[0001] 本发明涉及稳定同位素分析技术领域，尤其是涉及一种基于串联质谱的稳定同位素丰度的测定方法。

[0002] 稳定同位素标记试剂是科学研究中应用非常广泛的基础试剂，无论是作为检测内标还是示踪剂，在食品安全、药物分析、代谢组学与代谢流等领域都发挥了不可替代的作用。稳定同位素标记化合物的同位素丰度系指某一化合物中，标记原子占标记位点原子总数的百分比。同位素丰度是稳定同位素标记试剂重要的质控指标，同时也是代谢流等示踪应用中重要的研究对象。

[0003] 目前测定稳定同位素丰度的主要手段为核磁共振波谱法与质谱法。其中，核磁共振波谱法是公认较为准确的方法，在计量溯源与标准物质定值中已有应用，但受制于核磁共振波谱仪较低的检测灵敏度以及在混合样品分离能力不足，该方法不适用于复杂样品基质中浓度较低的同位素标记化合物丰度测定，在纯品质控的应用中对样品的消耗量也较大，检测成本较高。质谱法与核磁共振法在量值溯源上同样无需依赖标准物质，在灵敏度上则有绝对优势，且由于能与色谱联用，因而在复杂基质样品中同位素标记组分的丰度测定上有更广泛而灵活的应用。

[0004] 根据质谱仪的种类不同，质谱法又可被粗略地分为高分辨质谱法与低分辨质谱法。其中，低分辨质谱主要指四极杆质谱，受限于仪器分辨率，相近质荷比的离子(待测离子与“杂质”离子、待测离子与待测离子)无法得到有效分离，以卷积的形式被计入质谱数据，在同位素丰度结果计算的过程中首先需要进行较为复杂的去卷积计算；同时，未能完全分离的“杂质”离子也会在检测结果中引入误差。高分辨质谱主要有傅里叶变换质谱仪、飞行时间质谱、轨道离子阱质谱等，较高的仪器分辨率保证了相近质荷比的质谱峰的分离，一方面降低了结果计算的难度，一方面提高了选择性，降低了基质背景、待测组分中质荷比相近的“杂质”峰对待测峰测定的干扰，从而提高了准确性。然而，高分辨质谱仪高昂的价格大幅提高了检测门槛及成本，限制了该方法的推广使用。

[0053] 下面对本发明的实施例作详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0054] 除非特别说明，本发明采用的试剂，方法，仪器和设备为本领域常规试剂，方法，仪器和设备。除非特别说明，以下实施例所用的试剂和材料均为市购。

[0055] 实施例1

[0056] 采用三重四极杆质谱测定恩诺沙星‑D5(分子式C19H17D5FN3O3)的同位素丰度，采用蠕动泵引入样品溶液，流速10μL/min；质谱扫描极性为正离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为12Arb，离子传输管温度设置为275℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

[0057]

[0058] 则M为C19H18FN3O3，X为D，n＝5，AXx为C18H18FN3OD5，BXn‑x为CO2，其中x＝5，且MA＝316，MB＝44，Mz＝360。由于标记原子D全部出现在继承了母离子电荷的AXx部分，只需采用中性丢失扫描，恒定m/z差为MB+n‑x即44，获取母离子m/z等于MZ+n‑x，MZ+n‑x+1，……，MZ+n(即3601
～365)的离子强度数据。采用标识氘同位素丰度为99.25atom D％(HNMR定值)的标准品配制成浓度为1mg/L样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得m/z＝360～365的离子强度数据依次为2177、339、48、24、3044、354148，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到MD0H5、MD1H4、MD2H3、MD3H2、MD4H1、MD5H0的同位素异数体的分布(归一化后)为0.0076(x0)、‑0.0004(x1)、0.0001(x2)、0.0001(x3)、0.0106(x4)、1.2308(x5)，进而根据下式计算：

[0059]

[0060] E＝((1×x1+2×x2+3×x3+4×x4+5×x5)/(5×(x0+x1+x2+x3+x4+x5)))×100％

[0061] ＝(1×‑0.0004+2×0.0001+3×0.0001+4×0.0106+5×1.2308)/(5×

[0062] (0.0076‑0.0004+0.0001+0.0001+0.0106+1.2308)))×100％＝99.24％。

[0063] 即计算得恩诺沙星‑D5的同位素丰度E＝EA＝99.24atom D％，六次平行测定的结果平均值为99.22atom D％，相对标准偏差RSD＝0.16％。作为对比，同样的样品采用同样的设备及传统的全扫描法，六次平行测定的结果平均值为96.53atom D％，RSD＝0.45％。显示出本发明的方法相比传统方法，精密度有小幅提升，而准确性则有大幅改善。

[0064] 本实施例中，基于m/z＝360～365的离子强度数据获得相对离子强度I0～I5(对应的离子强度数据/最大离子强度数据)，基于同位素丰度分布计算器获得天然丰度恩诺沙星的同位素分布系数α0、α1、α2、α3分别为0.811、0.169、0.018、0.001。

[0065] 联立以下方程组，计算得到x0～x5。

[0066] I0＝α0x0

[0067] I1＝α1x0+α0x1

[0068] I2＝α2x0+α1x1+α0x2

[0069] I3＝α3x0+α2x1+α1x2+α0x3

[0070] I4＝α3x1+α2x2+α1x3+α0x4

[0071] I5＝α3x2+α2x3+α1x4+α0x5。

[0072] 实施例2

[0073] 采用液相色谱‑三重四极杆质谱测定葡萄糖‑6‑磷酸‑13C6(分子式13C6H13O9P)的同位素丰度，采用液相色谱引入样品，色谱柱采用Waters BEH Amide(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A为乙腈，流动相B为含20mmol/L的乙酸铵的水溶液，VA：VB＝90：10，在200μL/min流速下等度洗脱；进样量为10μL；质谱扫描极性为负离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为25Arb，辅助气流量设为15Arb，离子传输管温度设置为300℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

[0074]

[0075] 则M为H12O9P，X为13C，n＝6，AXx为H2PO4，BXn‑x为13C6H10O5，其中x＝0，且MA＝97，MB＝13
162，Mz＝259。由于标记原子 C全部出现在未继承母离子电荷的中性丢失BXn‑x部分，只需采用母离子扫描，恒定子离子m/z为MA+x即97，获取母离子m/z等于MZ+x，MZ+x+1，……，MZ+n(即
259～265)的离子强度数据。采用最优化的色谱分离条件、质谱离子源参数及上述扫描参数
13
下分析喂给葡萄糖‑ C6示踪剂的细菌经过一定时间代谢得到的代谢混合物(样本经过合适的前处理)，获得m/z＝259～265的离子强度数据依次为5044、788、152、305、128、1870、
13 12 13 12 13 12
197049，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到M C0 C6、M C1 C5、M C2 C4、
13 12 13 12 13 12 13 12
M C3 C3、M C4 C2、M C5 C1、M C6 C0的同位素异数体的分布(归一化后)为0.026、0.004、
13
0.000、0.001、0.001、0.009、1.000，进而计算得葡萄糖‑6‑磷酸‑ C6的同位素丰度E＝EB＝
13
96.97atom  C％。同时，采用未经标记的、5mg/L的葡萄糖‑6‑磷酸标准品溶液，在上述同样条件下检测，得到m/z＝259～265的离子强度数据依次为357275、24996、7177、501、108、0、
0，可以得到该样品中检测出葡萄糖‑6‑磷酸的浓度为2.63mg/L。显示出本发明的方法拥有用于代谢物同位素丰度及含量的同时测定的潜力。

[0076] 实施例3

[0077] 采用三重四极杆质谱测定赖氨酸‑13C615N2(分子式13C6H1415N2O2)的同位素丰度，采用蠕动泵引入样品溶液，流速10μL/min；质谱扫描极性为正离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为12Arb，离子传输管温度设置为275℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

[0078]

[0079] 则M为H15O2，X为13C/15N，n＝8，AXx为13C5H1015N，BXn‑x为133CH515NO2，其中x＝6，且MA＝13 15
84，MB＝63，Mz＝147。由于标记原子 C及 N同时出现在子离子AXx与中性丢失BXn‑x部分，需同时采用中性丢失扫描与母离子扫描模式。在中性丢失扫描模式中，恒定m/z差为MB+n‑x即
65，获取母离子m/z等于MZ+n‑x，MZ+n‑x+1，……，MZ+n(即149～155)的离子强度数据。采用自
13 15
制的、浓度为0.5mg/L的赖氨酸‑ C6 N2样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得m/z＝149～155的离子强度数据依次为27、97、237、1678、9012、
95275、827632，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到AX0、AX1、AX2、AX3、AX4、AX5、AX6的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.000、0.000、0.002、0.0011、0.115、
13 15
1.000，进而计算得子离子部分的同位素丰度EA＝97.86atom  C( N)％；在母离子扫描模式中，恒定子离子m/z为MA+x即90，获取母离子m/z等于MZ+x，MZ+x+1，……，MZ+n(即153～155)的离子强度数据。在相同的质谱离子源参数及上述扫描参数下分析同一个样品，获得m/z＝
153～155的离子强度数据依次为438、65309、3607273，采用“质量簇法”对上述数据作去卷积处理，得到BX0、BX1、BX2的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.019、1.000，进而计
13 15
算得中性丢失部分的同位素丰度EB＝99.08atom C( N)％。对子离子与中性丢失部分的同
13 15
位素丰度部分进行加权平均处理，可以得到该赖氨酸‑ C6 N2样品的两种同位素丰度(混合)为98.16％，即E＝(6×97.86％+(8‑6)×99.08％)/8＝98.17％。平行测定8次得到的丰度平均值为98.17％，RSD＝0.01％。该样品采用高分辨质谱(四极杆‑轨道离子阱质谱)测定其同位素丰度，平均结果为98.25％，RSD＝0.12(n＝8)。显示出本发明的方法与高分辨质谱法测得的结果不存在显著差异，相比之下，本发明的方法精密度更高，但无法像高分辨质谱法一样测得每一种同位素的丰度。

[0080] 实施例4

[0081] 采用液相色谱‑三重四极杆质谱测定葡萄糖‑13C6(分子式13C6H12O6)的同位素丰度，采用液相色谱引入样品，色谱柱采用Waters BEH Amide(100mm×2.1mm，1.7μm)，流动相A为乙腈，流动相B为含20mmol/L的乙酸铵的水溶液，VA：VB＝90：10，在200μL/min流速下等度洗脱；进样量为10μL；质谱扫描极性为负离子模式，喷雾电压设置为3500V，鞘气流量设置为25Arb，辅助气流量设为15Arb，离子传输管温度设置为300℃。通过预实验可以推测待测物在碰撞室中能发生如下反应：

[0082]

[0083] 则M为H12O6，X为13C，n＝6，AXx为13C3H5O3，BXn‑x为13C3H6O3，其中x＝3，且MA＝89，MB＝13
90，Mz＝179。由于标记原子 C同时出现在子离子AXx与中性丢失BXn‑x部分，需同时采用中性丢失扫描与母离子扫描，本例中用选择反应监测(SRM，或称多反应监测，MRM)模式实现中性丢失扫描与母离子扫描的数据采集功能。在中性丢失扫描模式中，恒定m/z差为MB+n‑x即
93，获取母离子m/z等于MZ+n‑x，MZ+n‑x+1，……，MZ+n(即182～185)的离子强度数据；在母离子扫描模式中，恒定子离子m/z为MA+x即92，获取母离子m/z等于MZ+x，MZ+x+1，……，MZ+n(即
182～185)的离子强度数据；用SRM模式代替时，只需采集子离子/母离子m/z为89/182、90/
183、91/184、92/185、92/182、92/183、92/184的离子对峰面积即可。将已知同位素丰度的葡
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萄糖‑ C6(E＝98.5atom  C％)制成1mg/L样品溶液，在最优化的质谱离子源参数及上述扫描参数下进样分析，获得上述m/z的离子对对应的峰面积依次为0、20、801、24279、38、63、
1391，采用“质量簇法”分别对上述数据作去卷积处理，得到AX0、AX1、AX2、AX3的同位素异数
13
体的分布(归一化后)为0.000、0.001、0.033、1.000，并计算得到EA＝98.9atom  C％；BX0、BX1、BX2、BX3的同位素异数体的分布(归一化后)为0.000、0.001、0.033、1.000，并计算得到
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EB＝97.9atom  C％。对子离子与中性丢失部分的同位素丰度部分进行加权平均处理，可以
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得到该葡萄糖‑ C6样品的同位素丰度为98.4％。平行测定6次得到的丰度平均值为98.3％，RSD＝0.2％。显示出可以使用相对更常用的SRM或MRM模式代替中性丢失扫描及母离子扫描进行数据采集，达到相仿的检测效果。

[0084] 本发明利用串联质谱对稳定同位素标记化合物的离子对丰度进行定量分析，获得信噪比更高的同位素异数体分布，从而计算得到更准确的稳定同位素丰度。与现有技术相比，本发明能够更准确、更精密地测定稳定同位素产品的同位素丰度；另一方面，本发明方法具有较高的灵敏度，检测浓度下限较低，可对低浓度样品进行检测。

[0085] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。