[0001] 本发明涉及亲水色谱固定相技术领域，更具体的涉及一种SiO2@pMPC色谱固定相及其制备方法与应用。

[0002] 随着色谱技术的发展，高效液相色谱(HPLC)已经广泛应用于食品药品、环境安全、代谢组学等重要领域。药物及其代谢物通常都是极性的，但其传统的反相、正相色谱模式难以满足对极性化合物的分析需求。常用的反相色谱采用非极性固定相与极性流动相条件来实现目标分析物的分离，对于亲水的高极性物质保留很弱或者基本没有保留。基于极性固定相与非极性流动相条件组合的正相色谱有望克服此类问题，然而亲水的极性化合物在正相色谱流动相条件下溶解度过低[Rizzi A,Katz E,Eksteen R,et al.Handbook of HPLC.CRC Press,1998:1‑223]，为其分析带来了较大挑战。在此背景下，亲水色谱模式(HILIC)应运而生[Alpert A J.Journal of Chromatography A,1990,499:177‑196]，通过结合极性固定相与极性较弱的含水流动相，能同时弥补正、反相色谱在分离水溶性极性化合物时的不足。

[0003] 目前商业化的HILIC固定相中，两性离子类固定相因拥有独特的正负电荷共存结构而具有优异的亲水性，越来越受到市场欢迎。大多数商业化两性离子固定相均为硅胶基质，在碱性环境中易溶解，目前常用的两性离子色谱固定相的pH耐受范围仅为3～8。基于有机聚合物基质的两性离子色谱固定相，pH耐受范围能达到2～10，但机械强度较硅胶基质低且易于溶胀。

[0004] 表面引发原子自由基聚合(SI‑ATRP)是一种高度可控的表面改性方法，其可以在材料表面接枝具有可控分子量和分子量分布窄的聚合物链[Nagase K,Kobayashi J,Kikuchi A,et al.Langmuir,2008,24(2):511‑517]。通过SI‑ATRP法在硅胶载体表面已经成功的合成了各种形貌的聚合物涂层[Mu B,Wang T,Liu P.Industrial&engineering chemistry research,2007,46(10):3069‑3072]，越来越多的学者将SI‑ATRP作为开发硅胶微球表面接枝聚合固定相的新工具。

[0005] 磷酰胆碱(PC)基团是细胞膜双分子层外层的末端亲水基团，具有两性离子结构，正负电荷等量。MPC作为最简单的含有PC基团的化合物已被广泛应用到色谱领域并展现出良好的色谱性能。但是现有的巯基‑烯点击化学方法合成的MPC修饰硅胶微球色谱固定相表面接枝单体量较低[Xiong C,Yuan J,Wang Z,et al.Journal of Chromatography A,2018,1546:56‑65]，因此有需要开发一种更高效的合成硅胶微球表面接枝MPC单体的有机/无机杂化HILIC固定相的方法。。

[0039] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实例中所采用的材料均可以通过市售方式购买得到。

[0040] 实施例1

[0041] SiO2@pMPC色谱固定相的制备方法，包括如下步骤：

[0042] (1)活化硅胶的制备：称取1g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积450m2/g)置于250mL三颈烧瓶中，依次加入50mL甲醇溶液和50mL浓盐酸溶液，加热70℃回流4h，反应后用纯水反复洗涤，置于120℃下干燥12h得到活化硅胶；

[0043] (2)氨基化硅胶的表面修饰：将干燥好的活化硅胶置于250mL三颈烧瓶中，加入100mL无水甲苯，密闭容器后，待加热体系至110℃通过注射器加入1.5mL APTES后加热回流
12h，反应后依次用甲苯、纯水、丙酮洗涤，置于120℃下干燥12h得到表面修饰氨基的氨基化硅胶；

[0044] (3)溴代硅球的合成：将干燥好的氨基化硅胶置于100mL三颈烧瓶中，加入30mL无水THF置于0℃条件下，随后加入2.3mL TEA和1.5mL BIBB(分液漏斗逐滴缓慢加入)于0℃下反应1.5h后转移至室温条件下反应24h，反应后依次使用THF、纯水、丙酮洗涤，置于80℃下干燥12h得到溴代硅球；

[0045] (4)SiO2@pMPC色谱固定相的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、2.4g MPC单体、预处理过的氯化亚铜15mg，2‑2‑联吡啶21mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱固定相。

[0046] 柱效测试：N尿嘧啶＝38224N/m。

[0047] 实施例2

[0048] 与实施例1中的不同在于步骤(4)SiO2@pMPC的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、2.4g MPC单体、预处理过的溴化亚铜
15mg，2‑2‑联吡啶21mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应
24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱。柱效测试：N尿嘧啶＝19423N/m。

[0049] 将磷脂类功能单体、S3中的溴代硅胶、催化剂：2,2‑联吡啶、氯化亚铜按照质量体积比为50～200：1：1～4：2～8原子转移自由基聚合反应，真空干燥

[0050] 实施例3

[0051] 与实施例2中得不同在于步骤(4)SiO2@pMPC的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、2.4g MPC单体、预处理过的氯化亚铜
20mg，2‑2‑联吡啶28mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应
24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱固定相。

[0052] 柱效测试：N尿嘧啶＝9863N/m。

[0053] 实施例4

[0054] 与实施例2中得不同在于步骤(4)SiO2@pMPC的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、2.4g MPC单体、预处理过的氯化亚铜
10mg，2‑2‑联吡啶14mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应
24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱固定相。

[0055] 柱效测试：N尿嘧啶＝12655N/m。

[0056] 实施例5

[0057] 与实施例2中得不同在于步骤(4)SiO2@pMPC的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、1.2g MPC单体、预处理过的氯化亚铜
20mg，2‑2‑联吡啶28mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应
24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱固定相。

[0058] 柱效测试：N尿嘧啶＝9426N/m。

[0059] 实施例6

[0060] 与实施例2中得不同在于步骤(4)SiO2@pMPC的合成：将干燥好的溴代硅胶加入到100mL的高压密闭反应瓶中，依次加入12mL超干甲醇、0.6g MPC单体、预处理过的氯化亚铜
20mg，2‑2‑联吡啶28mg，氯化钠10mg，后反复抽真空充氮气5‑6次，密闭容器置于55℃下反应
24h，后静置12h淬灭反应，依次使用0.1mol/L的EDTA溶液、蒸馏水、乙醇和丙酮反复洗涤，随后60℃下干燥12h即得SiO2@pMPC色谱固定相。

[0061] 柱效测试：N尿嘧啶＝4531N/m。

[0062] 测验例1

[0063] 将实施例1与实施例2所得固定相分别填装进0.1×150mm毛细管柱内，并用于苯酚、硫脲、尿嘧啶的分离分析对比，如图1所示，实施例1所述氯化亚铜催化体系合成的SiO2@pMPC色谱固定相展示出更优秀的色谱性能

[0064] 色谱柱：0.1×150mm；

[0065] 流动相：A:5％ H2O B:95％can；

[0066] 流速：0.003mL/min；

[0067] 检测波长：254nm。

[0068] 测验例2

[0069] 使用实施例2中所得SiO2@pMPC色谱固定相填装进0.1×150mm毛细管柱内，用于尿素、尿囊素的分离分析，如图4所示，尿素、尿囊素在SiO2@pMPC色谱固定相上得到了很好的分离；

[0070] 色谱柱：0.1×150mm；

[0071] 流动相：A:5％ H2O B:95％ ACN；

[0072] 流速：0.003mL/min；

[0073] 检测波长：190nm。

[0074] 测验例3

[0075] 使用实施例2中所得SiO2@pMPC色谱固定相填装进0.1×150mm毛细管柱内，用于苯酚类化合物的分析，如图5所示，四种苯酚类化合物得到了很好的分离；

[0076] 色谱柱：0.1×150mm；

[0077] 流动相：A:5％ H2O B:95％ ACN 10mM AF pH 10.0；

[0078] 流速：0.003mL/min；

[0079] 检测波长：270nm。

[0080] 测验例4

[0081] 使用实施例2中所得SiO2@pMPC色谱固定相填装进0.1×150mm毛细管柱内，用于连续进样和长期使用的稳定性实验，如图6所示，在连续进样500针和长达三个月的使用时间内色谱柱稳定性良好。

[0082] 测验例5

[0083] 使用实施例2中所得SiO2@pMPC色谱固定相填装进0.1×150mm毛细管柱内，用于极端pH条件下的稳定性实验，如图7所示，在pH 2～10的条件下色谱柱稳定性良好。

[0084] 色谱柱：0.1×150mm；

[0085] 样品制备：甲苯、硫脲、尿嘧啶；

[0086] 流动相：乙腈/水(95/5，v/v)；

[0087] 总流量：0.003mL/min；

[0088] 检测波长：254nm。

[0089] 最后强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行不需付出创造性劳动的修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。因而，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。