[0001] 本发明涉及木脂素提取技术领域，具体涉及一种五味子藤茎木脂素提取条件的响应面法优化方法。

[0002] 北五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis)的干燥成熟果实。北五味子是传统滋补类中药材之一，主要含有木质素、多糖类、挥发油和三萜类等成分，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等功效。北五味子藤茎为北五味子的干燥藤茎，北五味子藤茎中所含化学成分与果实相似，尤其是木质素类成分含量较高，其中，五味子木脂素类成分是五味子提取分离的主要考察指标。

[0003] 优化北五味子藤茎中木脂素的主要方法为正交试验方法，采用该方法可以找出多个因素水平的最佳组合。但是正交试验方法只能分析离散型数据，具有精度不高，预测性不佳的缺点。

[0043] 本发明提供了一种五味子藤茎木脂素提取条件的响应面法优化方法，包括以下步骤：

[0044] 将五味子藤茎与乙醇水溶液混合，进行提取，得到醇提物；

[0045] 将所述醇提物溶解于乙醇中并定容至设定的体积，得到醇提物溶液；

[0046] 测试所述醇提物溶液中的木脂素含量，得到木脂素含量最大的条件下对应的四因素的各单一因素值；所述四因素为溶媒用量、乙醇溶液中乙醇体积分数、提取次数和单次提取时间，所述溶媒用量为提取用乙醇水溶液与五味子藤茎的质量比；

[0047] 以所述四因素为自变量，以所述各单一因素值为中间值进行自变量取值，以木脂素提取率为响应值，进行响应面法优化，得到木脂素提取率对所述四因素的二次回归模型方程；

[0048] 根据所述二次回归模型方程得到在所述四因素交互作用下的木脂素提取率最大值对应的溶媒用量、乙醇体积分数、提取次数和单次提取时间。

[0049] 如无特殊说明，本发明采用的原料均为市售商品。

[0050] 本发明将五味子藤茎与乙醇水溶液混合，进行提取，得到醇提物。在本发明中，所述五味子藤茎与乙醇水溶液的溶媒用量(即溶媒用量)的取值范围优选为10～20mL/g，更优选为13～14mL/g，进一步优选为13.56mL/g。在本发明中，所述乙醇溶液中乙醇体积分数的取值范围优选为50～90％，更优选为80～90％，进一步优选为90％。在本发明中，所述提取次数的取值范围优选为1～3次，更优选为2～3次；单次提取时间的取值范围优选为30～90min，更优选为35～50min，进一步优选为36～37min，最优选为36.64min；所述提取的温度优选为室温(25℃)。

[0051] 所述提取完成后，本发明优选还包括将所得提取体系过滤，将所得提取液浓缩至恒重，得到醇提物。在本发明中，所述浓缩优选为水浴蒸干；本发明对于所述水浴蒸干的温度没有特殊限定，以木脂素化合物的结构不发生变化为准。

[0052] 得到醇提物后，本发明将所述醇提物溶解于乙醇中并定容至设定的体积，得到醇提物溶液。在本发明中，以所述五味子藤茎的干重计，所述醇提物溶液的浓度优选为10～30g/mL，更优选为20～25g/mL。

[0053] 得到醇提物溶液后，本发明测试所述醇提物溶液中的木脂素含量，得到木脂素含量最大的条件下对应的四因素的各单一因素值；所述四因素为溶媒用量、乙醇溶液中乙醇体积分数、提取次数和单次提取时间，所述溶媒用量为提取用乙醇水溶液与五味子藤茎(干重)的质量比。

[0054] 在本发明中，所述测试所述醇提物溶液中的木脂素含量的方法优选包括高效液相色谱法。在本发明中，所述高效液相色谱法优选包括以下步骤：将所述醇提物溶液中的木脂素进行高效液相色谱检测，得到待测木脂素峰面积；根据所述待测木脂素峰面积与线性曲线，计算醇提物溶液中木脂素含量；所述线性曲线为木脂素的色谱峰面积与木脂素质量浓度的线性曲线。

[0055] 本发明将所述醇提物溶液中的木脂素进行高效液相色谱检测，得到待测木脂素峰面积。

[0056] 在本发明中，所述测试所述醇提物溶液中的木脂素含量的方法优选包括高效液相色谱法。在本发明中，所述高效液相色谱法的测试条件包括：色谱柱填料优选为十八烷基硅烷键合硅胶，更优选为AgilentZORBAX SB‑C18色谱柱；柱温优选为30℃，检测波长优选为220nm，流动相体系优选包括流动相A和流动相B，所述流动相A优选为乙腈，所述流动相B优选为水，所述流动相的流速优选为1.0mL/min，进样量优选为10μL，洗脱方式优选为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序优选如表1所示。

[0057] 表1梯度洗脱程序

[0058] 时间/min 流动相A体积分数/％ 流动相B体积分数/％0～10 49 51
10～15 49→70 51→30
15～20 70→52 30→48
20～70 52 48
70～73 52→95 48→5
73～78 95 5
78～81 95→49 5→51
81～90 95 5

[0059] 得到待测木脂素峰面积后，本发明根据所述待测木脂素峰面积与线性曲线，计算醇提物溶液中木脂素含量；所述线性曲线为木脂素的色谱峰面积与木脂素质量浓度的线性曲线。

[0060] 在本发明中，所述线性关系的绘制方法优选包括以下步骤：配制线性木脂素对照品混合液，将所述线性木脂素对照品混合液进行高效液相色谱检测，得到木脂素峰面积，将所述木脂素峰面积与木脂素的浓度进行线性拟合，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归得到线性曲线。

[0061] 在本发明中，所述线性木脂素对照品混合液的配制方法优选包括以下步骤：以甲醇为溶剂配制木脂素对照品混合贮备液，将所述木脂素对照品混合贮备液进行甲醇稀释至刻度后摇匀，得到线性木脂素对照品混合液。在本发明的具体实施例中，所述木脂素对照品混合贮备液中五味子醇甲对照品的浓度优选为521.7μg/mL，五味子醇乙对照品的浓度优选为504.9μg/mL，五味子甲素对照品的浓度优选为514.3μg/mL，五味子乙素对照品的浓度优选为501.2μg/mL。在本发明的具体实施例中，优选别取所述木脂素对照品混合贮备液0.04、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度后摇匀，得到木脂素线性对照品混合液。

[0062] 得到各单一因素值后，本发明以所述四因素为自变量，以所述各单一因素值为中间值进行自变量取值，以木脂素提取率为响应值，进行响应面法优化，得到木脂素提取率对所述四因素的二次回归模型方程。

[0063] 在本发明中，所述二次回归模型方程优选采用Design Expert 8.05软件对所述自变量和响应值进行多元回归和二项式分析得到。在本发明中，所述二次回归模型方程优选为：

[0064] Y＝0.24+5.633×10‑3×A+0.016×B‑1.533×10‑3×C+0.013×D‑9.250×10‑3×A×B

[0065] ‑3.100×AC+8.300×10‑3×A×D‑2.375×10‑3×B×C‑0.021×B×D‑5.775×10‑3‑3 2 2 ‑3 2 2×C×D‑7.452×10 ×A‑0.022×B‑5.478×10 ×C‑0.014×D ，其中A为乙醇体积分数、B为溶媒用量、C为单次提取时间、D为提取次数，Y为木脂素提取率。

[0066] 得到所述二次回归模型方程后，本发明根据所述二次回归模型方程得到在所述四因素交互作用下的木脂素提取率最大值对应的溶媒用量、乙醇体积分数、提取次数和单次提取时间。

[0067] 在本发明中，所述四因素交互作用下的木脂素提取率最大值对应的溶媒用量优选为13～14，乙醇体积分数优选为90％，提取次数优选为2～3次，单次提取时间优选为36～37min。

[0068] 本发明提供了一种五味子藤茎木脂素的提取方法，包括以下步骤：

[0069] 将五味子藤茎与乙醇水溶液混合，进行提取，得到木脂素；

[0070] 所述乙醇水溶液中乙醇体积分数为90％；

[0071] 所述乙醇水溶液与五味子藤茎(干重)的质量比为13～14；

[0072] 所述提取的次数为2～3次，单次提取时间为36～37min。

[0073] 在本发明中，所述木脂素优选包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素中的一种或几种。

[0074] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0075] 以下实施例和对比例中，采用的仪器：LC‑20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，MSA6.6S‑CE型电子天平(德国赛多利斯公司)、BP211D型电子天平(德国赛多利斯公司)，KQ500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

[0076] 试剂：甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、甲醇(分析纯)、水为超纯水。

[0077] 对照品：五味子醇甲对照品购于中国食品药品检定研究院，批号110857‑201815，纯度99.7％；五味子醇乙对照品购于成都瑞芬思德生物科技有限公司，批号58546‑54‑5，纯度98.0％；五味子甲素对照品购于中国食品药品检定研究院，批号110764‑201915，纯度99.5％；五味子乙素对照品购于中国食品药品检定研究院，批号110765‑201813，纯度
99.1％。

[0078] HPLC色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agilent ZORBAX SB‑C18(4.6×250mm，5μm)，柱温为30℃，检测波长为220nm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，流动相流速为1.0mL/min，进样量为10μL，梯度洗脱程序如表1所示。

[0079] 实施例1

[0080] 对照品混合贮备液的制备：分别精密称取五味子醇甲对照品5.217mg、五味子醇乙5.049mg、五味子甲素5.143mg、五味子乙素5.012mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品混合贮备液。

[0081] 供试品溶液的制备：精密称五味子藤茎样品粉末(过三号筛，取筛下部分)1g，置于具塞锥形瓶中，加入15g 90v/v％乙醇水溶液提取3次，单次提取时间为60min，过滤，将所得提取液水浴蒸干后用乙醇溶解并定容于25mL容量瓶中。

[0082] 将对照品混合贮备液和供试品溶液分别进行HPLC检测，结果如图1～3所示。图1为阴性样品(即甲醇)的HPLC图。图2为对照品混合贮备液的HPLC图，其中，10.197min：五味子醇甲；13.405min：五味子醇乙；40.896min：五味子甲素；61.464min：五味子乙素。图3为供试品溶液的HPLC图，其中，10.198min：五味子醇甲；13.403min：五味子醇乙；40.996min：五味子甲素；61.604min：五味子乙素。由图1～3可知，各色谱峰分离较好。

[0083] 实施例2

[0084] 方法学验证与结果

[0085] 1、线性关系考察

[0086] 精密吸取实施例1制备的对照品混合贮备液0.04、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到线性对照品混合液。将线性对照品混合液分别进行HPLC检测，以峰面积积分值(y)为纵坐标，对照品质量浓度(x)为横坐标，进行线性回归，线性关系如表2和图4～7所示，其中，图4为五味子醇甲的线性关系图，图5为五味子醇乙的线性关系图，图6为五味子甲素的线性关系图，图7为五味子乙素的线性关系图。

[0087] 表2五味子醇甲线性关系

[0088]

[0089]

[0090] 由表2和图4～7可知，五味子醇甲的回归方程为y＝61163x+28542(r＝0.9999，n＝7)，线性范围为2.0805～208.0540μg/mL；五味子醇乙的回归方程为y＝59534x+20734(r＝
1.000，n＝7)，线性范围为1.9792～197.9208μg/mL；五味子甲素的回归方程为y＝64457x+
28848(r＝1.0000，n＝7)，线性范围为2.0469～204.6914μg/mL；五味子乙素的回归方程为y＝63780x+36496(r＝1.0000，n＝7)，线性范围为1.9868～198.6757μg/mL。

[0091] 2、精密度试验

[0092] 取线性范围内中浓度的对照品混合溶液S4进行HPLC检测，连续测定6次，测定其峰面积值，记为A1～A6，精密度考察结果如表3所示。

[0093] 表3精密度考察结果(n＝6)

[0094] 被测物 A1 A2 A3 A4 A5 A6 RSD/％五味子醇甲 1305684 1306194 1304626 1305532 1301468 1304660 0.13
五味子醇乙 1200903 1201950 1200268 1201277 1197900 1200350 0.12
五味子甲素 1348707 1349770 1348220 1348733 1347343 1348961 0.06
五味子乙素 1316766 1317370 1314255 1313987 1316478 1314482 0.11

[0095] 由表3可知，五味子醇甲的峰面积RSD＝0.13％(n＝6)；五味子醇乙的峰面积RSD＝0.12％(n＝6)；五味子甲素的峰面积RSD＝0.06％(n＝6)；五味子乙素的峰面积RSD＝
0.11％(n＝6)，表明仪器精密度良好。

[0096] 3、稳定性试验

[0097] 取实施例1配制的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12和24h，取样进行进行HPLC检测，稳定性考察结果如表4所示。

[0098] 表4溶液稳定性考察结果

[0099] 被测物 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 24h RSD/％五味子醇甲含量/wt％ 0.1028 0.1021 0.1022 0.1023 0.1024 0.1022 0.1026 0.1025 0.23五味子醇乙含量/wt％ 0.0712 0.0711 0.0711 0.0710 0.0713 0.0711 0.0708 0.0707 0.28五味子甲素含量/wt％ 0.0571 0.0572 0.0571 0.0572 0.0573 0.0573 0.0574 0.0574 0.19五味子乙素含量/wt％ 0.0415 0.0417 0.0417 0.0418 0.0420 0.0416 0.0420 0.0417 0.41[0100] 由表4可知，五味子醇甲含量的RSD＝0.23％(n＝6)，五味子醇乙含量的RSD＝
0.28％(n＝6)，五味子甲素含量的RSD＝0.19％(n＝6)，五味子乙素含量的RSD＝0.41％(n＝6)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

[0101] 4、重复性试验

[0102] 精密称取实施例1配制供试品溶液并进行HPLC测试，重复6次，重复性考察结果如表5所示。

[0103] 表5重复性考察

[0104] 被测物 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD/％五味子醇甲含量/wt％ 0.1023 0.1026 0.1007 0.1011 0.1013 0.1012 0.1015 0.74五味子醇乙含量/wt％ 0.0710 0.0710 0.0698 0.0700 0.0706 0.0699 0.0704 0.77五味子甲素含量/wt％ 0.0572 0.0573 0.0562 0.0564 0.0564 0.0563 0.0567 0.83五味子乙素含量/wt％ 0.0419 0.0418 0.0410 0.0411 0.0413 0.0411 0.0414 0.90[0105] 由表5可知，五味子藤茎样品中五味子醇甲含量的平均值分别为0.1015％，RSD＝
0.74％(n＝6)、五味子醇乙含量的平均值分别为0.0704％，RSD＝0.77％(n＝6)、五味子甲素含量的平均值分别为0.0567％，RSD＝0.83％(n＝6)，五味子乙素含量的平均值分别为
0.0414％，RSD＝0.90％(n＝6)，说明，重复性良好。

[0106] 5、加样回收率试验

[0107] 称取已知含量的供试品(五味子藤茎‑2)粉末6份，每份约1g，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度分别为五味子醇甲42.12μg/mL、五味子醇乙30.68μg/mL、五味子甲素20.34μg/mL、五味子乙素17.22μg/mL的混合对照品溶液25mL，按照实施例1中供试品溶液的制备方法制备，进行HPLC测定，计算回收率，结果如表6～9所示。

[0108] 表6五味子醇甲加样回收率测定结果

[0109]

[0110] 表7五味子醇乙加样回收率测定结果

[0111]

[0112] 表8五味子甲素加样回收率测定结果

[0113]

[0114]

[0115] 表9五味子乙素加样回收率测定结果

[0116]

[0117] 由表6～9可知，五味子醇甲平均回收率为99.26％，RSD＝0.33％(n＝6)；五味子醇乙平均回收率为99.21％，RSD＝0.76％(n＝6)；五味子甲素平均回收率为98.42％，RSD＝0.55％(n＝6)；五味子乙素平均回收率为98.40％，RSD＝0.22％(n＝6)，结果表明回收率良好。

[0118] 实施例3

[0119] 1、提取工艺研究方法

[0120] 本试验选取乙醇浓度、提取时间、提取次数和溶媒用量4个因素，以木脂素含量作为评价指标，采用Design Expert 8.05软件Box‑Behnken试验设计的4因素3水平方法设计试验方案，试验因素水平见表10。

[0121] 表10Box‑Behnken试验设计因素与水平表

[0122]

[0123] 2、结果

[0124] 2.1回归模型的建立及显著性检验

[0125] 2.1.1五味子藤茎提取工艺回归模型的建立

[0126] Box‑Behnken试验设计方案和4种木脂素的提取率数据见表11。

[0127] 表11响应面分析试验结果

[0128]

[0129]

[0130] 将表11中各组数据采用Design Expert 8.05软件进行多元回归和二项式分析，建立五味子藤茎中木脂素提取率对4个因素(A、B、C、D)的二次回归模型方程如下：

[0131] Y＝0.24+5.633×10‑3×A+0.016×B‑1.533×10‑3×C+0.013×D‑9.250×10‑3×A×B

[0132] ‑3.100×AC+8.300×10‑3×A×D‑2.375×10‑3×B×C‑0.021×B×D‑5.775×10‑3‑3 2 2 ‑3 2 2×C×D‑7.452×10 ×A‑0.022×B‑5.478×10 ×C‑0.014×D。

[0133] 图8为各交互因素对提取率影响的三维曲面及等高线，由图8可知，乙醇浓度、提取时间、提取次数和溶媒用量4个因素等高线为椭圆形，说明4个因素之间交互作用显著。

[0134] 2.1.2方程显著性分析

[0135] 对五味子藤茎中木脂素提取率与4个考察因素的模型进行方差分析，结果见表12。

[0136] 表12回归模型方差分析

[0137]

[0138]

[0139] 由表12方差分析可知，模型的F＝2.64(P＝0.0399)，表明试验结果误差较小，模型可以对数据进行分析；模型的失拟项F＝2.53(P＝0.333)，表明试验误差对模型没有显著性2
影响，方差分析结果显著分别是一次项B和D，相互项BD，二次项B。

[0140] 2.2最佳提取条件预测

[0141] 通过回归模型的分析，得到五味子藤茎中木脂素类成分最佳提取条件为：乙醇水溶液中乙醇的体积分数为90％，乙醇水溶液与五味子藤茎(干重)的质量比为13.56，提取次数为2.87次，单次提取时间为36.64min。考虑到实际生产需求，将最佳提取条件色设置：乙醇体积分数90％，乙醇水溶液与五味子藤茎(干重)的质量比为14倍，提取次数为3次，单次提取时间为37min。

[0142] 2.3验证提取条件

[0143] 将五味子藤茎样品粉末(过三号筛，取筛下部分)1g，置于具塞锥形瓶中，加入14g体积分数为90％的乙醇水溶液混合均匀，在室温条件下提取3次，单次提取时间为37min，过滤，将所得提取液水浴蒸干后用乙醇溶解并定容于25mL容量瓶中，进行HPLC检测，得到五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素4种木脂素的总提取率为0.2527％。

[0144] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。