5和1.25)的抗备解素
抗体的存在或不存在下预孵育30分钟的NHS(50μL)添加至经链霉蛋白酶处理的RBC，以使最
终反应体积为200μL，并在37℃下孵育4小时。将反应混合物离心(1500rpm)5分钟以使未裂
解的红细胞沉淀。RBC裂解的程度是通过所回收的上清液的等分试样在405/595nm处的OD来
测量的。裂解抑制百分比是通过将该OD值相对于在NHS存在下所裂解的红细胞(经链霉蛋白
酶处理)的OD值归一化来计算的。这种在不存在任何抗备解素抗体或对照抗体情况下的裂
解被认为是100％裂解。本发明的抗备解素mAb(P14、P15和P15(GLS))能够在NHS的存在下抑
制经链霉蛋白酶处理的人RBC的补体介导的裂解，如图6中所示。

[0475] 实施例19：在LPS诱导的肺损伤小鼠模型中的抗备解素抗体效力的确定

[0476] 已知气管内LPS滴注会诱导肺损伤，伴有支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)液中的细胞因子升高。由于任何治疗性施用导致的细胞因子减少被认为是有
效的。对于实验，将Balb/c小鼠称重并随机分配。将小鼠随机分为四组。保留一组作为假对
照，以确定由于气管内滴注过程导致的细胞因子水平的增加。而在另一组中，通过i.v.途径
以400μg/20g小鼠的浓度施用抗备解素替代物(兔抗小鼠备解素)血清。本文所用的兔抗小
鼠备解素抗体称为ZAP替代物。在载剂对照(疾病对照)中，仅通过i.v.途径以与抗备解素替
代物血清类似的体积施用安慰剂。还研究了无任何疾病诱导的动物组以确定基础细胞因子
水平的任何变化。在替代物抗备解素血清或安慰剂施用之后，将LPS(Sigma)气管内滴注到
每只小鼠中。在LPS滴注之后6小时将动物人道处死，并从每只小鼠收集BAL洗涤液，并使用
ELISA评价TNF‑α和IL‑6的水平。抗备解素mAb(ZAP替代物)能够减少支气管肺泡灌洗(BAL)
液中的炎性细胞因子，如图7和8中所示。这些结果表明抗备解素处理在治疗肺损伤方面是
有效的。对于TNF‑α(555268)和IL‑6(555240)ELISA二者，均使用BD biosciences制造的试剂盒。该程序是按照试剂盒说明进行的。在450nm处读取吸光度，并在570nm处进行吸光度校
正。

[0477] 本发明中所用的核苷酸和氨基酸序列的列表：

[0478] SEQ ID No.84：P13轻链

[0479]

[0480] SEQ ID No.85：P14轻链

[0481]

[0482] SEQ ID No.86：P15轻链

[0483]

[0484] SEQ ID No.87：E12轻链

[0485]

[0486] SEQ ID No.88：P12重链可变区

[0487]

[0488] SEQ ID No.89：P13重链可变区

[0489]

[0490] SEQ ID No.90：P14重链可变区

[0491]

[0492] SEQ ID No.91：P15重链可变区

[0493]

[0494] SEQ ID No.92：E12重链可变区

[0495]

[0496] SEQ ID No.93：IgG4重链恒定区

[0497]

[0498]

[0499] SEQ ID No.94：经IgG4(GLS)修饰的重链恒定区

[0500]

[0501] SEQ ID No.95：P15 IgG4恒定区的蛋白质序列

[0502]

[0503] SEQ ID No.96：P15(GLS)恒定区的蛋白质序列

[0504]

[0505] 本专利申请中所并入的参考文献：

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[0528] 通过引用并入

[0529] 出于所有目的，本文引用的每个专利文件和科学文章的全部公开内容通过引用并入。

[0530] 等同方案

[0531] 本发明可在不脱离其精神或基本特征的情况下以其他特定形式实施。因此，前述实施方案在所有方面应被认为是举例说明性的，而不是限制本文中所述的发明。因此，本发
明的范围通过所附权利要求书而不是通过前述说明书指示，并且在权利要求书的等同含义
和范围内的所有变化均旨在包括在其中。

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