[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及OsRFS蛋白及其应用。

[0002] 环境中的非生物胁迫，例如干旱、盐碱、冷害和热害等影响植物的生长和发育，造成农作物的减产，也影响林木、果树、花卉、园艺观赏植物的正常生长和品质，培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。

[0003] 植物为了适应盐胁迫等不利环境条件形成了一系列复杂的响应逆境胁迫的调控机制。已有研究表明，植物抗逆的机制虽然复杂，但是可以被调控。

[0004] 分蘖作为禾本科植物特有的分枝形式，影响水稻株型，与水稻产量密切相关。对其他禾本科植物，如小麦、稻米、玉米、大麦和高粱，分蘖性状也备受关注，各国学者从多方面研究调控分蘖的多种因素。

[0005] 株高是水稻品种的一个十分重要的农艺性状之一。植株过高容易引起倒伏减产，适当矮化则耐肥，抗倒，增产。矮化育种是水稻育种的一个重大突破，矮秆良种的选育和推广显著提高了水稻的生产潜力。因此，株高一直是水稻遗传研究的重点之一。水稻株高由复杂的基因调控网络控制。根据目前的报道，株高主要受激素如赤霉素(Gibberellin，GA)、油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)、独脚金内酯(Strigolactone，SL)等相关途径和极性生长素运输(Polar Auxin Transport)的调控，其中GA和BR相关途径研究最为深入。多数矮化突变体的产生都是由于这两种植物激素的生物合成或响应途径的缺陷；随着GA受体GID1(GA‑INSENSITIVE DWARF1)、GID2(GA‑INSENSITIVE DWARF 2)和DELLA等关键蛋白的相继鉴定，GA控制植物株型建成的信号途径得以阐明。

[0006] 水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，其可持续生产对保障我国粮食安全具有重要意义。水稻种植过程中会遭受干旱、淹涝、盐害、低温、高温等的非生物胁迫。因此，鉴定水稻耐逆相关基因及其机制，通过基因工程对水稻自身品种及其他物种的抗逆性改良具有重要意义。

[0117] 以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

[0118] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0119] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

[0120] 本实施例中的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、大肠杆菌DH5α购自上海唯地生物；水稻(Oryza sativa L.)种子：品种为日本晴，由华南农业大学遗传工程实验室提供；pYLox.5超表达载体，由华南农业大学遗传工程实验室提供(Zhou H,Liu Q,Li J,et al.Photoperiod‑and thermo‑sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA[J].Cell Research,2012,22(4):649‑660.)。

[0121] 实施例1OsRFS基因的克隆

[0122] 一、水稻cDNA模板制备

[0123] 水稻取自广东海洋大学农学院，水稻日本晴于稻田土中栽培，于温室中进行培养，‑2温度28℃/25℃(昼/夜)，光周期为14h/10h(光/暗)，湿度75％，光照强度800μmoL·m ·s‑1
；对其进行定期施以适量的复合肥(N：P：K＝15：15：15)(重量百分比)溶液；长至3～4叶期，取部分叶片，立即液氮冷冻，研钵研碎，将粉末转移至1.5ml微量离心管中，用Trizol方法提取总RNA，用M‑MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)反转录获得cDNA模板，‑20℃保存备用。

[0124] 二、扩增OsRFS基因引物

[0125] 根据GenBank数据库水稻OsRFS基因的cDNA序列，设计扩增水稻OsRFS cDNA(由上海生工合成)的引物。扩增OsRFS的上游引物mcRBQF1，序列为：5’‑CCAAATCCTCCTCTCGAACAA‑3’(SEQ ID NO.1)；扩增OsRFS的下游引物mcRBQR1，序列为：5’‑CCATCCAATAGTCCTACACCAC‑
3’(SEQ ID NO.2)。

[0126] 三、扩增获得OsRFS基因并构建载体

[0127] 用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增：

[0128] PCR反应体系(50μL)：KOD‑Plus‑DNA聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL‑1)1μL；10×‑1 ‑1 ‑1buffer 5μL；dNTPs(10mmol·L )5μL；MgSO4(25mmol·L )2μL；上游引物(10μmol·L )1.5‑1
μL；下游引物(10μmol·L )1.5μL；模板(反转录第一链cDNA)2μL；ddH2O补足至50μL；

[0129] PCR反应程序：94℃3min；94℃0.5min，55℃0.5min，72℃0.5min，35个循环；72℃10min；扩增产物以质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测；

[0130] 结果如图1所示：获得了一条长约800bp的序列，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)回收；

[0131] 将PCR回收片段与pGEM‑T easy(TaKaRa)按摩尔比3:1的比例进行连接，反应体系如下：pMD18‑TVector(0.03pmol)1μL，PCR回收片段0.1pmol～0.3pmol，补水到5μL，再加入5μL的Solution I，16℃连接2h，获得连接产物；

[0132] 大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于‑80℃超低温冰箱的大肠杆菌DH5α菌液，在SOB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于1mL的SOB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200mL SOB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD550＝0.6；以2500rpm离心10min收集菌体，加入预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌；重复用预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌，加入等体积的10％甘油，最后将细菌分装，于‑80℃保存备用；

[0133] 连接产物热激转化大肠杆菌：将连接产物加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；42℃热激90s后，再在冰中放置2min；热激后的菌体转入1mL SOC液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1h；取100μL菌液涂布于含IPTG和X‑gal的LB固体(含100μg/mL氨苄西林(Amp))培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜；

[0134] 重组质粒pGEM‑OsRFS的筛选、纯化及测序：呈蓝斑的菌落不含插入片段，仅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR检测；挑取PCR阳性菌落，接种于2mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜；吸取2mL菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提质粒，4℃保存备用；纯化的重组质粒命名为pGEM‑OsRFS，送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果如下：CCAAATCCTCCTCTCGAACAACCGCCGGAGCCAACCACCGCCGCCGCGCCACCGCGCGCCGGAGAATATGGAGCTCCTCGACATGGTGCCCGCGGACGCCATCGCGCTCCGCCTCTACTCCCTCCCGGCGGCGGCGGCGGCCGTCGGCTCGCTCTGGGCGTGGCTCGTCGCCGCCCTCGCCGCCGCCGTCGGCCTGTGGCGCATCCGCGCCGCCGCCGGTGTCCGTAGCGCCCTCGTGGACGACGACGACTACAAGCAGCGCAAGGCGAAGCAGCCGCGCGGTGCTCTGCGGCCTGCCGGCGTCGGCGAGGCACGGCCGGCTCGCGCCGAGGCGGCGGAGTCGGAGGCGACGACGCCGACCTCCCCGAGCGAGCCGAGCACGCCTTCCAAGGTCCGGTTCACGGCGTACTACGGCGGCGAGGGGGACGGCGCCGACGAGGGAGTCGTGGACAGCGTCAGGAGATGCGTGGACAACGACGGCGACGGCGAGGGGGAGACGCCGACGGCGCCGGTGAGGCGGACGGCGTCGGGGAGGAGGAGGTGGTCGACGACGACGACGACGACGACGGCGCCATTCATGGCGACGCCGTGGGAGGAGAGGGAGATGGCCGTGAGGAGGAGGGGAGACCTGGGGTGGTACCGCCACCTCGACATGGCGGCGCTCGACGGAAGCGTCGTCCGGCTGTGGGACGGCGAGGTCACGGCGGCGTCGCCGGGGCGGCGCGGCCGGAGGGCATTATCGGAATTGCACCTCTCATTGTAGAGACATGGCTCAGTGTGTATATTGTGGTGTAGGACTATTGGATGG(SEQ ID NO.3)；测序结果与文库的序列进行比对，表明所扩增出的PCR产物为OsRFS基因。编码逆境诱导的核转录因子OsRFS的基因(SEQ ID NO.3)由808个碱基组成，其中OsRFS的蛋白质编码区(Sequence coding for amino acids in protein，CDS)由68位～763位的696个碱基组成(SEQ IDNO.4，下划线部分)，编码231个氨基酸，氨基酸序列为MELLDMVPADAIALRLYSLPAAAAAVGSLWAWLVAALAAAVGLWRIRAAAGVRSALVDDDDYKQRKAKQPRGALRPAGVGEARPARAEAAESEATTPTSPSEPSTPSKVRFTAYYGGEGDGADEGVVDSVRRCVDNDGDGEGETPTAPVRRTASGRRRWSTTTTTTTAPFMATPWEEREMAVRRRGDLGWYRHLDMAALDGSVVRLWDGEVTAASPGRRGRRALSELHLSL(SEQ ID NO.16)。

[0135] 实施例2重组表达载体pYLox.5‑OsRFS的构建

[0136] 根据实施例1获得的OsRFS开放阅读框序列，设计带有HindIII和BamHⅠ酶切位点的扩增引物：

[0137] 引 入 H i n d  I I I 酶 切 位 点 的 上 游 引 物 m c O s 0 9 F 1 ：5’‑AAGGTACCCAAGAGCTGAGATGGAACCATCC‑3’(SEQ ID NO.5)；

[0138] 引入BamH I酶切位点的下游引物mcOs09R1：5’‑GAGGATCCGAATTCAGTGATATGCTAAATGT G‑3’(SEQ ID NO.6)；

[0139] 以实施例1构建的克隆载体pGEM‑OsRFS为模板，以mcOs09F1和mcOs09R1为上下游引物，进行OsRFS基因PCR扩增，纯化回收扩增获得的OsRFS基因片段。

[0140] 将上述获得的OsRFS基因片段和pYLox.5超表达载体分别用限制性内切酶HindIII(TaKaRa公司)和BamHⅠ(TaKaRa公司)双酶切，分别回收OsRFS基因目的片段和酶切后载体大片段，连接(将OsRFS基因插入到表达质粒pYLox.5Pubi启动子下游多克隆位点的HindIII和BamHⅠ之间)，构建获得重组表达载体，将构建获得的重组表达载体命名为pYLox.5‑OsRFS(表达框示意图如图2所示)。

[0141] 通过PCR检测，证明获得了重组子(图3)。进一步对插入片段测序，结果表明，插入片段的序列与OsRFS编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了重组表达载体pYLox.5‑OsRFS。

[0142] 实施例3OsRFS基因编辑载体的构建

[0143] 利用crispr‑p2.0软件对OsRFS基因设计及筛选特异的sgRNA序列(OsRFS基因的编辑位点示意图如图15所示)。

[0144] 对筛选得到的sgRNA序列进行反向互补，然后在序列上游添加GGCA序列，即GGCACCGCCTCTACTCCCTCC(SEQ  ID  NO.7)；下游添加AAAC用于引物合成，即AAACGGAGGGAGTAGAGGCGG(SEQ ID NO.8)，序列送公司合成。

[0145] 将pRGEB32载体用bsai进行充分酶切然后纯化。

[0146] 将合成的正反DNA寡核苷酸双链(SEQ ID NO.7、8)退火(程序为PCR仪95℃5min，缓慢降温至室温1h，1：200稀释duplex)，形成双链sgRNA；利用T4 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性pRGEB32载体中，将连接产物转化大肠杆菌。提质粒测序，用引物cm356(acctgcaggcatgcacgcgct，SEQ  IDNO.9)和正向DNA寡核苷酸单链(GGCACCGCCTCTACTCCCTCC，SEQ ID NO.7)做PCR(程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃
30s，30个循环；72℃10min，图4)，条带正确的质粒送公司测序，确定序列无误后，得到连接好的pRGEB32‑sgRNA载体(表达框示意图如图16所示)，保存质粒用于转化农杆菌。

[0147] 实施例4 OsRFS受逆境诱导的表达情况

[0148] 一、获得逆境条件下的水稻模板

[0149] 1.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃，放置在培养箱中培养0天、24h、48h、72h，然后取样，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0150] 2.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗(三叶期)的根、叶(刚冒出的叶、未完全展开的叶、完全展开叶)和抽穗期间(成熟期)的叶、乳熟穗、扬花穗、花，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0151] 3.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗喷施100μmol/L脱落酸(ABA)，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0152] 4.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗喷施100μmol/L茉莉酸甲酯(MEJA)，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0153] 5.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗放到室温环境的桌面上自然风干，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0154] 6.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗放到10wt％PEG6000溶液中，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0155] 7.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗放到150mmol/L NaCl(盐)溶液中，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0156] 8.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗放到4℃(低温)环境的光照培养箱中，光周期不变，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0157] 9.日本晴种子用84消毒液杀菌0.5h，50℃水浴2小时，37℃催芽选择萌发一致的‘日本晴’种子置于水培盒96孔板上，配置水稻营养液，放置在培养箱中培养21天，设定参数为光照16h，30℃；黑暗8h，26℃；选取日本晴生长三周的水稻幼苗放到42℃(热/高温)环境的光照培养箱中，光周期不变，分别于0h、1h、3h、6h、12h和24h后取样，取样时剪取叶片和根部，用锡箔纸包好后投于液氮迅速冷冻，于‑80℃冰箱中保存备用。

[0158] 将以上存放于‑80℃冰箱中保存备用的样品取出放于液氮中，加入液氮磨碎样品，用TRE‑Trizol试剂(TaKaRa公司)提取总RNA，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TAKaRa公司)进行反转录制备获得cDNA模板。

[0159] 二、设计特异检测引物

[0160] 根据OsRFS基因cDNA序列和水稻actin的序列，用Beacon Designer7.0软件设计出检测用定量引物：

[0161] OsRFS基因的上游定量引物qmhRBQF3：5’‑GGCCGGAGGGCATTATC‑3’(SEQ ID NO.10)；

[0162] OsRFS基因的下游定量引物qmhRBQR3：5’‑CCATCCAATAGTCCTACACCAC‑3’(SEQ ID NO.11)；

[0163] actin基因的上游定量引物Actin‑F1：5’‑GAGTATGATGAGTCGGGTCCAG‑3’(SEQ ID NO.12)；

[0164] actin基因的下游定量引物Actin‑R1：5’‑ACACCAACAATCCCAAACAGAG‑3’(SEQ ID NO.13)。

[0165] 三、定量PCR检测表达差异

[0166] 将步骤一制备的模板cDNA稀释50倍用于定量PCR的模板，反应体系(10μL)：Hieff UNICON qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)5μL、上游定量引物(10μM)0.2μL、下游定量引物(10μM)0.2μL、cDNA 1μL、ddH2O 3.6μL；qPCR反应程序：预变性95℃30s；变性95℃10s，退火/延伸60℃30s，40个循环；溶解曲线阶段按照仪器默认设置。以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，利用Bio‑Rad CFX Manager(version1.6)软件自动计算基因的相对表达量；

[0167] 结果如图5、6、7所示：OsRFS基因表达在种子萌发过程中受到抑制(图5中(A))，在根和成熟叶中最大(图5中(B)、(C))；

[0168] 地上部分(叶片)OsRFS基因表达在ABA处理后开始受到抑制(图6中(A))，地下部分(根)OsRFS基因表达在ABA处理后1h受到诱导，之后开始下调，之后在24h又受到诱导(图6中(B))；地上部分(叶片)OsRFS基因表达在MEJA处理后受到影响不大(图6中(C))，但是地下部分(根)OsRFS基因表达在MEJA处理后在3h和24h都受到强烈诱导(图6中(D))；

[0169] 地上部分(叶片)OsRFS基因表达在脱水处理(自然风干)1h受到诱导(图7中(A))，地下部分(根)OsRFS基因表达在脱水处理1h开始受到诱导，并在3h表达量最高，此后表达量降低(图7中(B))；地上部分(叶片)OsRFS基因表达在PEG处理后受到抑制(图7中(C))，地下部分(根)OsRFS基因表达在1h受到强烈诱导，之后迅速下调(图7中(D))；地上部分(叶片)OsRFS基因表达在盐处理3h开始受到诱导，此后迅速下调(图7中(E))，地下部分(根)OsRFS基因表达在盐处理1h受到强烈诱导，持续到6h，之后迅速下调(图7中(F))；地上部分(叶片)OsRFS基因表达在低温处理24h开始受到诱导(图7中(G))，地下部分(根)OsRFS基因表达在低温处理1h开始受到轻微诱导，之后逐渐下调(图7中(H))；地上部分(叶片)OsRFS基因表达在热/高温处理1h开始受到诱导，之后下调(图7中(I))，地下部分(根)OsRFS基因表达在热/高温处理6h和24h开始受到诱导(图7中(J))。结果表明，ABA、MEJA、脱水、PEG、盐、低温和热都能影响OsRFS基因的表达。

[0170] 实施例5转基因水稻、基因编辑水稻的产生及分子检测

[0171] 一、转基因水稻、基因编辑水稻的产生

[0172] 1、将重组表达载体pYLox.5‑OsRFS和基因编辑载体pRGEB32‑sgRNA导入根癌农杆菌EHA105

[0173] EHA105感受态的制备参考J.萨姆布鲁克(黄培堂,王嘉玺,朱厚础.J萨姆布鲁克,DW拉塞尔,著[J].分子克隆实验指南,2002:27‑30)的方法并加以改进：取EHA105菌种于MYB平板上划线，28℃培养48h，挑取单菌落，接种于50mL液体SOC中，28℃培养过夜，吸取0.5mL菌液，接种于500mL液体SOC中，28℃培养8h，至OD600为0.6，冰浴冷却10min，倒入经灭菌的200mL离心管中，平衡后4℃4000rpm离心10min，收集菌体，倒去SOC，倒置于灭过菌的纸巾上，控干水分，加入50mL预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，于冰上摇动，悬浮菌体，4℃4000rpm离心15min，收集菌体，重复洗涤一次，加入2mL预冷的体积分数为
10％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，悬浮菌体，分装，25μL/管，加液氮速冻后于‑80℃冰箱保存。把感受态细胞置于冰上解冻，将0.2cm内径的电击杯置于冰上预冷，在超净工作台内，将1.5μL pYLox.5‑OsRFS质粒(20ng/μL)和1.5μL pRGEB32‑sgRNA质粒(20ng/μL)分开加至
20μL解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴1min后，转移至电击杯中，置于电击仪(MicroPulser，Bio‑RAD公司)的电极间，选定程序Agr，进行电击；电击结束后，在超净工作台内，迅速将1mL YEB液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2h；吸取0.3mL菌液，涂布在YEB平板(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)上，28℃培养箱内倒置培养48h。

[0174] 2、含重组表达载体pYLox.5‑OsRFS的根癌农杆菌阳性菌落的鉴定

[0175] 挑取平板上的单菌落进行菌落PCR检测，并做好标记；进一步挑取PCR阳性菌落至3mL YEB液体培养基(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡培养40h；取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，用限制性内切酶HindIII(TaKaRa公司)和BamHⅠ(TaKaRa公司)进行酶切检测，然后阳性克隆送去公司测序，确定阳性克隆中含有植物表达载体pYLox.5‑OsRFS并序列正确无误后；取0.8mL农杆菌液，加0.2mL体积分数为80％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，混匀后保存于‑80℃超低温冰箱备用。

[0176] 3、含基因编辑载体pRGEB32‑sgRNA的根癌农杆菌阳性菌落的鉴定

[0177] 挑取平板上的单菌落进行菌落PCR检测，并做好标记；进一步挑取PCR阳性菌落至3mL YEB液体培养基(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡培养40h；取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，用cm356(acctgcaggcatgcacgcgct，SEQ ID NO.9)和正向DNA寡核苷酸单链(GGCACCGCCTCTACTCCCTCC，SEQ ID NO.7)做PCR检测(程序为94℃5min；94℃
30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min)和送公司测序，确定阳性克隆中含有基因编辑载体pRGEB32‑sgRNA；取0.8mL根癌农杆菌液，加0.2mL体积分数为80％的甘油(甘油：MYB液体培养基)，混匀后保存于‑80℃超低温冰箱备用。

[0178] 4、转基因水稻、基因编辑水稻植株的获得

[0179] (1)水稻愈伤组织的诱导和继代

[0180] 选取饱满健康的日本晴成熟种子去皮，用体积分数为70％的酒精浸泡1min，蒸馏水洗1次，再用质量分数为0.1％的升汞溶液封口处理15min，期间在摇床上不断摇动；然后在超净工作台中，倒掉升汞，灭菌蒸馏水洗5次，放在3张灭菌的大滤纸上晾干；最后，灭菌种子均匀平放于NB诱导培养基上，25℃黑暗条件下诱导愈伤组织；诱导的种子暗培养25天，当见到淡黄色颗粒状愈伤长出后，把愈伤组织接于继代培养基上继续诱导愈伤。

[0181] (2)农杆菌的活化与悬浮

[0182] 取分别含有重组表达载体pYLox.5‑OsRFS和pRGEB32‑sgRNA的根癌农杆菌EHA105贮存液，在YEB平板(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)上划线，28℃培养；挑分离良好的单菌落，接种于2mL液体YEB(含35mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡暗培养24h；吸取菌液20μL，涂布于含同样抗生素的YEB平板上，28℃倒置暗培养36h；将新长出的根癌农杆菌刮下来，用MS液体培养基悬浮稀释，使OD600为0.08。

[0183] (3)侵染、共培养及转基因苗的产生

[0184] 在超净工作台内，将提前干燥好的愈伤组织和农杆菌侵染液按一定比例混合(应保证农杆菌侵染液淹没愈伤组织)，再加入一定量的乙酰丁香酮，终浓度为100μM，然后在摇床上，150rpm，28℃黑暗侵染20min。在超净工作台内，倒出侵染液，将愈伤组织置于多层灭菌滤纸的小平皿上干燥约10min，再将愈伤组织转移到有3层灭菌滤纸的大平皿上，在风机下吹，干燥约2h，然后将愈伤组织接到有一张新灭菌滤纸的固体共培养基上，在风机下吹，再干燥2h；经干燥处理过的愈伤组织，于超净工作台内，在风机下吹0.5h后，分别接入筛选培养基，然后封口，于25℃下暗培养2周，共筛选2次；

[0185] 抗性愈伤的预分化和分化：挑选生长状态好的抗性愈伤接入预分化培养基，于25℃，光暗交替下(16h/8h)培养，直到长出新愈伤，预分化约为4周。将有绿点的愈伤组织移至分化培养基中继续分化出苗。

[0186] (4)转基因水稻、基因编辑水稻的生长

[0187] 待分化苗长至3～5cm时，将其从分化培养基中转移到100mL的三角瓶生根壮苗培养基中，25℃光暗(16h/8h)交替培养4周，直到长出新的根。如果苗生长良好，新的根长得比较快，则可以提前移栽练苗。当幼苗根部长出新的长根时，将幼苗从培养基中移出，并把根部的培养基冲洗干净，分单株移栽到盆中。用木村B水稻营养液，在自然光照强度条件培养3周。最后移入土中进行，于温室外自然条件培养。

[0188] 二、转基因水稻的PCR检测

[0189] 1.微量法快速提取DNA

[0190] 取1.5mL离心管盖般大小的叶片于1.5mL离心管，加入400μL预热到80℃的提取液(200mM Tris‑HCl pH8.0，250mM NaCl，25mM EDTA，质量分数为0.5％的SDS溶液)，用小研锤在1.5mL离心管中充分研磨，70℃水浴10min，然后在冰上放置2min；13000rpm离心1min，取300μL上清液，加等体积异丙醇，混匀，室温静置5min；13000rpm离心2min，弃尽上清液；DNA沉淀风干后溶于50μL TE(1M NaCl，10mM Tris‑HCl pH8.0，1mM EDTA)，保存于‑20℃冰箱。

[0191] 2.转基因水稻的PCR检测

[0192] 由于侵染植物的载体pYLox.5在其左右边界区内还带有homomycin(HPT)抗性基因，因此使用能特异识别该基因的引物ZG599(5’‑CGAAATTGCCGTCAAC CAAGCTCT‑3’，SEQ ID NO.14)和ZG600(5’‑CAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCT‑3’，SEQ ID NO.15)来检测目的基因是否成功转入到植物基因组；以上一步骤微抽得到的DNA为模板进行PCR扩增，以pYLox.5‑OsRFS重组质粒为阳性对照。反应体系(20μL)：TaqDNA聚合酶0.1μL、PCR 10×buffer 2μL、dNTP(10mM)1.6μL、ZG599(10μM)0.5μL、ZG600(10μM)0.5μL、DNA 1μL(pYLox.5‑OsRF质粒20ng)、ddH2O 14.3μL；PCR反应程序：94℃2min；94℃0.5min，57℃0.5min，72℃30s，35个循环；72℃5min。质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图8所示：11株转OsRFS基因水稻构建成功。同时，检测野生型水稻和11株转OsRFS基因水稻的OsRFS基因表达量，结果如图
9所示：11株转OsRFS基因水稻OsRFS基因表达量显著高于野生型。

[0193] 三、基因编辑水稻的检测

[0194] 1.微量法快速提取DNA

[0195] 取1.5mL离心管盖般大小的叶片于1.5mL离心管，加入400μL预热到80℃的提取液(200mM Tris‑HCl pH8.0，250mM NaCl，25mM EDTA，质量分数为0.5％的SDS溶液)，用小研锤在1.5mL离心管中充分研磨，70℃水浴10min，然后在冰上放置2min；13000rpm离心1min，取300μL上清液，加等体积异丙醇，混匀，室温静置5min；13000rpm离心2min，弃尽上清液；DNA沉淀风干后溶于50μL TE(1M NaCl，10mM Tris‑HCl pH8.0，1mM EDTA)，保存于‑20℃冰箱。

[0196] 2.编辑片段的PCR扩增和测序

[0197] 对靶位点进行PCR扩增，引物为上游引物mcRBQF1(5’‑CCAAATCCTCCTCTCGAACAA‑3’，SEQ ID NO.1)和下游引物mcRBQR1(5’‑CCATCCAATAGTCCTACACCAC‑3’，SEQ ID NO.2)。将PCR产物进行一代测序，并把测序结果上传至DSDecode网站进行解析(Liu et al.,2015)，当网站无法进行区分时，将PCR产物进行克隆测序，确切判断具体的突变类型。

[0198] 3.检测结果

[0199] 结果如图10所示：3株基因编辑水稻构建成功。

[0200] 实施例6转基因水稻和基因编辑水稻的抗旱性和耐盐性鉴定

[0201] 一、抗旱性测定

[0202] 将转基因水稻(过表达OsRFS，O0、O9)、基因编辑(抑制OsRFS表达，G1、G2)及其野生型(WT)水稻植株幼苗种于同一桶中，在玻璃房内生长40天后，停止浇水10天。当观察到野生型植株表现出明显萎焉时，收集倒二片叶片测量相对含水量(relative water content，RWC)及电导率(Ion leakage)。

[0203] 测定方法为：

[0204] 剪下叶片后立刻称鲜重，然后将它们放在烧杯中，暗中放置24h后称饱和重，之后于鼓风烘箱中在80℃恒温下烘干48h，称干重；3次重复，取平均值为该次取样植物叶片的相对含水量；计算公式：RWC(％)＝(鲜重一干重)/(饱和重一干重)×100％。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值；

[0205] 将叶片放入含20mL去离子水的三角瓶内，4℃过夜，用电导仪测定溶液电导值(C1)；将三角瓶移到沸水浴中保温20min，冷却至室温，再次用电导仪测定溶液电导值(C2)；通过公式(C1/C2)×100计算相对电导率。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值；

[0206] 结果如图11所示：经过10d的干旱处理后，转基因水稻的相对含水量比野生型的高，而相对电导率比野生型的低；基因编辑水稻的相对含水量比野生型的低，而相对电导率比野生型的高，表明在干旱胁迫下，相比野生型植株，转基因水稻提高了抗旱性，基因编辑水稻降低了抗旱性。

[0207] 二、耐盐性测定

[0208] 将转基因水稻(过表达OsRFS，O0、O9)、基因编辑(抑制OsRFS表达，G1、G2)及其野生型(WT)水稻植株幼苗种于同一桶中，在玻璃房内生长40天后，用100mM的NaCl溶液处理了15d后，统计绿叶面积及取相同叶位的叶片测量相对电导率(relative water content，RWC)和叶绿素含量。

[0209] 测定方法为：

[0210] 将叶片放入含20mL去离子水的三角瓶内，4℃过夜，用电导仪测定溶液电导值(C1)；将三角瓶移到沸水浴中保温20min，冷却至室温，再次用电导仪测定溶液电导值(C2)；通过公式(C1/C2)×100计算相对电导率。每个株系植株共测定5个单株，计算平均值；

[0211] 选取相同部位的叶片0.1g，加入2mL乙醇和石英砂研磨，再用3mL乙醇冲洗一次，定容到10mL刻度试管。放置过夜，中间颠倒混匀一次；在663、645nm波长下测定吸光度值，记为D663、D645，叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量，分别用Ca、Cb和Ct表示，单位为mg/L；根据Lamber‑Beer定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：Ca＝12.72*D663–2.59*D645，Cb＝22.88×D645–4.68×D663，Ct＝Ca+Cb＝8.02×D663+20.29×D645；叶绿素含量(mg/g叶)＝Ct(mg/L)×提取液总量(L)×稀释倍数/材料鲜重(g)；每个株系植株共测定5个单株，计算平均值；

[0212] 结果如图12所示，经过15天的盐处理后，转基因水稻的相对电导率比野生型低，叶绿素含量比野生型高；基因编辑水稻的相对电导率比野生型高，叶绿素含量比野生型低；表明：在盐胁迫下，相比野生型植株，转基因水稻受到的伤害更小，基因编辑水稻受到的伤害更大，转基因水稻提高了耐盐性，基因编辑水稻降低了耐盐性。

[0213] 三、高度及分蘖数统计

[0214] 将转基因水稻(过表达OsRFS，O0、O9)、基因编辑(抑制OsRFS表达，G1、G2)及其野生型(WT)水稻植株幼苗种于同一桶中，当水稻生长到120天，量取根部到最长叶直立时的长度，为株高(至叶片)，并对分蘖数进行统计(各植株各取25株测量)，然后取其平均值。试验结果如图13、14所示：转基因水稻、基因编辑水稻的株高比野生型矮，基因编辑水稻的分蘖数比野生型高；表明：基因编辑水稻的株高降低，而分蘖数提高了；转基因水稻的株高降低。

[0215] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。