[0001] 本发明涉及含RNA组合物的领域，更具体地说，涉及用于冷冻储存的含体外转录的mRNA的组合物的稳定化。具体而言，本发明提供了用于减少或避免在此类含RNA的组合物(即使是冷冻并随后解冻的)中形成聚集体/沉淀物的解决方案。此外，本发明提供了通过在冷冻所述组合物之前向所述组合物中添加金属结合螯合剂来防止在冷冻或解冻的含RNA的组合物中形成聚集体/沉淀物的手段和方法。技术背景

[0002] 含mRNA/RNA组合物的体内应用领域的主要挑战之一是RNA的稳定性。从本质上来说，与单链相比双链DNA是稳定得多的，其柔性更大得多并可形成弱的内部键。此外，RNA在核糖的第二个碳上有羟基，这增加了糖‑磷酸骨架断裂的可能性。另外，RNA对由内源性核糖核酸酶产生的降解非常敏感，然而，在冷冻RNA样品时，内源性核糖核酸酶会迅速失活。因此，通常冷冻RNA以长期保存。

[0003] 尽管体外转录的RNA可直接用于进一步加工或纯化，但有时首先冷冻RNA(诸如在另一个设施中进行进一步加工的情况下)可以是有利的；或者用于累积较大的批次以供进一步处理。然而，在体外转录后但在进一步加工前冷冻RNA的这种情况下，本申请的发明人鉴定了特定mRNA分子的低温贮存导致其在解冻样品后聚集。显然，解冻后mRNA分子的聚集是非常不想要的，特别是在仍然需要进一步加工/纯化的情况下。例如，当样品进行后续的柱纯化步骤时，沉淀被认为是体外转录的mRNA损失的主要原因。因此，本发明的目的是提供该问题的解决方案。

[0004] 在含有CAP‑1结构的体外转录的mRNA样品中特别地观察到了聚集体的形成，在二价金属离子存在的情况下最为明显。此类金属离子通常在体外转录过程中作为其中所用酶的辅因子存在。

[0005] 本发明的发明人出乎意料地发现，金属离子，特别是二价金属离子诸如Mg2+是mRNA_IVT混合物在低于0℃的温度下储存后解冻后的沉淀过程中涉及的组分之一。加入金2+
属结合螯合剂如EDTA以隔离金属离子诸如Mg 有效地解决了含有CAP‑1结构的mRNA分子中的沉淀问题。本发明人表明沉淀在至少三种情况下发生：首先，含有CAP‑1结构的mRNA样品显示沉淀。第二，沉淀仅发生在储存温度低于0℃后解冻的样品中。第三，沉淀发生在含有金
2+
属离子诸如Mg 阳离子的样品中。

[0006] 因此，本发明提供了用于减少或避免在此类含RNA的组合物(即使是冷冻并随后解冻的)中形成聚集体/沉淀物的解决方案。在IVT反应结束时，金属结合螯合剂诸如EDTA的存在至少有三个主要好处。除了(i)保持RNA的电荷和构象均一性和(ii)防止在某些条件下形成聚集体之外，金属结合螯合剂的存在还(iii)防止RNA降解，因为作为核酸酶的金属依赖性酶会失活。在需要长期储存mRNA_IVT混合物的情况下，EDTA防止聚集和RNA降解的能力可能起到至关重要的作用。发明概要

[0007] 在第一方面，本发明涉及减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′CAP‑1结构的体外转录的mRNA；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。

[0008] 在本发明的具体实施方案中，所述组合物还包含二价金属离子。

[0009] 在本发明的另一个具体实施方案中，所述金属结合螯合剂能够结合二价金属离子。

[0010] 在特定的实施方案中，所述二价金属离子选自包括以下的列表：Ca2+离子、Cu2+离2+ 2+ 2+ 2+
子、Fe 离子、Zn 离子和Mg 离子；优选地Mg 离子。

[0011] 在又一另外的特定实施方案中，在所述组合物中以等摩尔浓度(mol dm‑3)或高于所述二价金属离子的浓度的浓度使用所述金属结合螯合剂。

[0012] 在本发明的具体实施方案中，所述金属结合螯合剂选自包括以下的列表：BAPTA(1,2‑双(2‑氨基苯氧基)乙烷‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、DFOA(甲磺酸去铁胺)、二甲氧基硝基苯胺(1‑(2‑硝基‑4,5‑二甲氧基苯基)‑1,2‑二氨基乙烷‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、EDTA钙钠、EDTA四钠、EGTA(乙二醇‑双(β‑氨基乙基醚)‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、CDTA(1,2‑环己二胺四乙酸)、DPTA(二乙烯三胺五乙酸)、PIH(吡哆醛异烟酰腙)、TPEN(N′‑四(2‑吡啶基甲基)乙二胺)。

[0013] 在本发明的特定实施方案中，所述冷冻或解冻的组合物将在或已经在‑20℃或更低的温度下冷冻。

[0014] 在另一个特定实施方案中，所述解冻的组合物将在或已经在约20℃与30℃之间解冻。

[0015] 在另一方面，本发明还提供了金属结合螯合剂用于减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的用途，所述组合物包含具有CAP‑1结构的体外转录的mRNA分子。

[0016] 发明详述

[0017] 如上文已经详述的，本发明涉及用于冷冻储存的体外转录的含mRNA组合物的稳定化。特别地，其涉及避免或减少冷冻样品中的沉淀，从而在后续纯化诸如柱沉淀后显著增加mRNA的产量。特别地，在IVT(体外转录)之后，在进一步加工之前，诸如在不同的位置/设施进行进一步加工时，将获得的mRNA组合物储存特定的一段时间可能是有益的。然而，由于mRNA的性质，这种储存优选在‑20℃或更低的降低的温度下进行。本发明人已经发现，尽管在降低的温度下储存IVT mRNA混合物，仍导致了聚集体/沉淀物的形成，这对于进一步的加工显然是不希望的。为此，本发明人已经建立了确定此类沉淀物形成的原因的研究计划，以及避免/减少此类沉淀物的解决方案。其细节可在下文的实施例部分找到。

[0018] 基于这些观察，本发明的第一方面涉及减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的方法，所述组合物包含具有5′CAP‑1结构的体外转录mRNA；所述方法包括：在冷冻所述组合物之前，向所述组合物中加入金属结合螯合剂。

[0019] 在本发明的说明书中，术语“减少(reduc ing)”或可替代地“降低(to reduce)”意指“变少(lessen)”、“减少(decrease)”、“最小化(minimize)”或“削减(diminish)”所述样品中聚集的形成。因此，当样品在正常情况下冷冻后含有特定量的聚集体时，术语“减少”意指当将所述样品经受本发明的方法时，所述聚集体的量较低。特别地，当与未经处理的样品相比时，聚集体的量优选减少至少10％，诸如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％。

[0020] 在本发明的说明书中，术语“防止”或可替代地“阻止”意指完全(即100％)或至少显著地“停止”、“避免”、“阻止”、“阻断”或“停止”所述样品中聚集的形成。其中与未经处理的样品相比，显著地意指至少为95％，诸如至少为96％，至少为97％，至少为98％，至少为99％。

[0021] 聚集体的量可以通过目测检查样品来确定，或者可选地使用合适的技术通过实验来确定。例如，通过确定特定波长(例如600nm)下紫外光谱的变化作为沉淀物形成/浊度的量度，紫外光谱分析可用于测量聚集。信号测量的基本原理是检测特定波长下的光散射，其中通过样品的光透射充当浊度计，使得混浊(沉淀的样品)中的电信号比不含沉淀物的样品中的电信号弱。

[0022] 在本发明的说明书中，术语“形成”意指所述样品中聚集体的“出现”、“发展”、“起源”或“产生”。具体而言，体外转录后获得的样品通常不含聚集体，而我们已经确定特定组分的存在可导致在冷冻/解冻循环中形成此类聚集体。

[0023] 在本发明的说明书中，术语“聚集体”或可选地“聚集”意指组合物中存在的组分的“附聚”、“成簇”、“结块”或“积聚”，使得所述组分彼此如此接近，以至于它们形成聚集体、簇、块……，其可以大到或可以不大到足以进行目测检查，诸如呈样品的混浊外观的形式或甚至更大的单独可感知的聚集体群的形式。所述聚集也可导致沉淀物的形成，所述沉淀物足够大以在包含所述组合物的试管底部形成一层聚集体。

[0024] 在本发明的说明书中，术语“冷冻的”或可替代地“冷冻”意指“冷却”、“结冰”或“降低温度”到0℃以下。优选地，将本发明的组合物在约‑20℃或更低的温度下冷冻。在特定实施方案中，可将本发明的组合物在约‑80℃的温度下冷冻。“”

[0025] 在本发明的说明书中，术语“解冻的”或可替代地“解冻”意指“除霜”、“除冰”或“提高温度”至约0℃或高于0℃。优选地，将本发明的组合物在室温(诸如约20℃‑25℃或更高)下解冻。在特定实施方案中，可将本发明的组合物在约30℃，诸如约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃或约75℃的温度下解冻。

[0026] 特别发现冷冻和解冻的单一循环导致在体外转录的mRNA样品中，尤其是在具有5′CAP‑1结构的mRNA样品中形成聚集。显然，多次冻融循环只会恶化观察到的效果。

[0027] 在本发明的说明书中，术语“金属螯合剂”意指能够结合金属离子的分子。据此，金属螯合剂可用于捕获组合物中的金属离子，使得它们不再与所述组合物中的带负电荷的离子相互作用。

[0028] 所观察到的聚集在包含正金属离子的组合物中特别明显。在本发明的说明书中，术语“正金属离子”意指为阳离子，特别是净电荷为正的金属。阳离子是电子比质子少的带正电荷的离子，即失去了电子。在本发明的说明书中，带双电荷(或二价)的金属离子或阳离2+
子的聚集最明显。这些是失去两个电子的离子，并且通常被注释为如下M ；其中‘M’代表金
2+
属原子，‘ ’代表二价电荷。

[0029] 据此，在本发明的具体实施方案中，组合物还可包含正金属离子；特别是二价金属2+ 2+
离子。在特定的实施方案中，所述二价金属离子选自包括以下的列表：Ca 离子、Cu 离子、
2+ 2+ 2+ 2+ 2+
Fe 离子、Zn 离子和Mg 离子；优选地Mg 离子。或者，合适的二价金属离子可以是例如Ba
2+ 2+ 2+ 2+
离子、Be 离子、Pb 离子、Mn 离子和Sn 离子。

[0030] 据此，在本发明的说明书中，使用能够结合二价金属离子的金属结合螯合剂是有利的。在本发明的具体实施方案中，所述金属结合螯合剂可以选自包括以下的列表：BAPTA(1,2‑双(2‑氨基苯氧基)乙烷‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、DFOA(甲磺酸去铁胺)、二甲氧基硝基苯胺(1‑(2‑硝基‑4,5‑二甲氧基苯基)‑1,2‑二氨基乙烷‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、EDTA(乙二胺四乙酸)、EDTA钙钠、EDTA四钠、EGTA(乙二醇‑双(β‑氨基乙基醚)‑N,N,N′,N′‑四乙酸)、CDTA(1,2‑环己二胺四乙酸)、DPTA(二乙烯三胺五乙酸)、PIH(吡哆醛异烟酰腙)、TPEN(N′‑四(2‑吡啶基甲基)乙二胺)。

[0031] 特别地，已知一分子金属螯合剂诸如EDTA能够螯合一个金属离子。因此，为了从组合物中捕获足够量的二价金属离子以最大程度地减少聚集，在所述组合物中以等摩尔浓度‑3(mol dm )或高于所述二价金属离子的等摩尔浓度的浓度使用金属结合是有利的。

[0032] 添加金属螯合剂可能有三个好处。首先，其将停止需要金属离子存在作为辅因子的酶促反应，其次，其将螯合金属离子从而防止聚集体形成。最后，添加金属螯合剂将有助于保持RNA的同质性，因为二价离子有助于在RNA中产生电荷和构象异质性的非特异性相互作用。

[0033] 在特定实施方案中，体外转录的mRNA分子可能具有5′CAP‑1、5′CAP‑2、5′m6Am结构，或其衍生物。真核5′帽由通过三磷酸桥连接到第一核苷酸的7‑甲基鸟苷(m7G)组成，形成称为ARCA帽类似物(5'CAP‑0类似物)的结构。在本发明的说明书中，术语“5′CAP‑1”是指在第一接近帽的核苷酸的核糖的第二碳上具有额外的甲基(2′单甲基化)的CAP‑0结构，如下文所示：

[0034]

[0035] 在本发明的说明书中，术语“5′CAP‑2”是指在第二接近帽的核苷酸的核糖的第二碳上具有额外的甲基(2′二甲基化)的CAP‑1结构。在本发明的说明书中，术语“5′m6Am”结构是指CAP‑1结构，其中第一核苷酸是在第六氮上带有甲基的腺苷，形成N6‑甲基腺苷(m6Am)。如本文中所用，加帽可涉及mRNA制造过程中的加帽策略。在具体实施方案中，加帽可以指其中在转录过程中掺入帽类似物的‘共转录加帽’。例如， 技术是产生天然的
Cap 1结构的专有的共转录5′加帽解决方案。在另一个实施方案中，加帽可以指其中使用基于酶的方法在mRNA合成后掺入帽类似物的‘转录后加帽’。

[0036] 在另一方面，本发明还提供了金属结合螯合剂用于减少和/或防止冷冻或解冻的组合物中聚集形成的用途，所述组合物包含具有CAP‑1结构的体外转录的mRNA分子。实施例

[0037] 先前的观察表明，含有 (即一种类型的5′CAP‑1结构)的体外转录的mRNA混合物(即IVT_mRNA混合物)在转移到冷敷包上期间或之后或在‑20℃下储存之后已经沉淀。这种沉淀被认为是体外转录的mRNA损失(特别是在样品经受后续的柱纯化步骤时)的主要原因。据此，下文详述的实施例说明了导致这种沉淀的条件和避免或至少减少沉淀的解决方案，从而即使在进一步纯化步骤后也能增加mRNA产量。

[0038] 实施例1：储存后具有5′CAP‑1沉淀体外转录的mRNA

[0039] 在该实验中，研究了是否可以通过在DNA酶I处理后立即用1.5倍体积的WFI(注射用水)稀释IVT_mRNA混合物(这相当于IVT_mRNA混合物的2.5倍的稀释)来避免样品沉淀。此外，该方案旨在检测IVT_mRNA混合物的储存条件(在4℃和‑20℃下持续24小时)和随后解冻对mRNA完整性的影响。此外，看似合理的根本原因，即mRNA在IVT_mRNA mix混合物中共沉淀得到了验证。该方案应用于编码人gp100、huCD40L、huCD70和TLR4ca的四种不同IVT_mRNA混合物的小规模生产。这四种情况代表了具有不同长度、GC含量和其二级结构的最小自由能的mRNA。作为阴性对照，使用WFI代替线性化的DNA模板。

[0040] 实验设置及结果

[0041] 产生0.8ml的在mRNA的5′末端具有 结构的编码gp100、huCD40L、huCD70和TLR4caco的未经修饰的mRNA。作为阴性对照，进行0.8ml反应，其中DNA模板被WFI取代。在DNA酶处理(800U/ml，持续30分钟)后，立即将四种IVT_mRNA混合物(0.8ml)和对照反应物的每一种充分混合，并分入Eppendorf管(20个样品，每个0.2ml级分)。

[0042] ‑将0.2ml的每种IVT_mRNA混合物和对照混合物在4℃下保持24小时。

[0043] ‑立即用1.5倍体积的WFI(等于0.3ml WFI)稀释0.2ml的每种IVT_mRNA混合物和对照混合物，并在4℃保持24小时。

[0044] ‑将0.2ml的每种IVT_mRNA混合物和对照混合物在‑20℃下保持24小时。

[0045] ‑立即用1.5倍体积的WFI(等于0.3ml WFI)稀释0.2ml的每种IVT_mRNA混合物和对照混合物，并在‑20℃保持24小时。

[0046] 24小时后，将样品放入设置为30℃的加热器中进行10min。在下一步中，将样品置于室温下，并目测评估沉淀迹象。沉淀物的存在用照片记录下来(表1)。

[0047] 表1：IVT_mRNA混合沉淀的目测评估(‑)无沉淀(+)有沉淀

[0048]

[0049] 如表1中所详述的，无论稀释与否，在储存于4℃的样品中都没有观察到沉积的沉淀物的可见迹象。唯一的例外是gp100，其在4℃下的未稀释和稀释状态下都是浑浊的。令人惊讶的是，在所有稀释(2.5x)并储存在‑20℃下的样品中，都形成了沉积的沉淀物。储存在‑20℃下的两个未稀释样品(gp100和WFI阴性对照)形成了沉积的沉淀物。基于所述结果，可以得出结论：在WFI中简单稀释IVT_mRNA混合物不足以解决在‑20℃储存时的沉淀问题。在4℃储存看起来更有保证，因为在此温度下没有检测到沉积的沉淀物。然而，在4℃储存的主要不利方面是更高的RNA降解风险。

[0050] 如表1所示，所有样品形成沉淀的唯一条件是稀释后并在‑20℃储存。将这些沉积的沉淀物离心(13000rpm持续10min)并溶解在WFI中用于进一步分析。测定溶解的沉淀物中RNA的量(表2)。在gp100样品中发现了最高量的RNA。发现这种RNA在储存后最容易形成沉淀物。重要地要指出，这些样品可能仍然含有一些游离的NTP，因为没有对它们进行纯化。阴性对照反应中NTP的存在加强了这一点。

[0051] 表2：沉淀物中RNA的量(μg)。

[0052]储存温度 稀释度 gp100 huCD40L huCD70 TLR4 ‑CTRL(WFI)
‑20℃ 2.5x 102.7 17.9 19.5 21.7 8.4

[0053] 实施例2：冷冻/解冻的IVT_mRNA混合物中沉淀的原因

[0054] 由于2.5倍稀释的IVT mRNA混合物在‑20℃储存后不抑制样品的沉淀(见实施例1)，因此开始研究沉淀的根本原因。重要的是要注意，沉淀仅发生在mRNA IVT混合物中，对于该混合物，在反应中使用了 (即CC)帽类似物(5′CAP‑1类似物)。利用ARCA
帽类似物(5′CAP‑0类似物)的传统IVT方法在储存后未显示任何沉淀迹象(数据未显示)。由于不含DNA模板和合理地不含RNA的阴性对照在‑20℃储存和随后解冻后也形成沉淀物，因此有理由假设核酸本身不负责引发沉淀。反应中的其它组分如下：T7反应缓冲液、NTP/帽混合物(ARCA或 )和T7酶混合物(T7聚合酶、RNasin核糖核酸酶抑制剂和焦磷酸
酶)。为了找出哪种组分导致沉淀，制备了缺少组分的模拟IVT混合物。模拟_IVT组合可以定义为：在体外转录过程中使用的不含DNA模板和蛋白质的IVT_混合物。不在37℃下温育该反应。第一项研究集中在T7反应缓冲液和NTP/CleanCap或ARCA混合物上。T7反应缓冲液包含以下组分：HEPES pH 7.8(452mM)、MgCl2(120mM)、亚精胺(10mM)、二硫苏糖醇(DTT)(200mM)和WFI。NTP/CleanCap混合物包含以下组分：ATP(20mM)、CTP(20mM)、UTP(20mM)、GTP(20mM)和CleanCap(20mM)。NTP/ARCA组合包含以下组分：ATP(12mM)、CTP(12mM)、UTP(12mM)、GTP(2.4mM)、ARCA(9.6mM)和WFI。

[0055] 所述第一项研究是在NTP/帽存在或不存在的情况下，对缺乏模板DNA和T7酶混合物的模拟IVT_混合物进行的。WFI被用来代替反应中不存在的组分。根据表3制备模拟IVT_混合物。

[0056] 表3：模拟IVT_混合物中的组分。

[0057] IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 5 6WFI 160μl 160μl 110μl 90μl 110μl 90μl
Lin_pDNA ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
T7缓冲液5x 40μl 40μl 40μl 40μl 40μl 40μl
NTP/混合物CC ‑ ‑ 50μl ‑ 50μl  
NTP/混合物ARCA ‑ ‑ ‑ 70μl ‑ 70μl
T7酶混合物 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
总计 200μl 200μl 200μl 200μl 200μl 200μl

[0058] 配置后，不进行稀释，将反应在‑20℃储存20小时，在30℃解冻10分钟。为了进行比较，使用了两个不同批次的T7反应缓冲液。在eppendorf 1、3和4中使用了第一批次的T7反应缓冲液。在eppendorf 2、5和6中使用了第二批次的T7反应缓冲液。这些实验的结果详述于表4中。

[0059] 表4：表3的混合物中的IVT_mRNA沉淀的目测评估(‑)无沉淀(+)有沉淀

[0060]IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 5 6
  ‑ ‑ + ‑ + ‑

[0061] 基于表4中所示的结果，可以得出结论：沉淀仅发生在存在NTP/ 混合物(即NTP/CC混合物)的反应中。在T7反应缓冲液和补充了NTP/ARCA混合物的T7反应缓冲液中未发现沉淀。由于NTP/CC混合物仅在T7反应缓冲液存在的情况下形成沉淀物，因此有理由假设沉淀是在 帽类似物存在的情况下由T7反应缓冲液的一些组分引起
的。在这一点上，直接排除NTP是沉淀的原因的可能性。为了解决在 存在的情
况下T7反应缓冲液的哪种组分负责沉淀的问题，制备了一系列T7反应缓冲液。系统地从配方中排除每种组分，并用WFI替代。制备了四种缓冲液：含所有组分的T7缓冲液；T7缓冲液‑DTT；T7缓冲液‑亚精胺；T7缓冲液‑MgCl2。随后，这些T7反应缓冲液用于制备表5中详述的模拟IVT_混合物。配置后，不进行稀释，将混合物在‑20℃下储存72小时。随后，将样品在30℃解冻10分钟。

[0062] 表5：模拟IVT_混合物中的组分。

[0063]

[0064] 表6所示的结果证实了之前的观察结果。

[0065] 表6：表5的混合物中的IVT_mRNA沉淀的目测评估(‑)无沉淀(+)有沉淀

[0066] IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 5  + ‑ + + ‑

[0067] 再次地，当将NTP/CC与NTP/ARCA头对头比较时(反应1和2)时，仅在具有的制剂中检测到沉淀物。只有缺乏MgCl2的T7反应缓冲液(反应5)未显示出沉
淀的迹象。总之，该结果表明MgCl2和 类似物是负责沉淀物形成的关键组分。

[0068] 为了进一步研究MgCl2在该过程中的作用，重要的是要找出哪种离子(Mg2+或Cl‑)在 存在的情况下负责沉淀。为此，制备5xT7反应缓冲液，其中120mM MgCl2被+ + 2+
代替为120mM LiCl或120mM NaCl。Li和Na 被认为代替了Mg 阳离子，并且在没有沉淀的情‑ 2+
况下，Cl 阴离子将被排除作为沉淀的可能原因。合理地说，这将证实Mg 在该过程中的作用。在这种情况下，将模拟IVT_混合物在4℃和‑20℃储存24小时，并在30℃解冻10分钟。模拟IVT_混合物的配方与上述实验中使用的相同。唯一的变化是MgCl2被代替为LiCl或NaCl(表7)

[0069] 表7:模拟IVT_混合物中的组分。

[0070]

[0071] 表8中所示的结果与之前的发现一致。

[0072] 表8：表7的混合物中的IVT_mRNA沉淀的目测评估(‑)无沉淀(+)有沉淀

[0073] IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 54℃ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
‑20℃ + ‑ ‑ ‑ ‑

[0074] 无论是否存在MgCl2、LiCl或NaCl，在4℃下都未观察到沉淀。在‑20℃下，只有含有‑ 2+MgCl2+NTP/CC的模拟IVT_混合物形成沉淀(反应1)。这表明Cl 不引起沉淀。据此，Mg 和被鉴定为引起沉淀的关键组分。令人惊讶的是，冷冻和解冻循环也是沉淀发
生所必需的。

[0075] 实施例3：用于减少冷冻/解冻的IVT_mRNA混合物中沉淀的解决方案2+

[0076] 据此，如实施例2中所详述的，确定Mg 与 的组合是引起沉淀的关键2+
组分。因此，在本实施例中，我们通过递增量的乙二胺四乙酸(EDTA)来螯合Mg ,以测试避免这种沉淀的解决方案。EDTA是在医学和分子生物学中广泛用于螯合二价和三价金属离子诸如钙、镁、铅和铁的螯合剂。鉴于EDTA防止DNA和RNA降解的能力，使用EDTA可能更有利，因为作为核酸酶的金属依赖性酶可能会失活。

[0077] 配制后，用递增浓度的WFI‑EDTA溶液将模拟IVT_混合物稀释2倍(表9)，并在4℃和‑20℃下储存24小时，在室温下解冻10分钟。选择室温而不是30℃,因为观察到沉淀物在升高的温度下倾向于部分溶解。

[0078] 表9：稀释后模拟IVT_混合物中EDTA的浓度。

[0079]IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 5 6 7
EDTA ‑ ‑ 6mM 12mM 24mM 48mM 240mM
稀释度 ‑ 2x 2x 2x 2x 2x 2x

[0080] 再次证实，无论是否存在ARCA或CleanCap，在4℃下都未观察到沉淀(表10)。

[0081] 表10：表9的混合物中IVT_mRNA沉淀的目测评估(‑)无沉淀(+)有沉淀

[0082]IVT_mRNA混合物 1 2 3 4 5 6 7
4℃‑NTP/ARCA ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
4℃‑NTP/CC ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
‑20℃‑NTP/ARCA ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑
‑20℃‑NTP/CC + + ‑ ‑ ‑ ‑ ‑

[0083] 此外，经证实，沉淀似乎仅在使用 以及在‑20℃储存混合物的条件下才会发生。当 被替代为ARCA时，未观察到聚集。目测研究表明，少至6mM的
EDTA(反应3)就能阻止沉淀。尽管在加入6mM EDTA后没有可见的沉淀物，但在延长的储存时间后仍有可能在一定程度上发生沉淀。在其中将含有EDTA的IVT混合物在‑20℃储存长达3个月的保持时间研究(hold‑time study)中，未观察到RNA的降解(数据未显示)。在2倍稀释
2+
后，将24mM MgCl2稀释至12mM。基于这一假设，12mM EDTA应该螯合溶液中的所有Mg 。因为这些实验是在不存在核酸和蛋白质的模拟IVT混合物中进行的，所以在实践中可以使用更高浓度的EDTA，以完全避免沉淀形成的可能性。

[0084] 结论

[0085] 总之，结果表明，要发生沉淀，必须满足三个条件。第一个条件是使用类似物。当使用ARCA帽类似物时，在研究期间未观察到沉淀。第二个条件是反
2+ 2+ + +
应中存在Mg 阳离子。Mg 被替代为Na 或Li并不伴随沉淀。第三个条件是‑20℃的储存温
2+
度。在4℃时未观察到沉淀。在认识到Mg 是该过程中涉及的组分之一后，出现了对储存后
2+
mRNA_IVT混合物沉淀的潜在解决方案。添加EDTA作为螯合剂来螯合Mg 有效地解决了沉淀问题。当作为核酸酶的金属依赖性酶失活时EDTA防止RNA降解的能力可能在需要长期储存mRNA IVT_混合物的情况下发挥关键作用。