[0001] 本发明属于中药提取物技术领域，具体涉及一种五味子中木脂素类化合物的提取方法。

[0002] 五味子，木兰科五味子属植物，由于生长地域不同可以分为北五味子和南五味子。北五味子呈不规则的球形或扁球形，直径5～8mm。五味子表面呈红色、紫红色或暗红色，果皮皱缩，显油润，果肉柔软，有的表面呈黑红色或出现“白霜”。南五味子颗粒较小，表面棕红色或暗棕色，果皮干瘪皱缩，果肉常紧贴在种子上。中医认为，五味子性酸温无毒，通常被应用于治疗老年病肺肾虚损造成的咳喘，消渴尿多，气虚自汗，阴虚盗汗等；对改善老年心血不足、心气虚、心肾不交之失眠心悸等均有良好作用。西医通常使用五味子或者五味子复方药，用于治疗慢性肝炎、镇咳、祛痰、体虚失眠、老年人延缓衰老等。这是由于木脂素类化合物具有广泛的生物活性，如保护中枢神经系统、保护肝脏肾脏、保护心血管、降低血糖血脂、清除体内自由基、消炎镇静、抗肿瘤、抗HIV等，并可用作植物萌发抑制剂、生长抑制剂和杀菌剂等。

[0003] 目前，五味子中木脂素类化合物的提取方法有很多，如药典方法(即超声提取法)、热回流提取法、微波提取法，其中，热回流提取法作为传统的萃取方法，经常被应用于工业化生产，然而该方法提取过程中使用大量的有机溶剂，且提取时间长、提取率相对较低。超声提取法和微波提取法作为近些年出现的新提取方法，具有操作简单、时间短、提取率高等优点，然而这两种方法却无法大量的处理样品，不适合工业化生产，且需要使用大量的有机溶剂。

[0031] 本发明提供一种五味子中木脂素类化合物的提取方法，该方法是在磁力搅拌辅助的超临界CO2萃取装置中实现的，所述的磁力搅拌辅助的超临界CO2萃取装置如图1所示，包括低温恒温槽3、增压泵4、集热式恒温磁力搅拌器5和萃取釜6，其中低温恒温槽3通过管路与增压泵4连接，集热式恒温磁力搅拌器5设置在增压泵4上，萃取釜6设置在集热式恒温磁力搅拌器5上，萃取釜6上方还设置压力表9，高纯空气装置通过第一管路分别于低温恒温槽3和增压泵4连接，第一管路上设有高纯空气阀门1，高纯二氧化碳装置通过第二管路与低温恒温槽3连接，第二管路上设有高纯二氧化碳阀门2；所述的增压泵4还通过第三管路与压力表9连接，第三管路上还设有萃取釜出口阀7和萃取釜进口阀8。

[0032] 所述的方法具体包括：

[0033] 步骤一：开启低温恒温槽3，设置温度为3-8℃，优选为5℃，当达到设定温度后，开启高纯空气阀门1和高纯CO2阀门2，通入高纯空气和CO2，使系统中充满气体，同时，称量五味子样品粉末于萃取釜6中，并加入无水乙醇，所述的无水乙醇的浓度40-100％，优选为100％，拧紧封口，随后将萃取釜放入集热式恒温磁力搅拌器5中预热，打开进口阀8和出口阀7，通入CO2，以排出萃取釜中的空气，然后关闭出口阀7，检查装置气密性，同时开启增压泵4和集热式恒温磁力搅拌器5，设定转速25-100r/min，优选为50r/min，待萃取釜中压力达到3-12MPa时，优选为9MPa，停止加压，在35-80℃下，优选为35℃，萃取15-180min，优选为
30min，萃取结束后，依次关闭集热式恒温磁力搅拌器5、高纯空气阀门1、高纯二氧化碳阀门
2以及萃取釜进口阀8，并手动旋转增压泵，开始释压，待萃取釜冷却至室温后，开启萃取釜出口阀，打开萃取釜，用乙醇冲洗萃取釜，得到固液混合物；所述的五味子样品粉末的质量(g)：无水乙醇的体积(mL)优选为1:2；

[0034] 步骤二：将步骤一得到的固液混合物转移到离心管中，离心，使五味子样品粉末沉积在离心管底部，弃去，取出全部上清液，备用；所述的离心转速优选为5000r/min，离心时间优选为5min；

[0035] 步骤三：将步骤二得到的上清液减压浓缩成浸膏，将浸膏经真空干燥、粉碎后形成粉末，得到五味子木脂素类化合物提取物；所述的真空干燥温度优选为60℃，干燥时间优选为48h。

[0036] 按照本发明，所述的五味子中木脂素类化合物提取物为五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酚、五味子甲素、安五脂素、五味子乙素和五味子丙素。

[0037] 将上述得到的五味子木脂素提取物用甲醇溶解后，过0.22μm滤膜，通过高效液相色谱测定五味子中木脂素类化合物的提取率，所采用的高效液相色谱条件为：流动相由色谱级甲醇(A)和水(B)组成，采用梯度洗脱方式：0～10min，68％(A)；10～15min，68％～80％(A)；15～40min，80％(A)；40～42min，80％～68％(A)；42～45min，68％(A)。流动相流速：0.5mL/min；进样体积：10μL；柱温：35℃；检测波长：254nm。

[0038] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实验所用原料具体来源为：

[0039] 甲醇(色谱纯)，购买于美国Fisher公司；乙醇(分析纯)，购买于中国北京化工厂；五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素，纯度均大于98％，购买于中国上海阿拉丁试剂公司，安五脂素、五味子酚、戈米辛D、五味子丙素，纯度均大于98％，购买于成都曼斯特试剂有限公司；高纯空气、高纯二氧化碳(纯度>0.99999)，购买于长春巨洋氮气有限公司。

[0040] 1100型液相色谱仪，配有光电二极管检测器，美国安捷伦公司；AcclaimTM120-C18色谱柱(250mm×4.6mmL.D.,5μm)，美国安捷伦公司；0.22μm尼龙过滤器，天津金腾仪器仪表有限公司；Milli-Q水净化系统，Millipore公司(Millipore Co.,USA)；KQ3200E超声波发生器(40KHz,150W)，昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA真空旋转蒸发仪，上海亚荣有限公司；Allegra 64R高速离心机，美国贝克曼库尔特公司；DF-101S集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；超临界萃取装置，美国Applied Separations公司；低温恒温槽，南京新辰生物科技有限公司。

[0041] 实施例1

[0042] 分别取五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酚、五味子甲素、安五脂素、五味子乙素、五味子丙素0.5mg于10mL棕色容量瓶中，加入色谱级甲醇定容至刻度，超声处理，使八种木脂素类化合物更好的溶解于甲醇中，溶解后的溶液在4℃冰箱中冷藏保存，备用。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。

[0043] 开启低温恒温槽3，设置温度为为5℃，当达到设定温度后，开启高纯空气阀门1和高纯CO2阀门2，通入高纯空气和CO2，使系统中充满气体，同时，称量5g五味子样品粉末于萃取釜6中，并加入10mL无水乙醇，所述的无水乙醇的浓度为100％，拧紧封口，随后将萃取釜放入集热式恒温磁力搅拌器5中预热，打开进口阀8和出口阀7，通入CO2，以排出萃取釜中的空气，然后关闭出口阀7，检查装置气密性，同时开启增压泵4和集热式恒温磁力搅拌器5，设定转速为50r/min，待萃取釜中压力达到9MPa，停止加压，在35℃下，萃取30min，萃取结束后，依次关闭集热式恒温磁力搅拌器5、高纯空气阀门1、高纯二氧化碳阀门2以及萃取釜进口阀8，并手动旋转增压泵，开始释压，待萃取釜冷却至室温后，开启萃取釜出口阀，打开萃取釜，用乙醇冲洗萃取釜，得到固液混合物；

[0044] 将得到的固液混合物转移到离心管中，在5000r/min下离心5min，使五味子粉末沉积在离心管底部，取全部上清液，减压浓缩成浸膏，浸膏在60℃下真空干燥48h，经粉碎后形成粉末，获得五味子木脂素提取物。

[0045] 准确称量0.1g提取物粉末，经甲醇溶解后定容至10mL容量瓶中，过0.22μm滤膜，得到待测溶液，进行高效液相色谱分析，得到五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酚、五味子甲素、安五脂素、五味子乙素和五味子丙素的提取率；所述的高效液相色谱条件为：流动相由色谱级甲醇(A)和水(B)组成，采用梯度洗脱方式：0～10min，68％(A)；10～15min，68％～80％(A)；15～40min，80％(A)；40～42min，80％～68％(A)；42～45min，68％(A)。流动相流速：0.5mL/min；进样体积：10μL；柱温：35℃；检测波长：254nm。得到的谱图如图3所示，其中图a为木脂素标准品溶液的谱图，图b为实施例1得到的样品提取物溶液的色谱图，图中，1.五味子醇甲；2.戈米辛D；3.五味子醇乙；4.五味子酚；5.五味子甲素；6.安五脂素；
7.五味子乙素；8.五味子丙素.

[0046] 实施例2

[0047] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，萃取釜中的提取压力分别为0、3、7.5和12MPa；实施例1和2不同提取压力下的对木脂素类化合物提取率的影响如图4所示。

[0048] 图4说明：在不通入CO2的情况下，目标物质的萃取率较低，但随着提取压力的升高，超临界CO2不断进入样品内部，大大提高了传质效率，当提取压力为9MPa时，目标分析物的提取率达到最大值。说明超临界CO2作为萃取溶剂，其用量大小将对目标物提取率产生至关重要的影响。

[0049] 实施例3

[0050] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，乙醇的浓度分别为40、60、80％，实施例1和3不同乙醇浓度下的对木脂素类化合物提取率的影响如图5所示。

[0051] 图5说明，乙醇的浓度越高，目标化合物的提取率越高。一方面，由于乙醇分子具有较大的极性，这大大增加了木脂素类化合物在超临界CO2中的溶解度；另一方面，乙醇作为一种有机溶剂，易与木脂素类化合物形成氢键，能显著提高萃取效率。因此，采用无水乙醇作为浸渍溶剂具有良好的效果。

[0052] 实施例4

[0053] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，乙醇的体积分别为0、5、15和20mL，实施例1和4不同乙醇体积下的对木脂素类化合物提取率的影响如图6所示。

[0054] 图6说明，当不使用乙醇浸渍样品而直接采用超临界CO2萃取样品时，木脂素类化合物的提取率仅为0.05～1.43mg/g，随着乙醇体积的不断增大，萃取率不断升高，这可能是因为目标分析物具有联苯环辛二烯母核结构，乙醇作为目标物和超临界CO2的混溶试剂，对超临界萃取效果具有极大的强化作用。当乙醇用量为10mL时，提取率达到最大值，约为0.13～4.45mg/g。当继续增加乙醇用量时，目标化合物的提取率略有下降。这可能是由于在提取过程中，由于乙醇用量的增加导致部分五味子样品黏附于萃取釜壁及顶盖上，无法与萃取溶剂接触，从而使提取率略有下降。因此，合适的样品质量与浸渍溶剂的比例有助于木脂素类化合物的提取。

[0055] 实施例5

[0056] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，集热式恒温磁力搅拌器5中设定的转速分别为0、25、100r/min，实施例1和5不同转速下的对木脂素类化合物提取率的影响如图7所示。

[0057] 图7说明，当不采用磁力搅拌时，目标分析物的提取率较低，总木脂素提取率不足5mg/g，随着转速的不断增加，提取率不断升高，当转速达到50r/min时，提取率达到最高，此时，总木脂素类化合物提取率约为11.8mg/g，继续增加转速时，提取率几乎不变。说明本发明通过磁力搅拌有助于样品与萃取溶剂和无水乙醇充分混合，增加萃取溶剂与样品之间的接触频率，从而提高传质速率和萃取效率。

[0058] 实施例6

[0059] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，提取温度设定分别为50、65和80℃，实施例1和6不同提取温度下的对木脂素类化合物提取率的影响如图8所示。

[0060] 图8说明，随温度的升高，目标分析物的提取率几乎不变。这可能是因为在相对较长的时间范围内，超临界萃取已经达到了平衡状态，从而使温度对提取率并未产生显著的影响。

[0061] 实施例7

[0062] 具体步骤和条件同实施例1，不同之处在于，提取时间设定分别为15、60、120和180min，实施例1和7不同提取时间下的对木脂素类化合物提取率的影响如图9所示。

[0063] 图9说明，随着提取时间的增加，提取率越来越高，当提取时间达到30min时，目标分析物的提取率不再显著增加，这说明超临界CO2萃取木脂素类化合物已经达到平衡状态。

[0064] 将实施例1提取的提取物进行性能分析，具体如下：

[0065] 提取率的计算公式见公式(1)，回收率的计算见公式(2)。萃取条件优化与方法学的数据均通过Excel表格进行统计分析，本方法精密度以相对标准偏差(RSD)表示。

[0066]

[0067] 其中C为提取物的浓度，V为提取物的总体积。

[0068]

[0069] 1、性能分析

[0070] 配制含有8种木脂素类化合物的一系列不同浓度的混合标准溶液，进行色谱分析，以目标分析物浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，通过Origin 8.0.6软件得出线性回归方程。实验结果如表1所示，各目标分析物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r>0.9998。检出限(LOD)和定量限(LOQ)是指信噪比分别为3和10时，仪器所能检出或准确定量的目标分析物的最低浓度。实验结果表明，八种目标分析物的LOD依次为41.0、52.9、63.4、27.3、21.3、990.2、45.40和49.9ng/mL，LOQ依次为122.3、160.2、186.2、
80.8、60.8、2992.8、135.4和145.8ng/mL。采用本研究所建立的分析检测方法1天内连续分析6次样品所获得提取率的相对标准偏差(RSD)为日内精密度，通过连续分析3天、每天分析
2次样品所获得提取率的相对标准偏差(RSD)为日间精密度，各目标分析物的日内和日间精密度分别低于5.85％和7.63％，这说明本研究方法的重现性是可以接受的。

[0071] 表1分析性能

[0072]

[0073] 2、回收率的测定

[0074] 为了研究本方法的准确度，本实验对加标样品的回收率进行了分析。实验结果如表2所示，各目标化合物回收率为75.00％～97.78％，其相对标准偏差(RSD)均低于5.36％，这表明本法具有满意的回收率和精密度，可用于中药中木脂素类化合物的提取与检测。

[0075] 表2化合物回收率

[0076]

[0077] 对比例1药典方法(即超声提取法)

[0078] 根据《中国药典》(2015年版)，取干燥后的五味子样品粉末约0.25g，精密称定，放入25mL容量瓶中，加甲醇约18mL，瓶口密封后，超声提取20min，取出，冷却至室温，并加甲醇至刻度，混合摇匀后过滤，取滤液2mL，过0.22μm滤膜，进行高效液相色谱分析。

[0079] 对比例2热回流提取法

[0080] 将0.5g五味子样品粉末和25mL 50％乙醇溶液加入到圆底烧瓶中，加热回流提取2h，然后取出全部固液混合物至50mL离心管中，在5000r/min下离心5min，弃去残渣，取全部上清液于50mL容量瓶中，并定容至刻度，准确量取溶液2mL，减压干燥，残渣用2mL甲醇回溶，所得溶液过0.22μm滤膜，进行高效液相色谱分析。

[0081] 对比例3微波提取法

[0082] 将0.5g五味子样品粉末和25mL 50％乙醇溶液加入到50mL离心管中，在420W条件下微波提取1min，将离心管取出并冷却至室温，在5000r/min下离心5min，取上清液定容至50mL，取溶液2mL，减压干燥，残渣用2mL甲醇回溶，所得溶液过0.22μm滤膜，进行高效液相色谱分析。

[0083] 将本发明实施例1、对比例1-3的几种方法进行比较，结果如表3所示，[0084] 表3

[0085]

[0086] a，标准偏差，n＝3。

[0087] 表3说明，热回流提取法作为传统的萃取方法，经常被应用于工业化生产，然而该方法提取过程中使用大量的有机溶剂，且提取时间长、提取率相对较低。超声提取法和微波提取法作为近些年出现的新提取方法，具有操作简单、时间短、提取率高等优点，然而这两种方法却无法大量的处理样品，不适合工业化生产，且需要使用大量的有机溶剂。与其它方法相比，本法所得提取率与药典方法相差不多，且略高于回流提取法和微波提取法。本法使用超临界CO2代替传统有机溶剂作为萃取剂，大大减少有机溶剂的用量，不仅样品处理量大，而且操作简单，提取时间短。