[0001] 本发明属于属于微生物技术领域，具体涉及一种同时改善抑郁或焦虑情绪及睡眠的微生态制剂产品及其应用。

[0002] 焦虑症是一种伴有持久性精神紧张、焦虑不安的情绪，它是生物‑心理‑社会等综合因素作用的结果。

[0003] 抑郁症同样也属于一种情绪障碍类疾病，以情绪低落、兴趣减退或快感缺失等为核心症状，且具有慢性复发性和致残性。

[0004] 虽然两种病症的表现不完全一致，但是临床上焦虑症和抑郁症高度共病，睡眠障碍则是焦虑症抑郁症患者的最常见症状之一。

[0005] GABA(γ‑氨基丁酸)是一种天然的非蛋白质氨基酸(简称GABA)。它是人体中比较重要的抑制神经传达的物质，大约有30％的神经中枢受它影响。它可以舒缓或抑制过度兴奋与激烈的神经讯息传导，因而使人安定平和下来。主要集中在抑制中枢神经过度兴奋，对脑部具有安定作用，能够放松和消除神经紧张，稳定情绪，安神助眠。

[0006] B族维生素是多巴胺能和血清素等神经递质合成过程中的辅助因子。这两种神经递质都与情绪调节以及临床抑郁和焦虑有关。两者是抗抑郁药的常见靶标，补充B族维生素可以作为辅助治疗的一部分，通过调节神经递质的功能来优化情绪。

[0007] 叶酸，别名维生素B9，天津医科大学2020年发表的一项研究就对抑郁症大鼠增加了叶酸摄入量，分析了大鼠血清和大脑中白介素‑6和脑源性神经营养因子等这类会引发抑郁的物质，发现叶酸能够在大脑中通过好几种途径起到抗抑郁和焦虑的作用，认为叶酸可以作为潜在的抗抑郁药使用而不含任何副作用。

[0008] 乳酸菌作为一种食品安全级(GRAS)微生物，在食品工业中应用历史悠久，被公认为最具代表性的有益菌。与抗抑郁药相比，补充能在生物体内产γ‑氨基丁酸和叶酸的微生态制剂具有较低的不良副作用风险。

[0037] 下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

[0038] 除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

[0039] 除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0040] 实施例1：筛选能提高植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1叶酸产量的功能性物质

[0041] 叶酸是微生物生长繁殖必备的营养元素，去叶酸培养基能提供菌株除了叶酸之外的其余营养元素，若菌株自身能合成叶酸，则可以在去叶酸培养基中生长繁殖，降低培养基pH值，含有溴甲酚紫指示剂的培养基颜色会由紫变黄，反之培养基则不变色；菌株合成叶酸含量越高则在无叶酸培养基中的生长情况越好，培养基黄色越深。

[0042] 本实施例选用市售的无叶酸培养基(FACM)，称取9.40gFACM，另称取50mg抗坏血酸，加热溶解于100ml蒸馏水中，分装试管，每管5ml，使沉淀物分散均匀，分别加入0.05g菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、棉子糖、抗性糊精、麦芽糊精、抗性淀粉、玉米淀粉、小麦低聚肽、谷氨酰胺、乳清蛋白、大豆蛋白后用蒸馏水补充体积至10ml，每管中加入0.1ml溴甲酚紫指示剂，121℃高压灭菌5min，待培养基冷却至室温后，在无菌环境下称12
取0.0100g活菌数为5.0×10 cfu/g的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑
9
Lpl‑1(即初始接菌活菌数5.0×10cfu/ml)接种于分别含有菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、棉子糖、抗性糊精、麦芽糊精、抗性淀粉、玉米淀粉、小麦低聚肽、谷氨酰胺、乳清蛋白、大豆蛋白后的FACM培养基和空白FACM培养基中培养17h后观察培养基颜色编号情况和测试培养后活菌数。

[0043] 筛选结果(表1)显示乳清蛋白、小麦低聚肽、谷氨酰胺、菊粉、低聚果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、麦芽糊精、抗性淀粉均能显著增加植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1的叶酸产量和提高植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1的存活率。

[0044] 表1提高植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1叶酸产量的功能性物质筛选

[0045]功能性物质 培养基颜色变黄程度 培养后活菌数cfu/ml
10
无功能性物质 + 4.8×10
10
菊粉 + 5.0×10
10
低聚果糖 ++ 5.5×10
10
低聚半乳糖 ++ 5.6×10
10
低聚异麦芽糖 ++ 5.3×10
10
水苏糖 ++ 6.0×10
10
棉子糖 + 4.7×10
10
抗性糊精 + 4.5×10
10
麦芽糊精 ++ 5.1×10
10
抗性淀粉 ++ 5.0×10
10
玉米淀粉 + 7.5×10
10
小麦低聚肽 +++ 7.8×10
10
谷氨酰胺 +++ 8.2×10
10
乳清蛋白 ++ 5.5×10
10
大豆蛋白 + 4.2×10

[0046] “+”表示培养基颜色为淡黄色，“++”表示培养基黄色加深，“+++”表示培养基颜色为深黄色。

[0047] 实施例2.筛选能提高植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性的功能性物质

[0048] 谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶能催化L‑谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，因此测定植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1在含有L‑谷氨酸钠的发酵培养基中培养后γ‑氨基丁酸的产量可以反应植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性，即γ‑氨基丁酸产量越高，谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性越高。

[0049] 本实施例选用的发酵培养基为MRS培养基，MRS培养基的成分如下：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，无水乙酸钠5.0g，MgSO4.7H2O0.2g，MnSO4.4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g加蒸馏水至1000ml后调节pH值至6.40，115℃高压灭菌20min。分别在发酵培养基中添加经无菌滤膜过滤除菌的L‑谷氨酸钠、L‑谷氨酸钠+菊粉、L‑谷氨酸钠+低聚果糖、L‑谷氨酸钠+低聚半乳糖、L‑谷氨酸钠+低聚异麦芽糖、L‑谷氨酸钠+水苏糖、L‑谷氨酸钠+棉子糖、L‑谷氨酸钠+抗性糊精、L‑谷氨酸钠+麦芽糊精、L‑谷氨酸钠+抗性淀粉、L‑谷氨酸钠+玉米淀粉、L‑谷氨酸钠+小麦低聚肽、L‑谷氨酸钠+谷氨酰胺、L‑谷氨酸钠+乳清蛋白、L‑谷氨酸钠+大豆蛋白，使发酵培养基中L‑谷氨酸钠、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、棉子糖、抗性糊精、麦芽糊精、抗性淀粉、玉米淀粉、小麦低聚肽、谷氨酰胺、乳清蛋白、大豆蛋白的终浓度分别为5g/L，在无菌环境下
12
称取0.0100g活菌数为5.0×10 cfu/g的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑
9
Lpl‑1(即初始接菌活菌数5.0×10 cfu/ml)分别接种于含有L‑谷氨酸钠、L‑谷氨酸钠+菊粉、L‑谷氨酸钠+低聚果糖、L‑谷氨酸钠+低聚半乳糖、L‑谷氨酸钠+低聚异麦芽糖、L‑谷氨酸钠+水苏糖、L‑谷氨酸钠+棉子糖、L‑谷氨酸钠+抗性糊精、L‑谷氨酸钠+麦芽糊精、L‑谷氨酸钠+抗性淀粉、L‑谷氨酸钠+玉米淀粉、L‑谷氨酸钠+小麦低聚肽、L‑谷氨酸钠+谷氨酰胺、L‑谷氨酸钠+乳清蛋白、L‑谷氨酸钠+大豆蛋白的发酵培养基中培养24h后测定培养基上清γ‑氨基丁酸的含量结果如表2。

[0050] 发酵上清液中γ‑氨基丁酸的测定实验方法如下：取100μl样品液+100μl硼酸盐缓冲液pH9.0(0.05M硼砂以及0.2M硼酸混合至pH9.0)+100μl 1％FDNB乙腈溶液，封口膜封口，混匀，离心，60℃避光水浴1h，取出放置室温，离心，再加700μl 0.1mol/L磷酸氢二钾pH7.2缓冲液，混匀，过0.22um有机滤头后上机检测，检测条件为C18柱(250*4.6mm，5um)，检测波长360nm，流速1.0ml/min，柱温35℃，进样量10μl，流动相为乙腈：超纯水：0.1mol/L磷酸氢二钾pH7.2缓冲液＝2:2:6，等度运行35min。

[0051] 表2提高植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1谷氨酸脱氢酶和谷氨酸脱羧酶活性的功能性物质筛选

[0052] 功能性物质 培养后发酵培养基上清γ‑氨基丁酸含量(g/L)无功能性物质 1.77
菊粉 1.81
低聚果糖 2.03
低聚半乳糖 2.09
低聚异麦芽糖 2.12
水苏糖 1.93
棉子糖 1.89
抗性糊精 1.88
麦芽糊精 2.01
抗性淀粉 2.03
玉米淀粉 2.41
小麦低聚肽 3.20
谷氨酰胺 3.40
乳清蛋白 1.89
大豆蛋白 1.73

[0053] 实施例3.一种改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的固体饮料

[0054] 本实施例提供一种能够改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的益生菌固体饮料，是由下列重量的组分组成：每100g的益生菌饮料中含有麦芽糊精48.00g、抗性淀粉18.00g、低聚果糖10.00g、菊粉10.00g、低聚异麦芽糖5.00g、小麦低聚肽5.00g、谷氨酰胺2.00g、和MHS‑Lpl‑1益生菌菌粉2.00g。混合均匀后无菌分装，于4‑8℃储存。经检测(参考GB4789.35‑20168
方法描述)，该固体饮料的益生菌活菌数为3.3×10CFU/g。

[0055] 实施例4.一种改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的发酵果蔬饮料

[0056] 本实施例提供一种能够改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的功能性益生菌发酵果蔬饮料，是由下列重量的组分组成：饮用水50.00g，复合果蔬汁30.00g(20％浓缩苹果汁、20％浓缩蓝莓汁、20％浓缩胡萝卜汁、20％浓缩芹菜汁、10％浓缩草莓汁、5％山药汁、3％酸枣汁、2％洛神花汁)，10.00g白砂糖，3.00g谷氨酰胺，2.00g小麦低聚肽，95℃灭菌5min后冷却至室温，接种MHS‑Lpl‑1益生菌菌粉2.00g，密闭后37℃发酵48～72，然后在无菌条件下分装至小瓶中，4℃储存。经检测(参考GB4789.35‑2016方法描述)，该发酵果蔬饮料的益生菌活8
菌数为8.96×10CFU/g。

[0057] 实施例5.一种改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的发酵酸奶

[0058] 本实施例提供一种能够改善抑郁、焦虑情绪，改善睡眠的功能性益生菌发酵酸奶，是由下列重量的组分组成：鲜牛乳100.00g，白砂糖8.00g，低聚木糖10.00g，小麦低聚肽2.00g，谷氨酰胺2.00g，95℃灭菌5min后冷却至40℃，接种MHS‑Lpl‑1益生菌菌粉2.00g，密封后置于酸奶机在40℃发酵6‑10h，然后置于4℃冰箱中12h。经检测(参考GB4789.35‑2016
8
方法描述)，该发酵酸奶的益生菌活菌数为4.2×10CFU/g。

[0059] 实施例6.实施例3中的固体饮料在改善独居老人抑郁样行为及睡眠质量中的应用[0060] 选取16名独居老人志愿者(年龄≥60岁)，随机分为两组，连续4周每天分别服用实施例3中的固体饮料5g和安慰剂5g，每周填写一次老年抑郁量表(GDS)和睡眠质量问卷调查表，根据填表结果对志愿者抑郁样行为及睡眠质量进行赋分。结果如表3，可以看到，连续服用本实施列3中的固体饮料能有效缓解独居老年人的抑郁样行为，改善独居老人的睡眠质量。

[0061] 表3实施例3中的固体饮料改善独居老人抑郁样行为及睡眠质量

[0062]

[0063] 注：抑郁样行为评分满分为30分，分值越高表示抑郁越严重；睡眠质量评分满分为10分，分值越高表示睡眠质量越好；与安慰剂组比较，*：p<0.05；#：p<0.01[0064] 实施例7.实施例4中的发酵果蔬饮料改善中年人职场焦虑及睡眠质量

[0065] 选取30名经Workplace Anxiety Scale职场焦虑量表(Mccarthy,J.M.,Trougakos,J.P.,&Cheng,B.H.(2016))评估分值≥30分的中年职员(30～45岁)，随机分为两组，连续3个月每天分别服用实施例4中的发酵果蔬饮料50ml和安慰剂果蔬饮料50ml，每天用智能手环记录志愿者的睡眠情况，每个月填写一次Workplace Anxiety Scale职场焦虑量表，根据填表结果和智能手环收集到的睡眠数据对志愿者焦虑样行为及睡眠质量进行赋分。结果如表4，可以看到，连续服用本实施列4中的发酵果蔬饮料能有效缓解中年职场人的焦虑样行为，改善中年职场人的睡眠质量。

[0066] 表4实施例4中的发酵果蔬饮料改善中年人职场焦虑及睡眠质量

[0067]

[0068] 注：焦虑样行为评分满分为40分，分值越高表示抑郁越严重；睡眠质量评分满分为10分，分值越高表示睡眠质量越好；与安慰剂组比较，*：p<0.05；#：p<0.01。对比例1.植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1与本公司其余20株植物乳杆菌菌株(植物乳杆菌MHS‑P‑1——植物乳杆菌MHS‑P‑20)叶酸产量及γ‑氨基丁酸产量对比[0069] 分别取21株植物乳杆菌菌粉以初始接菌活菌数5.0×109cfu/ml接种于含有5.0g/L L‑谷氨酸钠的发酵培养基中培养24h后根据实施例2的实验方法测定发酵上清液中γ‑氨基丁酸的含量；叶酸含量测试方法如下：吸取1ml待测样品过0.22μm滤膜于进样瓶中，上机检测，检测条件为C18柱(250*4.6mm，5um)，检测波长280nm，流速1.0ml/min，柱温29℃，进样量10μl，流动相为甲醇：PBS＝1:9，等度运行30min；结果见附图1。附图1的结果显示，在同等实验条件下，植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)MHS‑Lpl‑1发酵后培养基上清中γ‑氨基丁酸和叶酸产量远远高于其余20株植物乳杆菌。对比例2.实施例3中的固体饮料与其余5款市售益生菌固体饮料(S1——S5)的在模拟胃肠道发酵体系中肠道存活率、γ‑氨基丁酸和叶酸产量对比

[0070] 对照组为购于天猫国际的5款均宣称有改善睡眠或舒缓压力的功效的益生菌固体饮料，分别为S1：Life Space Probiotics+Sleep Support；S2：Life Space Probiotics+Stress Relief；S3：Garden of Life Dr.Formulated PROBIOTICS Mood+；S4：Garden of LifeDr.Formulated PROBIOTICS Restore Sleep with Herbs；S5：OMNi BiOTiC SR‑9。

[0071] 分别称取0.2g实施例3中的固体饮料(M‑3)和5款市售益生菌固体饮料(S1——S5)于1ml无菌生理盐水充分混匀后，吸取0.2ml混匀后的菌悬液接种于10ml pH＝3.0的MRS培养基中培养2h采用活菌计数法测试菌株存活率；将培养后的菌悬液离心去掉上清，且用无菌生理盐水清洗一次后加入10ml含10g/L牛胆盐的MRS培养基中培养4h后采用活菌计数法测试菌株存活率；结果显示(附图2)，实施例3中的固体饮料肠道存活率远远高于其余5款市售益生菌固体饮料。

[0072] 分别称取0.2g实施例3中的固体饮料(M‑3)和5款市售益生菌固体饮料(S1——S5)于1ml无菌生理盐水充分混匀后，吸取0.2ml混匀后的菌悬液接种于10ml含10％健康志愿者新鲜粪菌的PBS中培养，测试培养体系培养24h后γ‑氨基丁酸含量及叶酸含量。γ‑氨基丁酸含量测试方法同实施例2，结果(附图3)显示，实施例3中的固体饮料在肠道中发酵后γ‑氨基丁酸产量和叶酸产量远远高于其余5款市售益生菌固体饮料。

[0073] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。