[0001] 本发明属于快速生物检测技术领域，具体涉及核酸酶在抑制核酸扩增中非特异性扩增中的用途。

[0002] 等温核酸扩增是一种在恒定温度下进行核酸扩增的分子诊断技术。目前，发展较成熟、扩增效率较高的等温扩增技术，如环介导等温扩增和重组酶聚合酶扩增(RPA)，已经被广泛应用于医学、环境和公共卫生安全等领域。其中，RPA可在重组酶和低温反应的聚合酶的辅助下，实现恒温(37℃)的核酸扩增。反应无需变温仪器，甚至体温即可加热。此外，RPA能快速(20分钟)实现目标核酸的指数扩增，并且灵敏度媲美PCR(分子诊断的金标准)。基于此，RPA的仪器依赖性小、灵敏度高，是现场核酸检测的理想技术。

[0003] 众所周知，引物与目标基因的特异性结合是RPA准确检测的基础。然而，在低温下反应，RPA引物(长度介于30～35bp)易与非目标核酸发生非特异性结合，进而引发非特异性扩增。产生的非目标产物可能导致假阳性结果，影响检测的准确性。尽管核酸探针法(如CRISPR技术)可提高结果的准确性，但需要额外的检测试剂和实验操作，增加了RPA在现场检测中的复杂性。因此，亟需一种简单、高效的方法解决RPA的非特异性扩增。

[0004] 分析发现，在RPA的非特异性扩增中，引物与非目标核酸结合，形成含5’端单链DNA的双链DNA结构(即，凸末端的dsDNA)；而在特异性扩增中，引物与目标核酸完全互补，仅形成dsDNA结构(即，平末端的dsDNA)。因此，两种扩增的引物结构存在明显差异，选择性破坏凸末端的dsDNA，将有望解决RPA的非特异性扩增。

[0055] 本发明提供了一种核酸酶的在抑制核酸扩增中非特异性扩增的用途。在核酸扩增中加入T7 Exo，可以有效抑制反应中非特异性扩增。值得注意的是，需要将引物5’‑端进行连续3～5个核苷酸的核苷酸修饰。修饰后的引物与非目标序列结合，形成凸末端的dsDNA结构。该结构的凸末端首先被T7 Exo的Flap内切酶活性水解，随后被T7 Exo的外切酶活性水解破坏，从而抑制非特异性扩增，减少RPA检测的假阳性结果。在特异性扩增中，引物与目标序列结合形成平末端dsDNA结构，无法被T7 Exo的外切酶和内切酶活性水解。基于此，本方法实现对RPA非特异性扩增的选择性抑制。

[0056] 进一步的，本发明还提供了一种抑制等温核酸扩增中非特异性扩增的方法，具体步骤为：

[0057] (1)将引物进行核苷酸修饰；

[0058] (2)利用核苷酸修饰后的引物配置扩增反应液，加入T7核酸外切酶，混合均匀。随后，向反应管加入待测的目标核酸，并以超纯水控制反应的总体积为20～50μL；

[0059] (3)将反应管置于37℃恒温条件扩增4分钟，振荡混匀后，再扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，以停止反应。

[0060] 进一步，在所述核酸扩增中对引物进行核苷酸修饰。

[0061] 进一步，所述核苷酸修饰位点为引物5’‑端连续的3～5个核苷酸。

[0062] 进一步，其他抗核酸酶水解的核苷酸修饰均可辅助T7 Exo抑制非特异性扩增，因此，所述核苷酸修饰方法为硫代修饰。

[0063] 进一步，T7 Exo的反应浓度为1.3～2.6U/μL。

[0064] 进一步，所述引物浓度为120～480nM。

[0065] 下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

[0066] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

[0067] 本发明实施例中的靶向不同基因组(包括病毒、细菌、真菌和人类)的引物序列均来源于文献，具体序列见下表。

[0068] 表1各基因组使用的引物序列

[0069]

[0070]

[0071] *代表核苷酸修饰。以上引物从生工生物工程(上海)公司购买，并以超纯水溶解后备用。

[0072] 下述实施例RPA试剂盒厂家为TwisDx(英国)公司。除非特殊说明，T7 Exo从New England Biolabs(NEB)公司购买。此外，以下说明值得注意：

[0073] 1)在下述的实施例中，基因组DNA的浓度均为qPCR的定量结果；

[0074] 2)在相同的分析条件下，对比例作为判定实施例定性和定量分析性能的参考标准。

[0075] 以下为具体实施例。

[0076] 实施例1～2

[0077] (1)根据qPCR定量结果，配置特定浓度的人类基因组DNA样品；

[0078] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和硫代修饰的引物加入反应管中。然后，向反应管加入核酸外切酶T7 Exo，以及基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增
16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0079] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样。将扩增产物在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶电泳图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表2。

[0080] 对比例1～2

[0081] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例，差别在于对比例未添加T7 Exo，RPA的非特异性扩增存在情况见表2。

[0082] 表2T7 Exo抑制RPA引物之间和引物与非目标序列之间的非特异性扩增[0083]

[0084]

[0085] 图1为本发明方法T7 Exo‑RPA与传统RPA检测人类基因组的空白组和样品组的(A)凝胶电泳图像，及其(B)DNA条带的强度分析结果。通道1‑4分别对应对比例1、实施例1、对比例2和实施例2。从图1可以看出：1)对于未添加目标物(人类基因组)的RPA空白组，产物中不存在目标产物，但存在大量的非目标产物，表明引物自身或者引物之间存在大量的非特异性扩增(通道1)；2)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物的非特异性扩增，使得产物中不再存在非目标产物(通道2)；3)对于添加目标物的样品组，产物中同时存在目标产物和非目标产物，表明引物同时发生特异性扩增和非特异性扩增。值得注意的是，由于复杂的人类基因组(大小：约3.2Gbp)的存在，上述非特异性扩增不仅源于引物自身的相互作用，而且引物与基因组中非目标序列的结合(通道3)；4)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物自身及其与非目标序列的相互作用，避免非特异性扩增的产生，使得产物中不再存在非目标产物(通道4)。

[0086] 实施例3～7

[0087] (1)利用添加T7 Exo的RPA(即T7 Exo‑RPA)扩增体系检测系列浓度的目标物，分析方法的灵敏度。此外，与传统的RPA体系(未添加T7 Exo)进行对比。

[0088] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和480nM的硫代引物加入反应管中。然后，向反应管加入T7 Exo，以及2.5μL系列浓度稀释的基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0089] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样。将扩增产物在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶电泳图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表3。

[0090] 对比例3～7

[0091] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例，差别在于对比例未添加T7 Exo，RPA的非特异性扩增存在情况见表3。

[0092] 表3T7 Exo‑RPA和传统RPA检测人类基因组DNA的灵敏度

[0093]

[0094] 图2为本发明方法(A‑B)T7 Exo‑RPA与(C‑D)传统RPA检测系列浓度梯度的人类基因组的凝胶电泳图像，及其目标产物的强度分析结果。图2A凝胶图像分别对应实施例3‑7，而图2C凝胶图像分别对应对比例3‑7。从图2可以看出：1)T7 Exo‑RPA在检测不同浓度的人类基因组时，T7 Exo均可抑制RPA的非特异性扩增(图2A)；2)通过分析目标产物的灰度值发现，T7 Exo‑RPA可检测的最低浓度约0.21μg/mL(图2B)；3)对于未添加T7 Exo的传统RPA，其检测相同浓度的人类基因组时存在大量非目标产物(图2C)；2)通过分析目标产物的灰度值发现，传统RPA可检测的最低浓度约0.21μg/mL(图2D)。

[0095] 实施例8～13

[0096] (1)以不同物种的基因组DNA为目标物，分析T7 Exo抑制RPA检测过程的非特异性扩增性能，包括病毒(即非洲猪瘟病毒)、细菌(沙门氏菌)和真菌(白色念珠菌)。

[0097] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和240nM的硫代引物加入反应管中。然后，向反应管加入T7 Exo，以及2.5μL相同浓度、不同物种的基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0098] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样，在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶电泳图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表4和表
5。

[0099] 对比例8～13

[0100] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例，差别在于对比例未添加T7 Exo，RPA的非特异性扩增存在情况见表4和表5。

[0101] 表4T7 Exo‑RPA检测病毒和细菌的性能

[0102]

[0103]

[0104] 表5T7 Exo‑RPA检测真菌的性能

[0105]

[0106] 图3为本发明方法T7 Exo‑RPA与传统RPA(未添加T7 Exo)检测非洲猪瘟病毒的空白组和样品组的(A)凝胶电泳图像，及其(B)DNA条带的强度分析结果；其中，通道1‑4分别对应对比例8、实施例8、对比例9和实施例9。从图3可以看出：1)对于未添加目标物(非洲猪瘟病毒基因组)的RPA空白组，产物中不存在目标产物，但存在大量的非目标产物，表明引物自身或者引物之间存在大量的非特异性扩增(通道1)；2)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物的非特异性扩增，使得产物中不再存在非目标产物(通道2)；3)对于添加目标物的样品组，产物中同时存在目标产物和非目标产物，表明引物同时发生特异性扩增和非特异性扩增。值得注意的是，由于非洲猪瘟病毒基因组的存在，上述非特异性扩增不仅源于引物自身的相互作用，而且引物与基因组中非目标序列的结合(通道3)；4)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物自身及其与非目标序列的相互作用，避免非特异性扩增的产生，使得产物中不再存在非目标产物(通道4)。这些结果表明，T7 Exo‑RPA对非特异性扩增的抑制作用，同样适用于病毒检测。

[0107] 图4为本发明方法T7 Exo‑RPA与传统RPA检测沙门氏菌的空白组和样品组的(A)凝胶电泳图像，及其(B)DNA条带的强度分析结果；其中，通道1‑4分别对应对比例10、实施例10、对比例11和实施例11。从图4可以看出：1)对于未添加目标物(沙门氏菌基因组)的RPA空白组，产物中不存在目标产物，但存在大量的非目标产物，表明引物自身或者引物之间存在大量的非特异性扩增(通道1)；2)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物的非特异性扩增，使得产物中不再存在非目标产物(通道2)；3)对于添加目标物的样品组，产物中同时存在目标产物和非目标产物，表明引物同时发生特异性扩增和非特异性扩增。值得注意的是，由于沙门氏菌基因组的存在，上述非特异性扩增不仅源于引物自身的相互作用，而且引物与基因组中非目标序列的结合(通道3)；4)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物自身及其与非目标序列的相互作用，避免非特异性扩增的产生，使得产物中不再存在非目标产物(通道4)。这些结果表明，T7Exo‑RPA对非特异性扩增的抑制作用，同样适用于细菌检测。

[0108] 图5为本发明方法T7 Exo‑RPA与传统RPA检测白色念珠菌的空白组和样品组的(A)凝胶电泳图像，及其(B)DNA条带的强度分析结果；通道1‑4分别对应对比例12、实施例12、对比例13和实施例13。从图5可以看出：1)对于未添加目标物(白色念珠菌基因组)的RPA空白组，产物中不存在目标产物，但存在大量的非目标产物，表明引物自身或者引物之间存在大量的非特异性扩增(通道1)；2)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物的非特异性扩增，使得产物中不再存在非目标产物(通道2)；3)对于添加目标物的样品组，产物中同时存在目标产物和非目标产物，表明引物同时发生特异性扩增和非特异性扩增。值得注意的是，由于白色念珠菌基因组的存在，上述非特异性扩增不仅源于引物自身的相互作用，而且引物与基因组中非目标序列的结合(通道3)；4)添加T7 Exo后，T7 Exo在RPA扩增过程中抑制引物自身及其与非目标序列的相互作用，避免非特异性扩增的产生，使得产物中不再存在非目标产物(通道4)。这些结果表明，T7Exo‑RPA对非特异性扩增的抑制作用，同样适用于真菌检测。

[0109] 实施例14～17

[0110] (1)高温可使T7 Exo失去外切酶和内切酶的活性。为确定T7 Exo对RPA非特异性扩增的抑制作用，首先对比分析了高温对非特异性扩增的影响。随后，研究了其他厂家生产的不同酶活性的T7 Exo的影响。

[0111] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和240nM的硫代引物加入反应管中。然后，向反应管加入不同活性的T7 Exo，以及2.5μL相同浓度的基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0112] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样。将扩增产物在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表6。

[0113] 对比例14～15

[0114] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例14，差异在于RPA引物无化学修饰，同时RPA扩增体系未添加T7 Exo。RPA的非特异性扩增的抑制情况见表6。

[0115] 表6不同活性的T7 Exo抑制RPA非特异性扩增的性能

[0116]

[0117]

[0118] 图6A‑B为本发明方法(A‑B)添加活性的T7 Exo与热失活的T7 Exo与(C‑D)不同活性T7 Exo的RPA检测非洲猪瘟病毒基因组DNA的凝胶电泳图像和DNA条带的强度分析结果。图6A凝胶图像分别对应对比例14、实施例14和15；图6C凝胶图像分别对应对比例15、实施例
16和17。从图6可以看出：1)与未添加T7 Exo的传统RPA相比，添加具备核酸酶活性的T7 Exo可抑制RPA的非特异性扩增。然而，添加无活性的T7 Exo，则无法抑制RPA的非特异性扩增(图2A和2B)，表明T7 Exo的核酸酶活性在抑制过程中发挥主要作用；2)对于其他厂家(Thermo和MLAB)生产的T7 Exo，具备核酸酶活性的T7 Exo均可抑制RPA的非特异性扩增(图
2C和2D)。

[0119] 实施例18～19

[0120] (1)理论上，其他抗核酸酶水解的核苷酸修饰均可辅助T7 Exo抑制RPA的非特异性扩增，包括但不限于硫代修饰。

[0121] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和480nM的硫代引物加入反应管中。然后，向反应管加入T7 Exo，以及2.5μL的基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0122] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样。将扩增产物在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶电泳图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表7。

[0123] 对比例16

[0124] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例5和6，差异在于RPA引物无化学修饰，其目标产物对应的灰度值也见表7。

[0125] 表7引物修饰对T7 Exo抑制RPA非特异性扩增的影响

[0126]

[0127] 实施例20～23

[0128] (1)在RPA扩增中，随着引物浓度的增加，引物之间和引物与非目标序列之间的非特异性扩增可能加剧。因此，引物浓度影响T7 Exo的使用量。

[0129] (2)按照RPA试剂盒的操作说明，将RPA扩增试剂和不同浓度的硫代引物加入反应管中。然后，向反应管加入一定浓度的T7 Exo，以及2.5μL相同浓度的基因组DNA样品，并用超纯水控制最终的反应液体积为25μL。在混合均匀后，反应管置于37℃恒温扩增4分钟，再次混匀后继续恒温扩增16分钟。最后，将反应管置于>85℃的水浴中10分钟，停止反应。

[0130] (3)配置12％的聚丙烯酰胺凝胶，并取5μL含上样缓冲的扩增产物进行上样。将扩增产物在140V电泳中分离60min后，以4S GelRed(2×)染色产物的条带，并利用Azure C300进行成像分析。此外，凝胶电泳图像中的目标条带的灰度值是通过ImageJ分析获得，结果见表8。

[0131] 对比例17～18

[0132] 本对比例采用的方法步骤和条件同实施例20，差异在于RPA引物无化学修饰，同时RPA扩增体系未添加T7 Exo。RPA的非特异性扩增的抑制情况见表8。

[0133] 表8不同活性的T7 Exo抑制RPA非特异性扩增的性能

[0134]

[0135] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0136] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。