[0001] 本发明涉及一种稳定同位素内标物质的合成方法，尤其是涉及一种稳定同位素标记双氰胺的合成方法。

[0002] 双氰胺(Dicyandiamide)，又名氰基胍、二氰二胺，溶于水、乙醇和乙腈，主要用作肥料及其它精细化工中间体。双氰胺有一定毒性，对小鼠毒性试验显示，最高剂量组给药16h后，小鼠开始出现不安、跳跃、呼吸急促，随后在几十分钟内便死亡。新西兰农民在牧场中使用双氰胺主要为了防止硝酸盐等流入河流造成污染，但由于生物链的传递，导致牛奶中也有双氰胺残留。2013年1月，有关部分新西兰奶粉检出双氰胺残留的消息引起了消费者的广泛关注。

[0003] 目前，虽然任何国家的食品标准中都没有双氰胺的限量标准值，但是自从我国2008年的“三聚氰胺”事件后，FDA将双氰胺与许多其他含氮农用产品(因为这些物质中含氮，可能会伪造牛奶中的蛋白质含量)列入牛奶必检项。双氰胺无致癌性，但是高剂量的双氰胺具有毒性。考虑到高剂量的双氰胺对人体，特别是婴幼儿具有较强的毒性，我国的食品添加剂标准规定禁止在乳粉中添加此种物质。

[0004] 当前有关双氰胺的检测方法主要有分光光度法、阳离子交换法、比色法、选择电极法、酶促法、pH值法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。其中，液相色谱-质谱法具有高分离能力、高灵敏度、高选择性、等优点，应用较多。但由于食品中基质效应以及不科学的前处理方法也会对分析结果造成较大偏差。

[0005] 通过采用同位素稀释质谱法IDMS(Isotope Dilution Mass Spectrometry)：添加剂同位素内标试剂可以有效消除样品在化学和物理的前处理步骤中所引起的回收率差异，从而避免因为样品处理过程的损失对检测结果造成的偏差。

[0006] 1999年国际物质量咨询委员会(CCQM)确定：微量、痕量和超痕量元素的唯一权威测量方法是同位素稀释质谱法(IDMS)。美国环境保护署(EPA)也于1984年将同位素稀释质谱法作为环境介质中重点有机污染物的常规监测方法，在全世界范围内推广使用。

[0007] 而稳定同位素标记双氰胺的开发成功，将为更准确的定量检测牛奶或奶粉中的双氰胺提供标准试剂，以进一步完善我国食品安全检测技术体系，满足我国食品安全发展的需求。

[0008] 目前，双氰胺的工业上的合成方法主要有氰胺钙法、尿素法等，但是这些合成工艺所涉及的装置难以达到同位素合成的要求，难以将同位素标记元素引入，不适合稳定同位素标记化合物的合成。而有关稳定同位素标记双氰胺的合成技术国内外尚无相关文献报道。

[0038] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

[0039] 实施例1

[0040] 取6.4g碳化钙和0.1g氯化钙混合均匀后加入到反应釜中，抽真空直至压力为-0.1MPa，将反应釜放入管式炉中开始加热，待温度升至800℃时继续抽真空到-0.1MPa，15
然后打开 N2气体阀门，慢慢通入1.5L气体，保持温度反应1h。反应结束后，冷却即得到稳
15
定同位素标记氰胺化钙- N2。
15

[0041] 将上述反应得到的氰胺化钙- N2与蒸馏水按质量比1:4.5混合，在25℃进行水解，2h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.02g氢氧化钠固体，在50℃下搅拌反应6h，反应结束冷却结晶，得到0.89g目标产物稳定同位素标记双15 15
氰胺- N4。以通入的 N2气体计，总收率为30.18％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为
15
99.2％，丰度为99.0％atom N。

[0042] 实施例2

[0043] 取5.6g氧化钙、12.4g稳定同位素标记尿素-15N2、0.18g二氧化硅混合均匀加入反应釜中，升温至260℃反应2h，反应结束在700℃煅烧若干小时后即可得到稳定同位素标记15
氰胺化钙- N2。

[0044] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:5.5混合，在10℃进行水解，3h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.06g氢氧化钾固体，在60℃下搅拌反应4h，反应结束冷却结晶，得到1.6g目标产物稳定同位素标记双氰15 15
胺- N4。以尿素- N2计，总收率为18.4％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为99.3％，丰
15
度为99.1％atom N。

[0045] 实施例3

[0046] 取6.4g碳化钙和0.18g氯化钙混合均匀后加入到反应釜中，抽真空直至压力为-0.1MPa，将反应釜放入管式炉中开始加热，待温度升至1200℃时继续抽真空15
到-0.1MPa，然后打开 N2气体阀门，慢慢通入1.5L气体，保持温度反应2h。反应结束后，
15
冷却即得到稳定同位素标记氰胺化钙- N2。

[0047] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:3.5混合，在35℃进行水解，4.5h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.01g乙醇钠固体，在70℃下搅拌反应3h，反应结束冷却结晶，得到1.49g目标产物稳定同位素标记15 15
双氰胺- N4。以通入的 N2气体计，总收率为50.5％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为
15
99.3％，丰度为99.3％atom N。

[0048] 实施例4

[0049] 取5.6g氧化钙、18.6g稳定同位素标记尿素-15N2、0.24g ZMS-5分子筛混合均匀加入反应釜中，升温至290℃反应1h，反应结束在800℃煅烧若干小时后即可得到稳定同位素15
标记氰胺化钙- N2。

[0050] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:7.5混合，在60℃进行水解，5.5h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.10g氢氧化钠固体，在45℃下搅拌反应2h小时，反应结束冷却结晶，得到2.0g目标产物稳定同位素15 15
标记双氰胺- N4。以尿素- N2计，总收率为30.6％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为
15
99.0％，丰度为99.2％atom N。

[0051] 实施例5

[0052] 取6.4g碳化钙、0.15g碳酸钙、0.09g氧化钙混合均匀后加入到反应釜中，抽真空直至压力为-0.1MPa，将反应釜放入管式炉中开始加热，待温度升至700℃时继续抽真空15
到-0.1MPa，然后打开 N2气体阀门，慢慢通入1.5L气体，保持温度反应3h。反应结束后，
15
冷却即得到稳定同位素标记氰胺化钙- N2。

[0053] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:8.5混合，在40℃进行水解，3.5h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.03g氢氧化钾固体，在80℃下搅拌反应5h，反应结束冷却结晶，得到1.29g目标产物稳定同位素标记15 15
双氰胺- N4。以通入的 N2气体计，总收率为43.76％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为
15
99.0％，丰度为99.0％atom N。

[0054] 实施例6

[0055] 取5.6g氧化钙、24.8g稳定同位素标记尿素-15N2、0.3gβ型分子筛混合均匀加入反应釜中，升温至320℃反应3h，反应结束在900℃煅烧若干小时后即可得到稳定同位素标15
记氰胺化钙- N2。

[0056] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:6.5混合，在50℃进行水解，1.5h后开始通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后加入0.11g乙醇钠固体在80℃下搅拌反应5h，反应结束冷却结晶，得到2.36g目标产物稳定同位素标记双氰15 15
胺- N4。以尿素- N2计，总收率为25.8％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为99.2％，丰
15
度为99.2％atom N。

[0057] 实施例7

[0058] 稳定同位素标记双氰胺的合成方法，具体步骤为：

[0059] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0060] 将碳化钙和催化剂A(CaF2)按照比例投入反应釜中，催化剂占总投料的质量百分15 15
数为1.0％；在500℃下慢慢通入 N2气体，保持4h，反应结束后，即得到氰胺化钙- N2。

[0061] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法

[0062] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:2混合进行水解，水解温度为10℃；水解时间为6h，然后通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后，加入0.05％的碱性催化剂B(乙醇钠)，在30℃下聚合8h，最后冷却结晶得到目标产物稳定同位
15
素标记双氰胺- N4。

[0063] 以通入的15N2气体计，总收率为23.8％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为15
99.1％，丰度为99.3％atom N。

[0064] 实施例8

[0065] 稳定同位素标记双氰胺的合成方法，具体步骤为：

[0066] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0067] 将碳化钙和催化剂A(CaCl2)按照比例投入反应釜中，催化剂占总投料的质量百分15 15
数为4.0％，在1300℃下慢慢通入 N2气体，保持0.5h，反应结束后，即得到氰胺化钙- N2。

[0068] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法

[0069] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:10混合进行水解，水解温度为80℃，水解时间为1h，然后通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后，加入0.05％的碱性催化剂B(氢氧化钠)，在120℃下聚合0.5h，最后冷却结晶得到目标产物15
稳定同位素标记双氰胺- N4。

[0070] 以通入的15N2气体计，总收率为22.6％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为15
99.5％，丰度为99.1％atom N。

[0071] 实施例9

[0072] 稳定同位素标记双氰胺的合成方法，具体步骤为：

[0073] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0074] 将碳化钙和催化剂A(CaO)按照比例投入反应釜中，催化剂占总投料的质量百分15 15
数为1.2％；在600℃下慢慢通入 N2气体，保持3h，反应结束后，即得到氰胺化钙- N2。

[0075] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法

[0076] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:3.5混合进行水解，水解温度为20℃；水解时间为5.5h；然后通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后，加入0.05％的碱性催化剂B(氢氧化钾)，在45℃下聚合6h，最后冷却结晶得到目标产物稳15
定同位素标记双氰胺- N4。

[0077] 以通入的15N2气体计，总收率为21.7％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为15
99.3％，丰度为99.5％atom N。

[0078] 实施例10

[0079] 稳定同位素标记双氰胺的合成方法，具体步骤为：

[0080] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0081] 将碳化钙和催化剂A(CaCO3)按照比例投入反应釜中，催化剂占总投料的质量百分15 15
数为3.6％；在1200℃下慢慢通入 N2气体，保持1h，反应结束后，即得到氰胺化钙- N2。

[0082] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法

[0083] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:8.5混合进行水解，水解温度为60℃；水解时间为1.5h；然后通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后，加入0.05％的碱性催化剂B(乙醇钠)，在90℃下聚合1h，最后冷却结晶得到目标产物稳定15
同位素标记双氰胺- N4。

[0084] 以通入的15N2气体计，总收率为27.4％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为15
99.3％，丰度为99.3％atom N。

[0085] 实施例11

[0086] 固体法进行稳定同位素标记双氰胺的合成，具体步骤为：

[0087] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0088] 将氧化钙和稳定同位素标记尿素-15N2按摩尔比为1:1投入反应釜中，加入1wt％的催化剂C(二氧化硅)，在130℃下反应一段时间，反应结束在600℃下煅烧3h后即可得到15
氰胺化钙- N2。

[0089] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法

[0090] 将上述反应得到的氰胺化钙-15N2与蒸馏水按质量比1:2混合进行水解，水解温度为10℃；水解时间为6h，然后通入二氧化碳气体直至混合液呈弱碱性，混合液抽滤后，加入0.05％的碱性催化剂B(乙醇钠)，在30℃下聚合8h，最后冷却结晶得到目标产物稳定同位
15
素标记双氰胺- N4。

[0091] 以以尿素-15N2计，总收率为9.5％，产品经液相色谱、质谱检测，纯度为99.1％，丰15
度为99.2％atom N。

[0092] 实施例12

[0093] 固体法进行稳定同位素标记双氰胺的合成，具体步骤为：

[0094] (1)稳定同位素标记氰胺化钙-15N2的合成

[0095] 将氧化钙和稳定同位素标记尿素-15N2按摩尔比为1:5投入反应釜中，加入1wt％的催化剂C(ZSM-5分子筛)，在380℃下反应一段时间，反应结束在900℃下煅烧1h后即可15
得到氰胺化钙- N2。

[0096] (2)稳定同位素标记双氰胺-15N4的合成方法